Ферментативный метод определения ФОС.
Материальное обеспечение: Раствор №1. Берут 200мг бромтимолового синего и растирают в ступке с 20мл 0,1 н. раствора едкого натра до растворения. Синий раствор из ступки переносят в литровую мерную колбу. В нее вливают 50мл 0,1 М раствора борной кислоты в 0,1 М растворе хлористого калия и доводят дистиллированной водой до 1л. Раствор должен иметь интенсивно-синюю окраску и рН 8,4.
Раствор №2. К 9,75мл раствора №1 добавляют 0,25мл 0,1 н. раствора соляной кислоты. Раствор должен иметь желтое окрашивание и рН 3,5.
Раствор №3. К 1,8мл раствора №1 добавляют 0,2мл 1%-ного раствора ацетилхолинхлорида (9:1).
Принцип метода основан на определении интенсивности угнетения активности ацетилхолинэстеразы при инкубации нормальной сыворотки крови лошади, экстракта из патматериала и раствора ацетилхолинхлорида. Степень угнетения фермента устанавливают по изменению окраски бромтимолового синего под воздействием образующейся уксусной кислоты от синей до зеленовато-желтой.
Ход анализа. К 25г измельченной навески добавляют 25мл бензола и экстрагируют при помешивании в течение 1ч. 0,025мл экстракта микропипеткой вводят в уленгутовскую пробирку. Туда же добавляют 0,025мл лошадиной сыворотки крови и 2мл раствора №3. Одновременно готовят колориметрический стандарт (раствор №2) и контроль. В контрольную пробирку вместо экстракта заливают дистиллированную воду. По скорости изменения окраски, от интенсивно-синего до желтого, в пробирке с исследуемым экстрактом, по сравнению с контролем, определяют наличие или отсутствие фосфорорганического пестицида в пробе.
Этот метод используют для определения остатков ДДВФ, диброма, циодрина; после концентрирования экстрактов — хлорофоса и амидофоса.
Оценка результата:
· Угнетение активности холинэстеразы на 10% и более свидетельствует о наличии ФОС в исследуемом материале.
· Степень угнетения фермента устанавливают по изменению окраски бромтимолового синего под действием уксусной кислоты (образуется в результате расщепления ацетилхолинхлорида) отсинего до зеленовато-желтого.
Определение ФОС в воде и кормах.
Гидроперекисная реакция (реакция Шанемана) основана на способности ФОСувеличивать скорость окисления бензидина и других окислительно-восстановительных индикаторов. Механизм реакции - под действием перекиси водорода на ФОС образуются гидроперекиси этих соединений, которые в щелочной среде (обеспечивает наличие натрия цитрат) осуществляют окисление бензидина.
В тех случаях, когда окраска слабо выражена (при определении как в кормах так и в воде), к содержанию пробирки добавляют 0,5 мл толуола и тщательным образом смешивают.
Оценка результата:
под действием перекиси водорода на ФОС образуются гидроперекиси этих соединений, которые в щелочной среде (обеспечивает наличие натрия цитрат) осуществляют окисление бензидина, что проявляется появлением желто-оранжевой окраски.
В тех случаях, когда окраска слабо выражена (при определении как в кормах так и в воде), к содержанию пробирки добавляют 0,5 мл толуола и тщательным образом смешивают. При наличии ФОС слой толуола принимает желтую или желто-оранжевую окраску. Чувствительность реакции 10-100 мг на 1 кг корма.
Экспресс-метод определения отравления пчел ФОС.
Принцип метода. Метод основан на свойстве эстераз гидролизовать α-нафтиловый эфир уксусной кислоты, промежуточный продукт распада которого α-нафтол с солью прочный синий Б образует вещество, придающее жидкости окрашивание.
Метод является качественным и позволяет определить отравление пчел фосфорорганическими ядохимикатами в течение 9-30 дней после их гибели.
Ход анализа. Отбирают 10 погибших пчел и отделяют у них головы, растирают их в ступке с порошком стекла, добавляют 4 мл физраствора и переносят в пробирку. Аналогичным образом готовят контрольный гомогенат голов от 10 здоровых пчел и обе пробирки после встряхивания оставляют на 5-10 мин для отстаивания.
Оценка результата:
Положительный результат анализа считается установленным в том случае, если раствор, содержащий 1-нафтиловый эфир уксусной кислоты и соль прочного синего Б, в течение 2 минут после внесения гомогената голов погибших пчел не приобретает розовую окраску.