ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТОКСИЧНОСТИ КОРМОВ, ПОРАЖЕННЫХ МИКРОСКОПИЧЕСКИМИ ГРИБАМИ.

 

Биологические методы. Биологические методы могут применяться как для определения санитарного качества пищевых продуктов, так и для определения токсигенной активности грибов. Учитывая различную чувствительность животных к микотоксинам, при биологических испытаниях чаще всего используют: цыплят, утят, кур, голубей, мышей, кроликов, некоторые виды рыб, растений, микроорганизмов, культур тканей. При этом используются различные методические приемы.

Метод скармливания.Токсичность кормов и продуктов питания можно определять методом скармливания. Для зерновых кормов используют мышей, голубей, утят 1-10 дневного возраста, цыплят 3-15дневного возраста. Для грубых и растительных кормов - морских свинок и кроликов. Для продуктов животного происхождения - кошек или собак

Суточная масса корма при биопробе заменяется исследуемым кормом на 50-100%. Испытуемые корма дают животным на протяжении 10 суток. Предварительно животных оставляют на 5-6 часов без корма, чтобы животные интенсивнее поедали испытуемые корма. Водопой не ограничивают. Ежедневно ведут учет съеденного животными корма. В зависимости от степени токсичности и количества съеденного корма признаки токсикоза могут проявиться в различное время. Корма с выраженной токсичностью вызывают гибель животных через 1 - 3 суток. Клиническая картина интоксикации, в большей или меньшей степени, характерна для каждого вида токсигенных грибов. Обычный срок наблюдении - до 15 суток.

Метод введения в желудок. Используют несколько вариантов этого способа.

При определении токсичности муки, крупы, некоторых продуктов животного происхождения делают водную взвесь (из расчета 1 : 2 или 1: 3) и вводят в желудок через зонд в количестве 0,5 мл (на мышь). Введение повторяют три дня подряд.

Более распространен метод, в котором предусмотрено экстрагирование токсинов органическим растворителем - этанолом, ацетоном, эфиром, хлороформом и др. Затем растворитель удаляется на ротационном испарителе. Маслянистый остаток растворяют в подсолнечном масле (до 5 мл). Аликвотную часть масла вводят мышам в желудок с помощью зонда (до 1 мл). Один из вариантов этого способа является арбитражным и широко используются ветеринарными лабораториями. Предусмотрен­ный срок наблюдений - 3 суток. Если в течение этого срока погибает хотя бы одна мышь, то корм считается токсичным и выбраковывается. В случае отсутствия гибели животных производится вскрытие и учет патологоанатомических изменений внутренних органов. При наличии изменений в печени, почках, легких, сердце - корм считают малотоксичным. Рекомендуемый срок наблюдений не всегда достаточен для объективной оценки токсичности кормов и его целесообразно продлить до 5-7 суток.

Один из вариантов данного метода (при исследовании на афлатоксин) предусматривает использование для биопробы утят (как наиболее чувствительных). Экстракт (в виде суспензии на воде) после отгонки растворителя вводят утятам через зонд в желудок в количестве от 0,5 до 1,5 мл нарастающими дозами 3-4 раза (1 раз в сутки). Общий срок наблюдений - 7 суток. Зятем утят убивают и исследуют состояние печени. Наличие жировой дистрофии печени, множественных геморрагии, отечных явлений свидетельствуют о токсичности корма (характерные изменения для афлатоксикоза).

Кожная проба на кролике. Этот метод используется для определения токсичности различных видов кормов и продуктов питания.

При использовании данного метода 50 г измельченного продукта экстрагируют органическим растворителем (эфиром, хлороформом, смесью спирта с эфиром, ацетоном) в течение 24 часов. Затем экстракт отфильтровывают, а растворитель отгоняют. В остаток добавляют 1 мл подсолнечного масла и смесь тщательно растирают стеклянной палочкой. Для пробы подбирают здоровых кроликов (желательно светлой масти). Участок кожи (4-5 см) выбривают, наносят на него часть экстракта, втирая его палочкой. Через 24 часа наносят оставшуюся часть экстракта. Для предупреждения слизывания на шею кролика надевают фартук. Учет реакции проводят ежедневно на протяжении 7 суток. Обычно реакция развивается на второй день и постепенно усиливается к 4 дню. Есть данные, что кожа крупного рогатого скота, лошадей, овец, кур, гусей, собак и кошек также очень чувствительна к ядам. Кожа морских свинок обладает средней чувствительностью. Кожа белых мышей наименее чувствительна.

Степень токсичности определяется по характеру воспалительного процесса. При этом выделяют 4 степени токсичности.

Первая степень токсичности - покраснение, повышенная чувствительность кожи, шелушение. Симптомы, исчезающее через 1-2 дня после нанесения экстракта. Очень слабо токсичный корм.

Вторая степень - покраснение, болезненность, незначительное утолщение кожи, мелкие желтоватые пузырьки (редко). Затем на месте пузырьков образуются тонкие корочки подсохшего экссудата, наблюдается шелушение. Слабо токсичный корм.

Третья степень - сильное утолщение и складчатость кожи, болезненность, образование пузырьков на всей обработанной поверхности. Затем на месте обработанной поверхности развивается сухой некроз, иногда язвы. Токсичный корм.

Четвертая степень - покраснение, сильный отек, выступающий над поверхностью остальной кожи, глубокий сухой некроз, долго незаживающие язвы. Резко токсичный корм.

Контролем служит партия нетоксичного корма. Некоторые токсины (например, патулин) не оказывают резко выраженной дерматоксической реакции у кролика.

Внутрикожное введение в бородку кур. Используют эфирные или спиртовые экстракты, подготовленные по описанному выше способу. Маслянистый остаток или раствор остатка в подсолнечном масле вводят в одну из бородок кур В другую бородку вводят контрольный экстракт. Реакцию учитывают по наличию воспалительного процесса, отека, кровоизлияний и некроза на месте введения. Измеряют толщину бородки как показатель отека тканей.

Определение токсичности на простейших. Эта методика используется для первичного отбора токсинообразующих культур грибов, а также экстрактов из кормов. В качестве тест-объектов используют обычно один из двух видов Parameciumcaudatum, Tetrachymenapyriformis. Эти простейшие чувствительны ко многим ядам. Для испытания на токсичность 0,2 мл экстракта(или культуральной жидкости) вносят в лунку на предметном стекле и туда же вносят каплю культуры парамеций (с определенным их количеством). Капли перемешивают и ведут наблюдение под микроскопом за их активностью. В первый час наблюдение ведут каждые 2-3 минуты. Резко токсичные экстракты вызывают гибель парамеций через 8 минут, токсичные - через 20 минут слабо токсичным - через 2 часа. Нетоксичные экстракты гибели парамеций в течение 24 часов не вызывают.

Метод определения токсичности на рыбах гуппи. Данный метод предложен для определения токсичности зернофуража, пораженного микроскопическими грибами. Пробу зернофуража массой 50 г измельчают и экстрагируют 100 мл ацетона при периодическом встряхивании - 12 часов или на качалке - 2 часа, Сухой остаток растворяют в 5 мл чистого ацетона переносят в аквариум с водой (500 мл) при температуре 17-20°С, перемешивают и помещают в него 5 рыб гуппи. Отмечают время гибели рыб в течение 24 часов

 

Определение токсичности на эмбрионах птиц. Куриные эмбрионы используют для определения токсических свойств продуктов питания и кормов.вводят в желточный мешок 0,5 мл испытуемого экстракта. Затем отверстие заклеиваюти лоток с яйцами помещают в инкубатор (термостат).