Применение смешанных культур определенного состава

Самым наглядным примером использования смешанных культур определенного видового состава является сыроделие. Гастрономическая сторона этих процессов известна каждому, но далеко не все знакомы с экономической важностью молочной и сыродельческой промышленности. Согласно одной из оценок, доля молочной промышленности составляет около 4% в валовом национальном продукте США; из них около 15% приходится на производство сыра.

Ранее в сыроделии применяли местные дикие смешанные культуры; теперь же для обеспечения строго стандартизированного качества сыров для закваски используют особые культуры, Различные сорта сыров производят путем засева пастеризованного свежего молока соответствующей культурой организма, продуцирующего молочную кислоту. В кислой среде образуется богатая белками творожистая масса; ее отделяют от сыворотки и ставят на созревание в присутствии бактерий или плесеней. При производстве твердых сортов сыра к инокулированному молоку после того, как создалась слегка кислая среда, добавляют смесь сычужных ферментов (содержащую протеолитический фермент реннин). В конечном счете, образуется резиноподобная сырная масса (сгусток), которую разрезают на мелкие кусочки, подвергают тепловой обработке, подсушивают, размалывают и прессуют для отделения остатков сыворотки (процесс чеддаризации). Наконец, после второй серии операций высаливания, подсушивания и прессования получают сыр, готовый к созреванию. В процессе созревания в результате медленных ферментативных (анаэробных) реакций частично расщепляются липиды и белки, образуя частично окисленные продукты, в том числе молочную, масляную и уксусную кислоты, которые по мере старения сыра придают ему специфический острый вкус.

Начальные стадии производства многих других сортов натуральных сыров аналогичны описанным выше; консистенция и вкус готового сыра определяются в основном на более поздних стадиях; в частности, природой применяемого на этих стадиях организма, концентрацией соли и влаги и температурой созревания. В табл. 14.1 приведен перечень наиболее распространенных сортов сыра и соответствующих организмов, используемых при их получении. Многие из этих организмов синтезируют витамины, которые повышают питательную ценность сыров в ходе созревания.

Молочнокислые бактерии являются составными частями и других смешанных культур определенного состава, использующихся в пищевой промышленности. Так, при производстве виски добавление Lactobacillus к дрожжам способствует снижению рН, а также уменьшению вероятности заражения посторонними организмами, приданию необходимого вкуса и аромата. Другой пример применения смешанных культур дрожжей и молочнокислых бактерий — производство имбирного пива. Наконец, применение двух видов Lactobacillus способствует повышению выхода молочной кислоты.

Последовательную трансформацию питательного вещества в необходимый конечный продукт иногда можно успешно осуществлять с помощью особого методического приема, называемого двойной ферментацией. Примером может служить процесс получения L-лизина из глицерина, в котором в качестве промежуточного вещества образуется а,8-диаминопимелиновая кислота (DAP). В одной из операций с участием ауксотрофного мутанта Е. coli накапливают это промежуточное соединение. В другой отдельной операции выращивают культуру Aerobacter aerogenes. Этот организм синтезирует фермент DAP-декарбоксилазу, которая превращает DAP в L-лнзин.

Таблица 14.1, Микроорганизмы, применяющиеся в сыроделии^а

Последующее смешение двух культур и добавление толуола приводит к выделению в среду как DAP, так и DAP-декарбоксилазы, что обеспечивает образование L-лизина.

Известно несколько других примеров промышленных процессов с применением смешанных культур определенного состава. Одним из таких процессов является производство β-каротина. В этом процессе различные скрещивающиеся типы одного и того же организма обеспечивают повышение выхода каротина приблизительно в 20 раз по сравнению с процессом, катализируемым любым одним типом организмов. В приведенном ниже примере рассмотрено повышение степени усвоения метана в процессах производства белка одноклеточных организмов благодаря применению смешанных культур.

Пример 14.1. Обусловленное мутуализмом ускорение роста утилизирующих метан бактерий Pseudomonas sp. в хемостате*.

* Этот пример заимствован из работы: Wilkinson Т. G.. Topiwala Н. Н HamerG.,, Interactions in а Mixed Population Growing on Methane in Continuous Culture; Biotech. Bioeng., 16, 41 (1974).

В разд. 12.7 и примере 9.2 мы рассматривали некоторые аспекты проблемы производства белка одноклеточных организмов. В соответствующих процессах в последнее время большой интерес вызывает изучение возможности применения газообразных углеводородных субстратов, в особенности метана. В некоторых экспериментальных работах было показано, что часто смешанные культуры растут на метане быстрее, чем соответствующие чистые культуры организмов, утилизирующих метан.

Этот факт объясняли, в частности, мутуалистическим взаимодействием типа изображенного схематично на рис. 14П1.1. В данной смешанной культуре, изучавшейся экспериментально Уилкинсоном, Топивалой и Хэймером, имеются в основном два вида бактерий — утилизирующие метан Pseudomonas sp. и утилизирующие метанол Hyphomicrobium sp. Поскольку метанол является конечным продуктом метаболизма Pseudomonas sp. и ингибирует рост этих организмов, то псевдомонады существенно выигрывают от присутствия второго вида, связывающего метанол. Очевидно, что Hyphomicrobium sp. в смешанной культуре также получают определенные преимущества, поскольку этот вид таким путем обеспечивается источником углерода. В смешанной культуре присутствуют в относительно невысоких концентрациях два других вида бактерий, которые, как полагают, выполняют полезные функции, утилизируя другие конечные продукты метаболизма Pseudomonas sp.

С детальным обсуждением предложенного механизма можно ознакомиться в оригинальной работе; мы же ограничимся рассмотрением одного эксперимента, в ходе которого был выявлен ряд эффектов, представленных на рис. 14П1.2. Смешанную культуру выращивали в хемостате; в нулевой момеит времени (t=0) в ферментер и резервуар со средой добавляли метанол до концентрации 1,6 г/л. Как показано на рис. 14П1.2, добавление метанола вызывает немедленное и очень резкое снижение скорости утилизации метана и кислорода и несколько меньшее снижение общей массы сухих веществ микроорганизмов, хотя относительное количество Hyphomicrobium sp. в ферментере возрастает. Приблизительно через 17 ч концентрация метанола в ферментере падает почти до нуля, а указанные выше тенденции изменения концентраций компонентов системы меняются на обратные. Считается, что в этот момент активность Pseudomonas sp. в существенной степени восстанавливается.

Все составляющие математической модели этой системы должны быть нам знакомы по материалу предыдущих разделов и глав, посвященных изучению массопереноса и кинетики процессов в биологических системах. Обозначив символами x₁ и x₂ концентрации Pseudomonas и Hyphomicrobium sp. соответственно, можно записать соответствующие уравнения для изменения этих концентраций в переходном состоянии в хемостате:

(14П1.1)

Выражения для скорости роста Pseudomonas и Hyphomicrobiutn выбраны таким образом, чтобы они отражали ситуацию, схематично изображенную на рис. 14П1.1. В частности, для лимитируемого кислородом роста бактерий Pseudomonas принимается, что

РИС. 14П1.1. Возможные межвидовые взаимодействия в смешанной культуре, растущей на метане.

(14П1.2)

где c_O₂ и s — концентрации растворенного кислорода и метаиола соответственно.

РИС. 14П1,2. Поведение утилизирующей метан смешанной культуры в нестационарном состоянии в хемостате после добавления метанола до концентрации 1,6 г/л в ферментере и питательной смеси при t=0; D=0,08 ч^-1, [Из работы; Wilkinson Т. G. et al.. Interactions in a Mixed Bacterial Population Growing on Methane in Continuous Culture; Biotech. Bioeng.,16, 14 (1974).]

1 — общая масса сухих веществ бактерий; 2 — концентрация кислорода в отходящих газах; 3 — парциальное давление растворенного кислорода; 4 — скорость образования CO₂; 5—скорость утилизации метана; 6 — относительная численность популяции Hyphomicrobium sp., %.

Таблица 14П1.1. Параметры математической модели, описывающей поведение смешанной культуры, утилизирующей метан^а

Используемые в этом примере функции ингибирования аналогичны рассмотренным в гл. 3 (неконкурентное ингибирование катализируемых ферментами реакций) и в гл. 7 (ингибирование роста дрожжей этанолом). Поскольку при низкой концентрации растворенного кислорода Hyphomicrobium без труда могут использовать нитрат в качестве акцептора электронов, то мы принимаем, что r_f₂ не зависит от c_O₂ и что зависимость r_f₂ от s описывается уравнением Моно

(14П1.3)

Допустив далее, что экономические коэффициенты для обоих видов по отношению к метанолу постоянны и что большая часть кислорода поглощается Pseudomonas, получим следующие уравнения материальных балансов по s и c_O₂:

(14П1.4)

(14П1.5)

С помощью экспериментов с периодическими культурами Уилкинсон, Топивала и Хэймер определили значения всех параметров этой модели; скорость поглощения кислорода определяли непосредственно. Предложенные ими значения параметров перечислены в табл. 14П1.1.

На рис. 14П1.3 приведены характеристики стационарных состояний, вычисленные с помощью указанной модели, при различных скоростях разведения, a также некоторые результаты экспериментального изучения этой системы.

РИС. 14П1.3. Сплошные кривые — расчетные данные; точки — экспериментально найденные значения концентрации сухих веществ. [Из работы: Wilkinson Т. G. et al., Biotech. Bioeng., 16, 41 (1974).]

Соответствие между экспериментальными и расчетными данными хотя и не идеальное, но вполне удовлетворительное. Моделирование переходных состояний, возникающих при влиянии метанола на смешанную культуру, также привело к результатам, качественно согласующимся с экспериментальными данными (см. рис. 14П1.2). В то же время динамика реальной системы значительно более замедленна, чем динамика модели. Очевидно, для адекватного отражения происходящих в смешанной культуре взаимодействий в нестационарном состоянии необходима более структурированная модель.