Карбогидраты

В исследовании полисахаридов возникает первый главный вопрос: из каких моносахаридов построен полисахарид? Для этого полисахарид расщепляется до моносахаридов разрывом всех гликозидных связей с помощью кислотного гидролиза. После гидролиза можно выделить образовавшиеся моносахариды, установить их строение, и, таким образом, узнать каков моносахаридный состав полисахарида. Конечно, знание моносахаридного состава не позволяет сделать никаких заключений о последовательности моносахаридных остатков в цепи, о регулярности или нерегулярности ее структуры, о наличии или отсутствии разветвлений – словом, ни об одной характеристике макромолекулы как целого. В этом смысле его можно уподобить данным элементного анализа низкомолекулярного вещества. Более того, моносахаридный состав полисахарида умалчивает даже о многих особенностях строения самых моносахаридных остатков в полисахаридной цепи. Допустим, что в наших руках уже есть моносахарид, и попробуем ответить на вопрос: как далеко мы можем продвинуться в изучении его структуры, используя только масс-спектрометрию?

Установление строения моносахарида требует решения двух задач. Прежде всего, надо выяснить массу углеродной цепи, а затем природу, число и расположение функциональных групп, а для метилированных сахаров, в частности, – число и положение метильных групп.

Решение первой задачи для моносахарида не представляет труда в силу малости его молекулярной массы. Масс-спектры интактных моносахаридов просты и отражают, как правило, образование ионов с каким-нибудь щелочным металлом. Три таких спектра ионов D-галактозы со щелочными металлами с Na, K и Rb представлены на рисунке 9.13. Из него отчетливо видно, что связывание уменьшается по мере роста молекулярного радиуса щелочного металла.

Рис. 9.13. Масс-спектр ионов D-галактозы со щелочными металлами. Спектры получены ESI-тандемной масс-спектрометрией. Фрагментация осуществлена в коллизионной ячейке. Масса D-галактозы составляет 180 Да

Решение второй задачи сильно затруднено тем, что молекулы моносахаридов содержат много полярных групп, а это самым неблагоприятным образом сказывается на их летучести. Выход из положения состоит в получении более летучих производных с помощью определенных химических реакций, переводящих полисахариды в ацетат полиолы. Их получают с помощью двух весьма простых в эксперименте реакций: восстановление моносахарида боргидридом натрия и последуюшего ацетилирования.

Рис. 9.14. Схема химических реакций, приводящая к получению ацетатов полиолов из исходной D-галактозы

Кратко опишем эти реакции на примере той же D-галактозы (рис. 9.14). Фрагментация ацетатов полиолов такого типа относительно проста. Она включает первичные ионы, образующиеся путем разрыва C–C связей углеродного скелета, а также отщеплением CH₃COO. Зная массу таких фрагментов и массу молекулярного иона, можно составить представление о структуре исходного полиола и, следовательно, моносахарида. Если в молекуле имеется дезоксизвено, как например в ацетате 28, образующееся из 2-дезокси-D-рибозы, то характерным оказывается разрыв цепи в β-положении. Зная эту закономерность, по величине m/z соответствующих фрагментов (в данном случае m/z=159) можно установить положение дезоксизвена.

К сожалению, такая простая схема страдает одной неопределенностью. Действительно, ацетат 29, образующийся из изомерной 4-дезоксирибозы 30, будет давать точно такой же фрагмент с m/z=159, только из нижней части молекулы. Поэтому, мы еще не вправе приписать структуру исходному сахару – это может быть либо 2-дезоксипентоза, либо 4-дезоксипентоза. Для ее устранения в молекулу искусственно вводится асимметрия. Для этого вместо боргидрида натрия на стадии восстановления применяют его изотопный аналог – тетрадейтерийборгидрид. Тогда у углеродного атома бывшей карбонильной группы, т.е. при С-1, появляется один атом дейтерия вместо одного атома протия. В результате ацетат полиола 31 из 2-дезокси-D-рибозы дает в масс-спектре тот же характеристический пик, но сдвинутый на единицу массы (разница масс дейтерия и протия), т.е. пик иона с m/z=160 вместо 159. А ион, возникающий путем аналогичной фрагментации из изомерного соединения 32, дейтерия не содержит и, следовательно, будет по-прежнему иметь m/z=159.

Олиго- и полисахариды

Как мы видим даже для моносахаридов применение метода масс-спектроскопии связано с большими сложностями. Для олиго- и полисахаридов эти сложности многократно возрастают. Главная трудность в структурной идентификации полисахаридов состоит в большом числе изомеров, возникающих как вследствие вариаций в позиции образования связи между остатками мономера, так и ввиду возможности образования множественных связей с одним остатком (ветвление). Например, для структурной идентификации прямой олигомерной цепи требуется знание последовательности и типов гликозидной связи. Все это в совокупности приводит к возникновению невообразимо огромного числа возможных изомеров даже у сравнительно простых олигосахаридов.

Более того, даже определение молекулярной массы полисахаридов становится нетривиальной задачей. Дело в том, что техника ионизации с помощью электрораспыления плохо подходит для исследования нативных полисахаридов по нескольким причинам. Во-первых, полидисперсность большинства полисахаридов приводит к очень сложным (перекрывающимся) MS-спектрам, поскольку при использовании этой техники каждое моновещество дает многозарядные пики. Во-вторых, эффективность ионизации полисахаридов методом электрораспыления очень низка.

а) б)

Рис. 9.15. а) Структура олигосахарида Man-8 и б) его MALDI спектр

Использование техники MALDI для ионизации полисахаридов до недавнего времени было затруднено отсутствием эффективных матриц. Используемая для этих целей стандартная матрица (2,5-дигидроксибензойная кислота, английская аббревиатура DHB) не позволяла достичь существенных успехов. Недавно было найдено, что использование матрицы 2’,4’,6’-тригидроксиацетофенон (английская аббревиатура THAP) позволяет существенно улучшить качество спектра. В качестве примера, приведем масс-спектр полисахарида C₅₃H₉₃NO₄₁, (аббревиатура Man-8) (рис. 9.16). Как видно из рисунка масс спектр состоит из одиночной тонкой линии, соответствующей молекулярной массе 1400.3 Дa, что свидетельствует о присоединении атома натрия. Показано, что использование THAP в качестве матрицы позволяет определять молекулярную массу полисахаридов вплоть до 50 кДа.

Что касается структурных исследований олиго- и полисахаридов, то для них разработаны изощренные схемы ионизации, включая многие химические реакции, такие как, например, перметилирование, а для исследования их масс-спектров приходится использовать тандемные масс-спектрометры с порядком свыше двух. Получаемые при этом спектры носят очень сложный характер и в этой лекции не рассматриваются.