Выделение и очистка препаратов протеиназы.
Современный уровень науки и техники позволяет получить не только комплексные, но и гомогенные, кристаллические ферменты. Их, как правило, выделяют непосредственно из биомассы гриба или культуральной жидкости, а так же из экстрактов поверхностных культур. В качестве осадителей при получении комплекса препаратов протеиназ применяют сульфат аммония 14, 17 , этанол 17 , ацетон, изопропанол 24 . Отмечается, что в зависимости от применяемого осадителя выход фермента бывает различным.
Так при использовании различных органических растворителей в концентрации 80 , выход протеолитических ферментов составил 56 - для этанола, 78 - изопропанола, 65 - ацетона. Вместе с тем, сочетание различных осадителей приводит к более полному отделению от сопутствующих веществ.
К. А. Калунянц с соавторами 13 для очистки препарата реннинопузилин П10х воспользовались осаждением сульфатом аммония. Полученный осадок растворяли в воде, фракционировали этиловым спиртом. При этом авторам удалось отделить значительную часть сопутствующих белков. Таким способом получают комплексные ферментные препараты. Их можно применять в народном хозяйстве, не проводя дальнейших этапов очистки. Более полная очистка возможна с помощью таких методов разделения как гельфильтрации на сефадексе, хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе, КМ-сефадексе, КМ-целлюлозе, ДЭАЭ-целлюлозе.
Например, протеиназа Torula thermofila была выделена и очищена в 11 раз в результате диализа препарата, полученного осаждением сульфатом аммония, с последующей гельфильтрацией на сефадексе У-100. Для разделения коллагеназы и нейтральной протеиназы Achromobacter iophagus препарат, полученный осаждением сульфатом аммония, подвергли диализу, а так же хроматографии на ДЕ-32 целлюлозе. Наиболее изученные протеолитические ферменты, продуцируемые Bac. Subtilis, получены в кристаллическом состоянии.
Схема очистки этих препаратов включает высаливание сульфатом аммония 75 насыщения с последующим диализом против ацетатного буфера. Затем двух кратное осаждение 67 ацетоном и диализ против трисбуфера с последующей хроматографией на ДЕАЕ-сефадексе А-50 30 . При разделении нейтральной и щелочной протеиназ Asp. Oryzae ОИТ-5038 использовали осаждение сульфатом аммония 80 насыщения, с последующей хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе и сефадексе У-100. Для отделения баластных белков и пигментов от протеиназы Asp. Terricola Войнарским разработан метод очистки на биогеле Р-10. В результате активность протеиназы возросла в 30 раз, а содержание пигментов уменьшилось в 100 раз. В результате ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе был получен препарат нейтральной протеиназы Streptomyces acidoresistous 1403 с десятикратной степенью очистки.
Наиболее эффективным методом выделения и очистки ферментов является афинная хроматография.
Метод основан на использовании взаимодействий, аналогичных взаимодействию фермента с субстратом. Как правило, ферменты, полученные с помощью афинной хроматографии, являются гомогенными или смесью изоферментов. Это подтверждается данными электрофокусирования, электрофореза в полиакриламидном геле, определением аминокислотной последовательности 20 . В настоящее время достаточно широко применяется для очистки метод ультрафильтрации растворов ферментов.
Преимуществом ультрафильтрации являются отсутствие тепловой инактивации и небольшие энергозатраты. Ультрафильтрация позволяет провести концентрирование раствора без фазового превращения при комнатной температуре, при одновременном освобождении от баластных веществ пигментов, низкомолекулярных соединений. Например, Рожанская с соавторами 27 с успехом использовали метод ультрафильтрации при очистке протеиназ из Asp. terricola и Streptomyces sp. Приведённые литературные данные, касающиеся вопросов выделения и очистки протеолитических ферментов, свидетельствуют о том, что сочетание различных методов позволяет получить гомогенные ферментные препараты из культур микроорганизмов.
Применение того или иного из них зависит от индивидуальных свойств фермента, конечной цели при его применении, физико-химических факторов. Анализируя литературные данные, мы пришли к выводу, что молекулярная масса нейтральных протеиназ находится в интервале 20000 - 50000. Все они имеют довольно высокий температурный оптимум, лежащий в интервале 40 - 60oС, оптимальное значение рН 7,0 - 8,0, диапазон стабильности характеризуется значениями рН 5,0 - 10,0. Так нейтральная протеиназа Bac. Subtilis имеет оптимум рН 7,0 и температурный оптимум 52oС. Протеолитические ферменты Bac. Subtilis, выделенные А.А. Глемжай и сотрудниками, имеют несколько оптимумов рН от 6,5 до 10,5 . Молекулярная масса нейтральной протеиназы 38000 - 45000, щелочной - 27000 - 29000. Препараты протеиназ Pseudomonas aeruginosa 700 75 имеют рН оптимум от 7,5 до 10,0. Протеиназы различных фракций обладали различными рН оптимумами.
Фермент с молекулярной массой 28000 имеет оптимум рН 10,5. Уменьшение молекулярной массы коррелировало со снижением оптимума рН. Так, протеиназа с молекулярным весом 20000 характеризуется рН оптимумом 7,0. Известны термостабильные препараты протеиназ.
Для термостабильного фермента, выделенного из Thermoactinomyces thalpophilus максимальная активность обнаружена при рН 6,0 и сохранялась до 70 при изменении рН от 5,0 до 8,0. Оптимальная температура равна 70oС, но через 30 минут выдерживания при 70oС сохраняется лишь 62 активности 32 . Другая термостабильная нейтральная протеиназа - прототерпин имеет оптимум температуры 79oC, за 60 часов инкубации при 60oС потеря активности не превышает 15 . Итак, рН оптимум для нейтральных протеиназ варьирует от 6,0 до 8,0, температурный оптимум 40 - 60oС, однако термостабильность ферментов может варьировать в широком диапазоне. 1.4