Исследование некоторых физико-химических свойств протеиназы Penicillium wortmannii

СОДЕРЖАНИЕ Введение. 3 Глава 1. Обзор литературы. 1.1 Протеиназы микробного происхождения. 1.2 Ферменты, их физико-химические свойства. 1.3 Выделение и очистка препаратов протеиназы. 1.4 Расщепление коллагенсодержащего сырья и его применение. 17 Глава 2. Материалы и методы исследования. 27 2.1 Определение рН. 2.2 Определение протеолитической активности. 2.3 Определение коллагеназной активности. 2.4 Определение молекулярной массы. 2.5 Определение содержания аминного азота. 2.6 Электрофоретические исследования. 6.1 Определение гомогенности очищенных препаратов 29 2.6.2 Идентификация протеиназ в ПААГ. 30 Глава 3. Получение препаратов протеиназы Penicillium wortmannii 2091 и исследование их физико-химических свойств. 3.1 Разработка условий выделения препарата Penicillium wortmannii BKMF 3.2 Фракционирование протеолитического комплексного препарата ферментов. 3.3 Влияние температуры и рН на активность фермента. 3.4 Определение молекулярной массы. 3.5 Исследование процессов кислотной и термической инактивации. 3.6 Влияние ионов металлов и ингибиторов на активный центр фермента. 3.7 Субстратная специфичность. 3.8 Гидролиз коллагенсодержащего сырья ноги птиц, шквара. 47 Глава 4. Методическая часть. 4.1 Межпредметность - современный принцип обучения. 4.2 Межпредметные связи на уроках химии. 61 4.3 Методические рекомендации по реализации принципов межпредметных связей при изучении тем, связанных с понятием ферментные препараты . 63 Выводы. 70 Список литературы. 71 ВВЕДЕНИЕ. Важнейшим свойством ряда белков является их каталитическая активность.

Вещества белковой природы, способные каталитически ускорять химические реакции, называют ферментами.

Роль ферментов в жизнедеятельности животных, растений и микроорганизмов колоссальна. В настоящее время в биологических объектах обнаружено несколько тысяч индивидуальных ферментов, а несколько сотен из них выделено и изучено.

Биологические катализаторы по ряду признаков резко отличаются от неорганических катализаторов.

Будучи белками, ферменты обладают всеми их свойствами.

Сюда относятся термолабильность ферментов, зависимость их действия от значения рН среды, специфичность, подверженность влиянию активаторов и ингибиторов. Термолабильность ферментов объясняется тем, что температура, с одной стороны, воздействует на белковую часть фермента, приводя при слишком высоком значении к денатурации белка и снижению каталитической функции, а с другой стороны, оказывает влияние на скорость реакции образования фермент-субстратного комплекса и на все последующие этапы преобразования субстрат.

Кроме того, для каждого фермента существует оптимальное значение рН среды, при котором он проявляет максимальную активность. Большинство ферментов имеет максимальную активность в зоне рН поблизости от нейтральной точки. Специфичность - одно из наиболее выдающихся свойств ферментов. Данное свойство ферментов объясняется в первую очередь совпадением пространственных конфигураций субстрата и субстратного центра фермента.

Ферменты могут обладать абсолютной, относительной, стереохимической специфичностью. Влияние на ферменты активаторов и ингибиторов впервые было изучено А.Я.Данилевским. Ингибиторы тормозят действие ферментов. Механизм ингибирующего действия сводится к двум типам торможения необратимое и обратимое. Обратимое ингибирование действия ферментов может быть конкурентным и неконкурентным. Будучи выделены из организма, ферменты не утрачивают способности осуществлять каталитическую функцию, на чем основано их применение в различных областях промышленности. В хлебопекарной промышленности применяют ферментные препараты, относящиеся к роду Aspergillus.

В пивоваренной и спиртовой промышленности применяют амилазы - ферменты, ускоряющие реакцию осахаривания крахмала. В кожевенном и меховом производстве применяют препараты протеиназ. Ферменты находят большое применение в медицине. Пепсин, трипсин, химотрипсин, липазу и амилазу применяют для лечения заболеваний ЖКТ. Протеолитические ферменты - плазмин и активирующие его стрептокиназу и урокиназу - для растворения тромбов в кровеносных сосудах.

Кроме того, специфическую область применения ферментов в медицине составляет энзимодиагностика заболевание может быть тестировано по уровню содержания фермента или соотношения его множественных форм в крови или реже в моче. ГЛАВА 1.

Обзор литературы

Обзор литературы 1.1

Протеиназы микробного происхождения

Однако промышленный выпуск протеиназ из актиномицетов развит слабо. Из... 1.2 Ферменты, их физико-химические свойства. Протеиназы, включающие фе... В 1964 году была получена в высокоочищенном состоянии нейтральная прот... Таким образом, ферменты активны только в определённом интервале рН. Современная классификация основана на этом признаке.

Выделение и очистка препаратов протеиназы

А. При этом авторам удалось отделить значительную часть сопутствующих бел... Terricola Войнарским разработан метод очистки на биогеле Р-10. Анализируя литературные данные, мы пришли к выводу, что молекулярная м... Другая термостабильная нейтральная протеиназа - прототерпин имеет опти...

Расщепление коллагенсодержащего сырья и его применение

Невельниченко 1989 предложил способ созревания мясного сырья, предвари... Среди них выделяются виды, эффективно гидролизующие белки типа коллаге... Одним из направлений в проведении ферментативных обработок является пр... Из-за ряда существенных преимуществ, предпочтение отдаётся микробным п... megaterium, R.

Материалы и методы исследования

2.2 Метод определения протеолитической активности. Протеолитическую ак... Через 30 минут измеряли оптическую плотность раствора на ФЭКе КФК-2 пр... После проведения гидролиза в течение 10 минут в опытную пробирку прили... Выдерживали ещё 20 минут при температуре 30oС. 2.3 .

Определение коллагеназной активности

С этой целью готовили реактив для окисления 28,2 г хлорамина Т раствор... Пробу нагревали 15 минут в водяной бане при 150оС и после охлаждения ф... Гидролиз коллагена вели в следующих условиях 20 мг нативного коллагена... Смесь инкубировали в течение 1 часа при 37oС. 2.4 Определение молекулярной массы фермента. Молекулярную массу опреде...

Определение содержания аминного азота

Содержание аминного азота рассчитывали по калибровочной кривой, постро... 2.6 . Определение содержания аминного азота. Метод основан на образовании цв... Затем центрифугировали и измеряли оптическую плотность на ФЗКе КФК-2 п... В контроле вместо 4см3 пробы присутствовало 4см3 дистилированной воды.

Электрофоретические исследования

Электрофоретические исследования . 2.6.1

Определение гомогенности очищенных препаратов

Окрашивание проводили раствором амидочерного с массовой долей 0,5, при... 2.6.2 . В верхний резервуар прибора вносили 1 см3 0,001 раствора бромфенолсине... Определение гомогенности очищенных препаратов. Электрофорез проводили ... Окрашивание проводили 20 - 30 минут.

Идентификация протеиназ в ПААГ

Все опыты, описанные в работе, проводили 3 -4 раза, аналитические опре... Если в гелях присутствовала протеиназа, то появлялись белые полосы. Идентификация протеиназ в ПААГ. . ГЛАВА 3.

Получение препаратов протеиназы Penicillium wortmannii

Получение препаратов протеиназы Penicillium wortmannii 2091 И ИССЛЕДОВАНИЕ ИХ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ. Известно, что микроорганизмы синтезируют богатые набором ферментов комплексы. Поэтому важным этапом в получении препаратов направленного действия является изучение условий их выделения, очистки от сопутствующих биологически активных и баластных веществ.

В связи с малой изученностью представителей грибов Penicillium этот этап представляет особую важность. 3.1

Разработка условий выделения препарата Penicillium wortmannii BKMF

Разработка условий выделения препарата Penicillium wortmannii BKMF. Органические растворители и сульфат аммония добавляли к охлажденной до... Wortmannii 2091 при различных значениях рН и постоянном перемешивании.... Результаты исследования влияния рН на полноту осаждения протеолитическ... 1, концентрация органических растворителей значительно влияет как на в...

Фракционирование протеолитического комплексного препарата ферментов

3.3 . При гидролизе гемоглобина в ПААГ обнаружены две протеолитические фракц... Таким образом, используя методы дискового электофореза было установлен... Электорофорез вели с учётом нейтральнойприроды протеолитического компл... В дальнейшем представляло интерес изучить его компонентный состав и ид...

Влияние температуры и рН на активность фермента

Нами была поставлена цель определить рН и температурные оптимумы дейст... Нужное значение рН субстрата поддерживали с помощью 0,1М универсальног... Ферментативную активность определяли стандартным методом 12 . Температурный оптимум действия ферментов определяли в интервале темпер... На рис.3 показано влияние температуры на активность ферментов. Для про...

Исследование процессов кислотной и термической инактивации

Во всех случаях ПА КлА-const, это свидетельствует о том, что мы имеем ... Термическую инактивацию протеиназ изучали в интервале температур 30 - ... Протеиназа 1 в области высокой рН-стабильности инактивируется почти по... Данные свидетельствуют о высокой термостабильности протеиназы 1. Различия в значениях при рН 5,0 и 11,0 и при рН 7,0 - 10,0 на целый по...

Влияние ионов металлов и ингибиторов на активный центр фермента

Как показали результаты опытов, протеиназа 1 полностью инактивировалас... В связи с этим мы исследовали специфичность действия протеиназы на жив... Менее всего гидролизу подвергается кератин 22 - 25 рис.5 . Однако использование шквары ограничивалось из-за большого содержания с... Пробы отбирали каждый час с момента внесения фермента.

Методическая часть

Методическая часть . 4.1

Межпредметность - современный принцип обучения

Совершенствование содержания образования в школе опирается на комплекс... по составу научных знаний фактологические, понятийные, теоретические 2. 4.2 . 2. 6.

Межпредметные связи на уроках химии

В ходе проведения опыта обсуждают ускоряющую роль катализатора в этой ... -Как обычно биологи называют эти вещества? Остановимся на самой главно... 1. Задача Известно, что для взрослого человека необходимо 1,5 г белка на ... Чем отличается третичная структура от первичной и вторичной? 7.

Список литературы

Список литературы 1. Антипова Л.В Глотова И.А Кочергина Н.И. Микробные ферментные препараты для обработки вторичного сырья мясной промышленности.

Конференция Биосинтез ферментов микроорганизмами Тез. докл Москва, 26 - 27 октября 1993г - Москва, 1993 С.33. 2. Антипова Л.В Глотова И.А Кочергина Н.И Чурсин В.И Макарова Е.Г. Разработка и использование специальных микробных препаратов для обработки кожевенного сырья.

Кожевенно-обувная промышленность 1994 5 - 8 С.25 - 27. 3. Антипова Л.В Кочергина Н.И. Специальные микробные препараты ферментов в рациональном использовании вторичного мясного сырья.

Всесоюз. науч техн. конф. Совершенствование технологических процессов производства новых видов пищевых продуктов и добавок.

Использование вторичного сырья пищевых ресурсов Киев, 1991 Ч.1 С.222. 4. Антипова Л.В Насонова Л.В. Исследование возможности получения белкового концентрата из кератинсодержащего сырья методом микробной ферментации.

Тез. докл. 2 науч практ. конф. Разработка и внедрение безотходных технологий, использование вторичных ресурсов , Киров, 30 - 31 мая 1989г Киров, 1989 С.80 - 81. 5. Антипова Л.В Глотова И.А. Основы рационального использования вторичного коллагенсодержащего сырья мясной промышленности Воронеж 1997 С.246. 6. Василевская И.А. Актиномицеты - продуценты биологически активных веществ Киев Высшая школа 1979 С.43. 7. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов М. Агропромиздат 1987 С.391. 8. Детерман Г. Гель-хроматография М. Мир 1970 С.352. 9. Зверев И.Д Максимова В.Н. Межпредметные связи в современной школе М. Педагогика 1981 С.96. 10. Иванов К.А Шанушкова Л.П Нарыжная Т.В. Использование шквары для пищевых целей.

Мясная индустрия СССР 1982 11 С.11 - 15. 11. Извекова Г.И. Протеолитические свойства гриба Em. glabra. Микробиология 1985 т.54 С.62 - 65. 12. Каверзиева Е.Д. Стандартный метод определения протеолитической активности для комплексных препаратов протеиназ.

Приклад. биохимия и микробиология 1971 т.7. 2 С.225 - 228. 13. Калунянц К.А Дорохов В.В Лосякова Л.С Величко Б.А. Направленный биосинтез ферментов микроорганизмами. Труды ВНИИсинтезбелок. М. 1974 В.2 С.220. 14. Караваева Н.Н Садыкходжаева Н.Г. Получение высокоустойчивого препарата протеолитических ферментов гриба Torula thermophila шт. Уз. ПТ при культивировании в ферментере. Приклад. биохимия и микробиология 1985 Т.XXI 1 С.24 - 27. 15. Колычева З.И. Химия и питание.

Химия в школе 1997 4 С.86 - 88. 16. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии М. Высшая школа 1980 С.272. 17. Крестьянова И.Н Васильева Л.И Бартошевич Ю.Э Ахпаров В.Л Нахапетян Л.А. Изоэлектрическое фокусирование препарата протеолитических ферментов из Streptomyces 771. Приклад. биохимия и микробиология 1983 Т.XIX 2 С.217 - 225. 18. Крылова Н.В. Интеграция как важная составляющая учебного процесса. Химия в школе 1997 1 С.21 - 26. 19. Кулагин П.Г. Межпредметные связи в процессе обучения М. Просвещение 1981 С.96. 20. Кавренова Г.И Руденская Т.Н. Афинная хроматография протеиназ.

Химия протеолитических ферментов. Материалы 2 Всесоюзного симпозиума по химии протеолитических ферментов Углич 1979 С.134. 21. Максимова В.Н. Межпредметные связи в учебно-воспитательном процессе в современной школе М. Просвещение 1987 С.160. 22. Межпредметные связи в учебном процессе М. Просвещение 1974 С. 23. Назаренко В.М. Что нужно знать о продуктах, которые мы употребляем в пищу. Химия в школе 1997 5 С.16 - 25. 24. Насонова Л.В. Биотехнология получения протеиназы актиномицета Streptomyces chromogtnis.

Афтореф. дисс. канд. техн. наук Воронеж 1988 С.24. 25. Осуществление межпредметных связей в процессе обучения Владимир 1984 С.136. 26. Расулундзатуву М.З. Биосинтез и исследование протеолитического комплекса Streptomyces fulvoviricus ВКМАс - 161. Автор. дисс. канд. техн. наук Воронеж 1989 С.21. 27. Рожанская Т.И Морголина Н.А Андреева Т.В. Использование ультрафильтрации в процессах очистки протеолитических ферментов. Материалы 2 Всесоюзного симпозиума по химии протеолитических ферментов Углич 1979 С.134. 28. Фрашель Б Шишкова Э.А. Свойства протеолитических ферментов, содержащихся в культуральной жидкости Actinomyces rimous.

Приклад. биохимия и микробиология 1968 6 С.627 - 631. 29. Шаталов М.А. Межпредметные связи в формировании системных знаний. Химия в школе 1997 5 С.26 - 29. 30. Aussein M Magdel- Din, Abdel-Gawald E.M. Protease and amylase activities of Asp. flawis grown on hudrocarbons and oxygenated hydrocarbous Biotechnol.

And Bioeng 1983 v.25 Nr.12 p.3197 - 3199. 31. Knud Aunstrup - Proteinases Novo Research Institute, Bagsvaerd, Denmark 1979 p.114. 32. Odibo F.I Obi S. K. Purification and some properties of a thermostable protease of Jherm. Thal j. Appl. Microbiol. And Biothehnol 1988 v.3 p.327 -332.