Определение аминокислот спектрофотометрическим методом

Определение аминокислот спектрофотометрическим методом. Аминокислоты, первичные амины, полипептиды и пептоны при нагревании с нингидрином образуют синие или сине – фиолетовые продукты.

Реакция протекает сложно с окислением, восстановлением, декарбоксилированием, дезаминированием: Окраска и выход продукта зависят от свойств аминокислоты (табл. 1.1). При добавлении CdCl2 образуется комплекс кадмия с фиолетовым Рузмана λmax=530 нм. 0,2 – 3 %-ный раствор нингидрина готовят в разных растворителях (изобутаноле, ледяной уксусной кослоте, метилцеллозольве, воде). Приведем несколбко методик.

Таблица 1.1 λmax и диапазон определяемых концентраций аминокислот по реакции с нингидрином Аминокислота λmax, нм Определяемые концентрации, мкг/мл Аланин 550 0,1 – 0,8 Аргинин 560 0,2 – 1,0 Аспарагин 550 0,2 – 1,8 Валин 560 0,1 – 1,0 Глицин 555 0,1 – 0,8 Изолейцин 565 0,2 – 1,2 Лейцин 555 0,1 – 1,0 Лизин 545 0,05 – 0,5 Метионин 560 0,1 – 1,0 Норвалин 560 0,1 – 1,0 Треонин 550 0,2 – 1,3 Триптофан 550 0,2 – 2,0 Фенилаланин 550 0,1 – 1,4 Методика 1 Пробу аминокислоты 1,0 мл (содержащую примерно 5 мкг/мл) в 80 %- ном этаноле смешивают с 2мл 0,2 % - ного нингидрина в изобутаноле в мерной колбе емкостью 10,00 мл. Доводят объем растворителя до метки изобутанолом, перемешивают, нагревают на водяной бане при 80ºС в течение трех минут, охлаждают до комнатной температуры. Измеряют поглощение Ах при λmax (см. табл.1.1). Процедуру повторяют со стандартным раствором аминокислоты измеряют Аст. Из отношения Ах: Аст оптических плотностей находят концентрацию аминокислоты в исследуемом растворе.

С учетом разбавления раствора вычисляют содержание ее в пробе.

Методика 2 К 1,0 мл раствора пробы прибавляют 1 мл ледяной уксусной кислоты и 1 мл 2,5 % - ного раствора нингидрина. (Раствор нингидрина готовят растворением 0,25 г в смеси 4 мл фосфорной кислоты (1:1) и 6 мл ледяной уксусной кислоты при 70ºС). Нагревают при 100ºС в течение 1 ч. После охлаждения разбавляют CH3COOH лед. В мерной колбе емкостью 10,0 мл, через 1 ч измеряют поглощение Ах при соответствующем λmax: лизин – 530 нм, оксилизин – 450 нм, орнитин и пролин – 515 нм, цистеин – 570 нм. Аналогичные процедуры производят с 1,0 мл стандартной аминокислоты. Сравнивают оптические плотности Ах и Аст. Методика 3 Смешивают 1 мл раствора пробы с 0,5 мл буферного раствора рH=5,3 – 5,4 и 0.5 мл 3 % - ного раствора нингидрина в целлозольве.

Нагревают 15 мин при 100ºС. Добавляют 5 мл 50 % - ного изопропанола, взбалтывают.

Охлаждают до комнатной температуры, разбавляют в мерной колбе емкостью 10,0 мл тем же изопропанолом, перемешивают, измеряют оптическую плотность при λmax согласно табл.1.1 Методика 4 Гидролизуют 1,0 г исследуемого белка кипячением с 1 мл 4М HCl в течение 15 ч ( с обратным холодильником), выпаривают досуха.

Сухой остаток обрабатывают одновременно 4 мл 3 % - ного раствора трихлоруксусной кислоты и 1 мл 10 % - ного раствора фосфорномолибденовой кислоты для удаления пептонов, фильтруют. Отбирают 0,5 мл фильтрата в стаканчик, добавляют 0,5 мл 2 % - ного водного раствора нингидрина, нагревают 10 мин при 100 ºС. После охлаждения разбавляют до 50 мл водой, переносят в делительную воронку с 10,0 мл изобутанола, встряхивают в течение 3 - х минут.

Отделяют верхний слой, измеряют поглощение Ах при 533 нм. 0,5 мл стандартного раствора аминокислоты смешивают с 0,5 мл раствора нингидрина, нагревают и т.д. Измеряют поглощение Аст при той же длине волны.

Сравнивают оптические плотногсти Ах : Аст.[7] 4. Обзор реферативных журналов 08.03-19Р1.157. Применение экстракции в точке помутнения к казеиновым белкам коровьего молока и их идентификация при помощи масс-спектрометрии.

Cloud point extraction applied to casein proteins of cow milk and their identification by mass spectrometry. Lopes Aline Soriano, Garcia Jerusa Simone, Catharino Rodrigo Ramos, Santos Leonardo Silva, Eberlin Marcos Nogueira, Arruda Marco Aurelio Zezzi. Anal. chim. acta. 2007. 590, №2, с 166-172. Англ. Разработана улучшенная методика определения трех казеиновых белков в коровьем молоке. Методика включает выделение белков из пробы (50 мкл) путем экстракции в точке помутнения при рН 7,0 с использованием Тритона Х-114 и NaCl в качестве поверхностно-активного вещества и электролита соответственно и последующее детектирование белков методом времяпролетной масс-спектрометрии с ионизацией путем лазерной десорбөии из матрицы. 04.22-19Р1.19. Одновременное определение аминокислот в пищевых продуктах методом капиллярного электрофореза при косвенном детектировании в уф-лучах.

Chen Bing, Li Xiaoge, He Ping, Xiang Xiaolan (Nanjing University of Technology, Nanjing 210009, China) Sepu=Chin. J. Chromatogr. 2004 22, №1, с 74-76 Библ. о Кит, рез. англ Разработана методика определения L-орнитина, L- пролина и L-глютамина в пищевых продуктах.

Разделение методом капилярного электрофореза в буферном растворе, содержащем 5 мМ/л натриевой соли р-аминобензолсульфоновой кислоты и 10 мМ/л KH2PO4 (рН 11,5) с УФ-детектированием при 254 нм при напряжении 12 кВ. Полное разделение 3 аминокислот происходило за 11 мин. Среднеквадратическое отклонение для времени выхода составляло 0,72%, а для высоты пика 2,0% ПрО для определения L-орнитина, L-пролина и L-глютамина составлял 6,78, 8,71 и 7,86 мг/л, соответственно.

Предложенный метод успешно использован для исследования различных пищевых продуктов со средним выходом 96,8-104%. В. М. Гильзин 08.06-19Р1.162 Методы исследования молочных и молокосодержащих продуктов. Юрова Е.А. Молоч. дело. 2006, №8, с. 34-36. Рус. Применяемые в настоящее время в молочной промышленности методы анализа разделяют на используемые в научных целях и не всегда воспроизводимые в условиях заводской лаборатории и методов контроля применения для производственного контроля, которые не позволяют производить идентификацию продукции и тем самым качественно осуществлять входной контроль. Методы анализа используют для изучения химического состава сырья, полуфабрикатов и готовой продукции, их физико-химических, биологических и технологических возможностей с целью выявления возможных фальсификаций и создания оптималь­ных технологических процессов для переработки сырья в целях получения готовой продукции высокого качества.

В настоящее время для продуктов сложного сырьевого состава (растительно-молочных, молочно-растительных и т. д.) необходимо выделить методы пробоподготовки, т. е. методы, применяемые для разделения и выделения отдельных компонентов, т. к. для проведения количественного определения нормируемых показателей без освобождения от влияющих компонентов невозможно.

В основе экстракционного метода для определения массовой доли жира лежит методика, основанная на экстрагировании жира эфирами после обработки исследуемого образца раствором соляной кислоты.

К. В. Беляев 09.08-19Г.162. Специфическое определение селеноаминокислот в цельном использованием эксклюзионной ион-парной обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии – масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой. (HPLC-ICP MS). Specific determination от selenoammoaads in whole milk by 2D size-exclusion-ion-paring reversed phase high-performance liquid chromatography — inductively coupled plasma mass spectrometry (HPLC — ICP MS). Bierla Katarzyna, Szpunar Joanna, Lobinski Ryszard.

Anal. chim. acta. 2008. 624, Ns2, с 195-202. Англ. Методика разработана для определения селенометионина и селеноцистеина в цельном молоке. Она основана на удалении протеинов, карбамидометилировании остатков аминокислот с помощью иодацетамида и протеолизе с помощью Protease XIV. Селеноаминокислоты определяли методом HPLC-ICP MS после выделения из постколоночной смеси эксклюзионной жидкостной хроматографией. В данных селеноаминокислотах Se(IV) хорошо дериватизируется и определяется совместно.

Правильность проверена использованием изотопов. Все три компонента количественно определены методом стандартных добавок. Методика применена для мониторингаформ селена, в том числе при определении селенсодержащих дрожжей, добавленных при переработке молока.

Список использованной литературы 1.Балаховский И.С. Определение суммарного количества аминокислот в молоке и других кисломолочных продуктах / И.С. Балаховский, В.А. Варфоло-меев // Лаб. дело. – 1977. – № 4. – С. 213–216. 2.Цветкова Н.Д. Технология молока и молочных продуктов: Технология масла: курс лекций / Кемеровский технологический институт пищевой промышленности. – Кемерово, 2005. – 80 с. 3.Отто М. Современные методы аналитической химии. – М.: Техносфера, 2004. Т. 2 4.Современные методы анализа и оборудование в санитарно-гигиенических исследованиях. – М.: ФГУП «Интеосэн», 1999 5.Иванова М.А Белоглазкина М.В Богомолова И.В Федоренко Е.В. Аналитическая химия и физико-химические методы анализа. – М.: РИОР, 2006 6.Хроматография.

Практическое приложение метода / под ред. Э.Хефтмана М.: Мир, 1986. Т. 1 и 2. 7.Гороховский В.И. Аналитическая химия. – М.: Колос С, 2000.