Основы биохимической инженерии

BIOCHEMICAL

ENGINEERING

FUNDAMENTALS

 

Second Edition

James E. Bailey

California Institute of Technology

David F. Ollis

North Carolina State University

 

McGraw-Hill Book Company

 

New York St. Louis San Francisco Auckland Bogota

Hamburg Johannesburg London Madrid Mexico

Montreal New Delhi Panama Paris Sao Paulo

Singapore Sydney Tokyo Toronto

Дж. Бейли, Д.Оллис

 

Основы

биохимической

инженерии

 

В 2-х частях

 

 

Перевод с английского

А. А. Кирюшкина

 

Москва «Мир» 1989

ББК 28.07

Б 40

УДК 57.04

 

Бейли Дж., Оллис Д.

тях. Ч. 2. — М.: Мир, 1989. — 590 е., ил. ISBN 5-03-001029-7 Фундаментальный труд, написанный известными американскими специали-

Б 1901000000—370

ББК 28.07

 

 

Редакция литературы по химии

 

ISBN 5-03-001029-7 (русск.) © 1986, 1987 by McGraw-Hill, Inc.

ISBN 5-03-001027-0 © перевод на русский язык, «Мир», 1989

ISBN 0-07-003212-2 (англ.)

Глава 9

 

Проектирование и расчет биологических реакторов

Знание кинетики биологических превращений и процессов массопередачи (этим проблемам были посвящены гл. 7 и 8) необходимо для понимания основных… При изучении кинетики клеточного роста в гл. 7 мы подчеркивали сложную,… Что касается рассматриваемых в настоящей главе методов приближенного математического описания биореакторов, то в…

Идеальные биореакторы

Изучение теории идеальных биореакторов с полным перемешиванием важно с нескольких точек зрения. Во-первых, такие реакторы обеспечивают достаточно…  

Реакторы периодического действия с добавлением субстрата

Часто в ходе микробиологического процесса возникает необходимость во введении в биореактор периодического действия потоков жидких веществ, например… (9.1) Если принять, что и плотность поступающего в реактор раствора, и плотность культуральной жидкости в реакторе равны р,…

Реакции в ПРПП, катализируемые ферментами

В зависимости от способа обеспечения ферментативной активности при осуществлении катализируемых ферментами реакций используются ПРПП различных… Более дорогостоящие ферменты необходимо удерживать в реакторе или возвращать в…

РИС. 9.3. Схематическое изображение ПРПП различного типа, применяемых для проведения катализируемых ферментами реакций.

а — реактор с непрерывной подачей раствора ферментов; б — реактор с удерживанием ферментов в растворе с помощью полупроницаемой мембраны; в — реактор с удерживанием гранул иммобилизованного фермента с помощью сетчатого фильтра; г — реактор с удерживанием гранул иммобилизованного фермента в контейнерах, размещенных на валу мешалки; д—реактор с рециркуляцией реакционной массы через короткую колонну, наполненную иммобилизованным ферментом.

в системе реактор с полным перемешиванием — короткая колонна с насадкой иммобилизованного фермента (рис. 9.3, d). Если скорость рециркуляции достаточно высока и в каждом цикле при однократном прохождении реакционной смеси через колонну превращению подвергается небольшая часть субстрата (менее 1%), то вся система становится эквивалентной проточному реактору с полным перемешиванием [4]. Отсюда следует, что эта конструкция реактора особенно удобна для изучения кинетики реакций в лабораторных исследованиях.

Рециркуляция фермента возможна только при условии, что фермент легко выделить из вытекающего из реактора потока продуктов реакции. Есть два перспективных подхода к решению этой задачи, один из которых связан с включением фермента в мембрану из жидкого поверхностно-активного вещества или фосфолипида, а второй — с иммобилизацией ферментов на магнитных носителях.

Независимо от типа и конструкции реактора основная задача всегда сводится к поддержанию заданной концентрации фермента в ПРПП. Если эта задача решена, то мы можем сконцентрировать наше внимание на расчете концентраций субстрата и продукта реакции в вытекающем из реактора потоке. Здесь применимы рассмотренные выше общие принципы и уравнения материального баланса, используемые для описания роста популяции микроорганизмов, а также дополнительные ограничения, налагаемые относительно простой стехиометрией изучаемых реакций.

Например, для простой реакции

из каждого моля прореагировавшего вещества S образуется один моль вещества Р, и, следовательно, концентрации этих веществ на входе в реактор (s₀, p₀) и на выходе из реактора (s, р) связаны соотношением

(9.5)

Если условие уравнения (9.5) выполнено, то скорость реакций v(s, p), которая является функцией как s, так и р, можно выразить только через s, что упрощает соответствующие выражения. В этом случае уравнение материального баланса по субстрату принимает форму

(9.6)

В табл. 9.1 даны решения этого уравнения для различных типов кинетики реакций. Приведенные в таблице уравнения проще использовать непрямым путем; для этого нужно в правую часть уравнения перенести необходимые параметры превращения субстрата и рассчитать искомое время пребывания и (или) концентрацию фермента. Аналогичными способами можно получить уравнения для более сложных реакций и типов кинетики превращений.

 

Проточные реакторы с полным перемешиванием для культур клеток и пристеночный рост клеток

Таблица 9.1. Зависимости между степенью превращения субстрата δ=(s0-s)/s0, средним временем пребывания и концентрацией катализатора в случае… лами F0 и Fr мы будем обозначать объемные скорости потоков поступающих в систему питательных веществ и рециркуляции…

РИС. 9.4. Схема ПРПП с рециркуляцией.

 

биомассе для системы с рециркуляцией выглядит следующим образом:

(9.7)

Тогда общая (или внешняя) скорость разведения D (равная

F₀/V_r) составит:

(9.8)

Поскольку концентрация микроорганизмов в циркулирующем потоке обычно выше концентрации на выходе из реактора, то b>1. В этом случае, как показывает уравнение (9.8), скорость разведения выше удельной скорости роста организмов. Следовательно, рециркуляция при той же скорости роста организмов позволяет перерабатывать за единицу времени больше питательных веществ в единице объема реактора. Эта особенность проточных реакторов с рециркуляцией с большим успехом используется в процессах биологической переработки отходов, подробнее рассматриваемых в гл. 14. (Каков эффект рециркуляции при b=1? Объясните физический смысл полученного вами результата.)

Другие важные преимущества системы с рециркуляцией обнаруживаются после ряда преобразований уравнений материального баланса по компонентам системы. Если принять, что экономический коэффициент постоянен, то уравнение материального баланса по субстрату можно записать в виде

(9.9)

Из уравнений (9.9) и (9.8) нетрудно найти, что скорость образования биомассы в единице объема реактора (μx₁) равна:

(9.10)

Эта величина больше скорости образования биомассы без рециркуляции в [1—a(b—1)]^-1 раз. Если принять, что [μ подчиняется уравнению Моно, то можно показать, что и скорость разведения в точке вымывания при рециркуляции возрастает во столько же раз.

В экспериментах с растущими популяциями клеток в ПРПП иногда и в отсутствие рециркуляции можно добиться более высоких скоростей разведения без вымывания по сравнению с величиной, предсказываемой теорией идеальных ПРПП (вспомните разд. 7.1.2). Это явление может быть обусловлено ростом организмов на стенках реактора (так называемым пристеночным ростом). В общем случае в реакторе может быть несколько центров образования твердых пленок организмов. Колонии микроорганизмов могут возникать, например, над уровнем жидкой фазы там, где разбрызгиваемые капли культуры попадают на стенки резервуара, или в трещинах и щелях в относительно неперемешиваемых (застойных) зонах биореактора. Если допустить, что концентрация клеток в пленках на стенках реактора x_f постоянна во времени, то размножение организмов в этих пленках должно сопровождаться переносом клеток со стенок в жидкую перемешиваемую культуру. В этом случае уравнения материального баланса для стационарного состояния в проточном реакторе примут следующую общую форму:

(9.11)

(9.12)

Здесь μ_f и Y_f — удельная скорость клеточного роста и экономический коэффициент в пленке соответственно. Эти параметры по целому ряду причин отличаются от соответствующих параметров основной массы культуры μ и Y, в том числе из-за влияния диффузии на скорость реакции.

Здесь необходимо отметить, что слагаемое μ_fx_f в уравнении (9.11) отражает второй источник поступления клеток в культуральную жидкость, который практически не зависит от D, поэтому пристеночный рост организмов предотвращает вымывание. В этой связи следует также подчеркнуть, что у лабораторных реакторов отношение поверхности к объему значительно выше, чем у крупномасштабных промышленных реакторов, и, следовательно, вклад пристеночного роста в лабораторных установках также в общем случае должен быть большим. Таким образом, для систем, в которых наблюдается существенный пристеночный рост организмов, последний необходимо учитывать при масштабном переходе от данных по кинетике роста микроорганизмов, полученных в лаборатории, к промышленным реакторам большого объема.

 

Идеальный трубчатый реактор полного вытеснения (ТРПВ)

 

Если при течении жидкости по трубопроводу сравнительно большого диаметра или по каналу число Рейнольдса достаточно велико (например, больше 2100 для трубы), то течение в такой системе приближается к режиму полного вытеснения (поршневому потоку), при котором в поперечном сечении потока осевые скорости не изменяются. Если допустить, что режим полного вытеснения приближенно описывает движение жидкости через реактор, то, воспользовавшись понятием об элементарном объеме, можно вывести уравнения материального баланса по компонентам системы в трубчатом реакторе полного вытеснения (ТРПВ). Как показано на рис. 9.5, при таком подходе принимается, что в трубчатом реакторе стационарное состояние сохраняется в элементарном объеме потока, перпендикулярном оси реактора. Материальный баланс по некоторому произвольному компоненту С в элементарном объеме можно выразить следующим уравнением:

(9.13)

Здесь r_fc — скорость образования компонента С, выраженная через его количество в единице объема за единицу времени.

РИС. 9.5. Реактор полного вытеснения.

 

Преобразование и деление на AΔz дает

(9.14)

Вспомнив определение производной, нетрудно найти, что в пределе это уравнение преобразуется, давая в окончательном виде

(9.15)

Если в результате реакции плотность жидкости не изменяется (справедливо ли это допущение для микробиологического процесса?) и если осевая скорость постоянна, то уравнение (9.15) принимает вид:

(9.16)

Величина z/u равна времени, которое затрачивает элементарный объем жидкости на движение от входа в реактор до осевого положения z. Если в качестве новой независимой переменной использовать время движения элементарного объема t, равное

(9.17)

то уравнение материального баланса по компоненту C примет вид:

(9.18)

Последнее уравнение полностью совпадает с уравнением материального баланса по компоненту C в реакторе периодического действия. Приведенное выше математическое доказательство можно дополнить следующей аргументацией: в режиме поршневого потока при постоянной скорости каждый элементарный объем жидкой фазы движется вдоль трубчатого реактора без какого-либо взаимодействия с соседними объемами. Следовательно, система полностью сегрегирована, и каждый элементарный объем ведет себя как реактор периодического действия. Отсюда следует, что если исходная смесь в реакторе периодического действия имеет тот же состав, что и смесь, подаваемая в реактор полного вытеснения, и если среднее время пребывания L/u в последнем равно времени реакции в реакторе периодического действия, то и вытекаюш,ая из трубчатого реактора масса будет идентична по своему составу продукту в реакторе периодического действия. Этой модели отвечает граничное условие

(9.19)

Здесь z=0 отвечает точке ввода исходных веществ в реактор, а c₀ — концентрация компонента C в исходной смеси.

Допустим, например, что кинетика процесса в хемостате Моно не отличается от кинетики процесса в ТРПВ (или в эквивалентном реакторе периодического действия). В этом случае уравнения материального баланса по клеточной массе и субстрату [уравнение (9.18)] преобразуются следующим образом;

(9 20)

(9 21)

С начальными условиями

(9.22)

Логическим путем или посредством преобразования уравнений (9.20) и (9.21) нетрудно найти, что концентрации s и л: связаны стехиометрически

(9.23)

Если при помощи уравнения (9.23) выразить x через s и подставить полученное выражение в уравнение (9.21), то мы получим обычное дифференциальное уравнение:

(9.24)

Зто уравнение при условии (9.22) можно интегрировать аналитическим путем; тогда получим:

(9.25)

Концентрации субстрата на выходе из реактора отвечает значение s при t=L/u-, соответствующее значение х легко найти с помощью уравнения (9.23). Если считать, что уравнение (9.20) описывает кинетику периодического процесса, нетрудно видеть, что эта математическая модель не учитывает лаг-фазу и фазу отмирания клеток, но отражает стационарную фазу клеточного роста.

В отличие от ПРПП стерильность исходных веществ в ТРПВ автоматически предполагает и нулевую концентрацию биомассы на выходе из реактора, поскольку поршневой характер потока предотвращает инокуляцию движущегося по трубчатому реактору элементарного объема жидкости. Этот недостаток можно устранить, например, путем предварительной инокуляции поступающего в реактор потока исходных веществ.

Не представляет затруднений интегрирование уравнений материального баланса по отдельным компонентам в реактореполного вытеснения; таким образом можно получить выражения, описывающие связь между концентрациями компонентов в продуктах и общим временем пребывания в реакторе L/u для некоторых обычных реакций, катализируемых ферментами. Результаты таких расчетов приведены в табл. 9.2.

Сравнительные характеристики идеальных ПРПП и ТРПВ зависят от типа осуществляемых в них реакций и их кинетики. При протекании одностадийной реакции с обычной кинетикой (когда скорость реакции снижается при увеличении превращения субстрата; примером могут служить реакции, описываемые уравнением Михаэлиса — Ментен) ТРПВ обеспечивает более высокую степень превращения субстрата и большую концентрацию продукта реакции на выходе из реактора по сравнению с ПРПП равного объема. Для автокаталитических реакций (когда скорость реакции возрастает при снижении концентрации субстрата) справедливо обратное соотношение характеристик ТРПВ и ПРПП. В микробиологических процессах ТРПВ обыч-

Таблица 9.2. Взаимосвязь между степенью превращения субстрата δ=(s₀-s)/s₀ и важнейшими параметрами ферментативных реакций в ТРПВ^a. Данные относятся к ферментам в растворе или к гранулам иммобилизованных ферментов с пренебрежимо малым сопротивлением массопередаче; для ферментов в растворе выражение (1—ε)/ε равно единице

но обеспечивает большую концентрацию продукта в вытекающем из реактора потоке. В то же время необходимость непрерывного внесения посевного материала и ряд затруднений технического характера при осуществлении газового обмена в ТРПВ часто приводят к тому, что на практике выгоднее применять аналогичные реакторы периодического действия, даже если высокая концентрация продукта в вытекающем из реактора потоке является важным фактором. В фазе экспоненциального роста ПРПП эффективнее ТРПВ или реакторов периодического действия. Сравнительное изучение идеальных ТРПВ и ПРПП при их использовании для различных простых сочетаний реакций составляет основную тему учебных пособий по химической технологии, перечисленных в списке литературы в конце этой главы. С другими примерами сравнительного изучения различных реакторов мы познакомимся в упражнениях.

 

Динамика процессов в реакторах

 

В этом разделе мы рассмотрим динамические характеристики биореакторов. Хотя основное внимание мы будем уделять динамике процессов в ПРПП, многие из анализируемых здесь принципов и концепций можно успешно перенести и на реакторы других типов. Сначала выведем основные уравнения, необходимые для описания работы реактора в нестационарном состоянии, а затем рассмотрим возможность применения этих уравнений для изучения процессов в биореакторах в неустановившемся состоянии. Как мы увидим, успешному применению изучаемых здесь подходов часто препятствует отсутствие кинетических моделей, достаточно точно описывающих особенности переходного состояния.

 

Динамические модели

В основу изучения динамики процессов в ПРПП может быть положено уравнение материального баланса (7.4), преобразованное в соответствующее уравнение… Тогда для компонента і в реакторе с полным перемешиванием получим:

Устойчивость

В этом разделе мы рассмотрим зависимость динамических характеристик системы в реакторе от функции f и ряда заданных значений параметров р. Для нас… Мы будем называть стационарное состояние cs локально асимптотически…

Реакторы с неидеальным перемешиванием

Закончив изучение идеальных реакторов с полным перемешиванием или трубчатых реакторов полного вытеснения, которые можно воспроизвести в лабораторных…

Время выравнивания концентраций в реакторах с перемешиванием

Под временем выравнивания концентраций понимают время необходимое для достижения определенного уровня гомогенности содержимого реактора после… С математическими выражениями, позволяющими определить время выравнивания… Очевидно, что некоторое единое время циркуляции, например в перемешиваемом резервуаре, является приближенным понятием.…

Распределение времени пребывания

Попытаемся представить себе, что случится с небольшим объемом жидкости после его введения в проточный биореактор непрерывного действия. Благодаря… Рассмотрим сначала произвольный сосуд с одной линией подачи исходных веществ и… В таких условиях отклик системы на однократныйввод ин¬

РИС. 9.8. Экспериментальное определение отклика системы (F-функции) на импульсный ввод индикатора.

 

менте концентрации индикатора c* в линии подачи. Рассчитанный таким путем однократный отклик сосуда с перемешиванием называют F-функцией (рис.9.8):

(9.46)

Во многих случаях удобнее применять не функцию F, а функцию распределения времени пребывания (РВП)* E(t), которая определяется как

(9.47)

* Согласно принятой в статистике терминологии, E — функция плотности, а F — соответствующее распределение. В литературе по химической технологии, однако, закрепилась употребляемая здесь терминология, которой во избежание недоразумений мы и будем пользоваться в дальнейшем.

 

Таким образом, доля выходящего из реактора потока, время пребывания которого в реакторе меньше t, равна:

Из определения (9.47) следует, что

(9.48)

Взаимосвязь между функциями E и F можно выяснить с помощью несложного рассуждения. Возвращаясь к эксперименту типа стимул — отклик (рис. 9.8), представим, что содержимое сосуда состоит из двух различных жидкостей, причем жидкость I содержит индикатор в концентрации с*, а жидкость II вообще не содержит индикатора. Следовательно, все элементы жидкости I должны были бы поступить в сосуд за некоторое время t>0, и тогда любой элемент жидкости I на выходе из реактора в момент времени t находился бы в системе в течение времени, меньшего t. С другой стороны, жидкость II должна была бы находиться в реакторе при t=0, поскольку после этого в реактор поступала только жидкость I. Следовательно, время пребывания всех элементов жидкости II, покидающих сосуд в момент времени t, больше t. Допустим, что нам известна E-функция, тогда мы можем выразить концентрацию индикатора на выходе из реактора c(t) как сумму вкладов жидкостей I и II:

(9.49)

Из уравнений (9.49) и (9.46) следует искомое выражение:

(9.50)

которое путем дифференцирования по t можно преобразовать в такую форму:

(9.51)

Прежде всего отметим, что, согласно уравнению (9.51), функцию E(t) можно определить путем дифференцирования функции F(t), найденной экспериментальным путем. Кроме того, теория линейных систем утверждает, что производная однократного отклика по времени есть одноимпульсный отклик, откуда следует, что E(t) можно интерпретировать как отклик находящейся в реакторе реакционной смеси на однократное введение (импульс) индикатора в нулевое время. Хотя «импульс» представляет собой абстрактное математическое понятие, в эксперименте ему приближенно соответствует введение определенного количества концентрированного раствора индикатора в течение очень короткого промежутка времени.

Функцию РВП можно определить не только описанным выше экспериментальным путем, но иногда и теоретически, если известна математическая или логическая модель процесса перемешивания. Например, в случае идеального ПРПП уравнение материального баланса по индикатору (не взаимодействующему с компонентами системы) в нестационарном состоянии можно записать в такой форме:

(9.52)

Для определения результата F-эксперимента для этой системы допустим, что

(9.53)

(9.54)

Решение уравнения (9.52) при условиях (9.53) и (9.54) дает:

(9.55)

Из уравнений (9.51) и (9.55) следует, что функцию РВП для ПРПП можно выразить уравнением:

(9.56)

Что касается реакторов полного вытеснения, то функция РВП вытекает уже из определения

 

такого типа реакторов. Действительно, если в поток исходных веществ введен импульс индикатора, то последний проходит через реактор, не смешиваясьс соседними элементами жидкости, и выходит из реактора через время L/u. Следовательно, импульс индикатора на выходе из реактора имеет точно такой же профиль, что и на входе в реактор, но смещен во времени на однократное время удерживания реактора. Отклонения от такого поведения свидетельствуют о нарушении режима идеального вытеснения.

При р аботе с функциями распределения типа E(t) часто полезно учитывать и моменты распределения; k-й момент E(t)определяется по фбрмуле;

(9.57)

Поскольку для определения E-функции в реактор вводят единицу количества индикатора и поскольку весь индикатор в конце концов должен покинуть реактор, то

(9.58)

Первый момент m₁ является средним РВП или средним временем пребывания t. Можно показать, что при отсутствии обратной диффузии (это допущение мы приняли в начале настоящего раздела) для однофазной жидкости в произвольном сосуде [2]:

(9.59)

Иными словами, среднее время пребывания равно номинальному времени удерживания реактора. Это соотношение неприменимо ни к одной фазе многофазной системы, ни к одной фазе системы с нерастворимым катализатором или адсорбентом.Второй момент m₂ часто используется для оценки отклонения распределения σ² (σ²= m₂²-m₁²); σ представляет собой среднеквадратичное отклонение от среднего времени пребывания.

Из других сходных функций, применяющихся в анализе параметров перемешивания реакторов, следует упомянуть функцию распределения времени пребывания в реакторе I(t); I(t)dt представляет собой долю содержащейся в реакторе жидкости, находящейся в реакторе в промежутке времени от t до t+dt

Уравнение материального баланса для этой доли жидкости можно записать в виде:

(9.60)

Производная Λ(t)dt функции интенсивности Λ(t) отражает вероятность того, что элемент жидкости, находившийся в реакторе в течение времени t, покинет реактор в следующий за t короткий интервал времени dt. Эта функция полезна при изучении отклонений от режима идеального перемешивания. С ранее рассмотренными функциями Λ(t) связана соотношениями [16]:

(9.61)

Для идеального ПРПП функция Λ(t) постоянна. На рис. 9.9 показано поведение функции Λ(t) при некоторых типах отклонений от идеальных режимов в реакторах с перемещиванием.В общем случае наличие максимума, после которого функция Λ(t) убывает, свидетельствует о том, что в реакторе имеются застойные зоны или зоны с быстрым и медленным течением на пути от входа в реактор до выхода из него.

Не имея возможности обсуждать здесь все детали, мы все же должны отметить, что РВП, как это в настоящее время надежно установлено, не характеризует процесс перемешивания

РИС. 9.9. Функция интенсивности, характеризующая различные варианты неполного смешения в емкостных реакторах с перемешиванием.

а — время между поступлением в реактор и выходом из него невелико (нормальная ситуация); б — задержка в реакторе поступающего раствора обусловлена неэффективным перемешиванием; в — поступающий в реактор раствор выводится из него, не перемешиваясь с реакционной массой; г — то же, что в пункте «в» и, кроме того, в силу неэффективного перемешивания в реакторе имеются застойные зоны. (Из работы [16]).

 

Со всех сторон (подробнее и детальнее эта проблема рассмотрена в приведенной в конце главы литературе). РВП содержит данные о том, как долго различные элементы вытекающей из реактора жидкой фазы находились в реакторе, но ничего не говорит о том, когда произошло выравнивание концентраций между элементами жидкости с различным временем пребывания в реакторе.

Эти выводы можно пояснить, рассмотрев два предельных варианта. Сначала предположим, что все элементы жидкой фазы независимо от их предыстории постоянно и эффективно перемешиваются. Другими словами, поступающие в реактор исходные вещества сразу же контактируют с другими элементами жидкой фазы независимо от времени их пребывания в реакторе. Такая ситуация, называемая состоянием максимального смешения, преобладает в идеальном ПРПП. В другом крайнем случае элементы жидкости с различным временем пребывания в реакторе вообще не смешиваются и контактируют друг с другом только в выходящем из реактора потоке. В этом случае, называемом состоянием полной сегрегации, реакции протекают независимо в каждом элементе жидкости, причем на ход реакции в одном элементе жидкости не влияют условия и скорости реакций в соседних элементах. Между этими двумя предельными случаями располагаются различные промежуточные случаи перемешивания в небольшой части объема реактора или микросмешения.

РВП реактора совершенно не зависит от характеристик микросмешения. Часто это обстоятельство не играет большой роли, поскольку микросмешение обычно мало влияет на функционирование реактора в целом. Впрочем, в особых случаях микросмешение может оказать существенный эффект на ход процесса. Предполагалось [16], что степень влияния микросмешения на данный реактор можно достаточно надежно оценить путем расчета работы реактора в особых случаях максимального смешения и полной сегрегации. Если режимы работы в этих экстремальных ситуациях существенно различаются, то проектируемый реактор будет чувствителен к микросмешению, а соответствующий масштабный переход будет вызывать большие затруднения. В таких случаях надежность масштабного перехода можно повысить за счет применения ТРПВ или реактора близкого типа (см. следующий раздел), поскольку микросмешение не влияет на параметры процессов в ТРПВ независимо от типа реакций или их кинетики.

В реакторе с полной сегрегацией каждый независимый элемент жидкости ведет себя подобно небольшому реактору периодического действия. Продукт процесса представляет собой смесь продуктов, образовавшихся в каждом из этих микрореакторов, причем время пребывания каждого из продуктов в реакторе различно. Переходя на язык математики, обозначим символом c_ib(t) концентрацию компонента і в реакторе периодического действия спустя время t после начала процесса. Допустим, что начальный состав реакционной смеси в реакторе периодического действия идентичен составу поступающей в проточный реактор смеси исходных веществ. Если только реакция (или реакции) не вызывает существенного повышения температуры или заметного изменения объема, то в данном случае не играет роли, происходит ли здесь одна или несколько различных реакций. Доля вытекающего из реактора потока E(t)dt содержит элементы жидкости с временем пребывания в реакторе около t и, следовательно, с концентрацией компонента і около c_ib(t). Суммирование всех таких долей жидкости дает выражение для концентрации c_i компонента і на выходе из реактора при условии полной сегрегации:

(9.62)

При выводе уравнения (9.62) принималось, что условия реакции (температура, рН, концентрация растворенного кислорода и т. д.) практически одинаковы как в «мнкрореакторе периодического действия», так и во всем реакторе с перемешиванием, обладающим определенным РВП. Говоря «практически одинаковы», мы подразумеваем, что любые имеющиеся различия в условиях оказывают пренебрежимо малое или допустимо малое влияние на изучаемые биологические (биохимические) процессы. Это допущение может оказаться несостоятельным в случае реакторов большого объема, для которых характерна существенная объемная неоднородность условий реакции. Функция РВП для данного реактора сама по себе не говорит о том, как циркулирует в нем жидкость по зонам с различными условиями реакций. Отсюда следует, что если реакционная смесь в биореакторе заметно неоднородна, то уравнение (9.62) применимо только для грубой оценки системы.

Понятно, что индивидуальные клетки или их скопления в биохимических реакторах отделены друг от друга (сегрегированы), поэтому применение уравнения (9.62), по-видимому, оправдано в случае любого микробиологического процесса. Это предположение, однако, не столь обосновано, как это может показаться на первый взгляд. Не надо забывать, что живые клетки содержат сложные контрольные системы, с помощью которых они приспосабливаются к изменениям в среде и перестраивают свои функции в соответствии с этими изменениями. Следовательно, происходящие в периодической культуре изменения отражают взаимное влияние и взаимодействие жидкой фазы (среды) и биологической фазы (клеток). Состав любой одной из этих фаз в периодическом процессе изменяется только в непосредственной связи с изменениями в другой фазе. Поэтому клетка или скопление клеток будут вести себя в проточной системе как небольшой реактор периодического действия только в том случае, если окружающая клетку среда (жидкость) также будет сегрегирована. Рхли изменения в составе среды не оказывают существенного влияния на биологические реакции в периодическом процессе, то это условие необязательно и применение уравнения (9.62) становится более обоснованным. С примерами такого типа мы познакомимся позднее в этой же главе.

Возвращаясь к вопросу о влиянии микросмешения, рассмотрим простую необратимую реакцию порядка 0,5:

(9.63)

Пусть эта реакция осуществляется в перемешиваемом реакторе с полной сегрегацией, который имеет, однако, то же РВП, что и ПРПП. Реакцию порядка 0,5 можно приближенно рассматривать как реакцию, описываемую уравнением Михаэлиса — Ментен в довольно узком интервале концентраций субстрата. Путем расчета зависимости s(t) для реакции (9.63) в реакторе периодического действия с учетом уравнений (9.56) и (9.62) получим:

(9.64)

С другой стороны, если та же самая реакция происходит в идеальном ПРПП, в котором по определению достигается максимальное смешение, то концентрация субстрата на выходе из реактора будет равна:

(9.65)

Общий метод расчета степени превращения субстрата в условиях максимального смешения при произвольном времени пребывания в реакторе описан в работе [20].

Часто микросмешение не оказывает большого влияния на режим работы реактора; очевидно, что это обстоятельство облегчает проектирование соответствующих реакторов. Например, при протекании в ПРПП необратимой реакции второго порядка наибольшая разница между степенью превращения субстрата при полной сегрегации и при максимальном смешении составляет менее 10%. Таким образом, даже если уравнение (9.62) заведомо не отражает реальную ситуацию, с его помощью можно иногда с хорошим приближением описать работу реактора. [Путем ряда преобразований уравнений (9.64) и (9.65) найдите выражение для разности | 1—s (9.64)/s (9.65) |.]

Максимальное превращение субстрата во всех простых реакциях с порядком меньше единицы достигается при максимальном смешении. Напротив, полная сегрегация обеспечивает наивысшую степень превращения для реакций с порядком больше единицы. Как можно показать с помощью принципа суперпозиции для линейных систем, степень микросмешения не влияет на реакции первого порядка. Следовательно, в случае одной или нескольких реакций первого порядка уравнение (9.62) можно использовать независимо от степени микросмешения.

Данные о РВП можно также применять для определения параметров различных моделей неидеальных проточных реакторов. Ряд моделей такого типа мы рассмотрим в следующемразделе.

 

Модели неидеальных реакторов

Очевидно, РВП содержит полезную информацию о структуре течений и характере перемешивания содержимого реактора. Для оценки степени отклонения… РИС. 9.10. F- и E-функции для идеального ПРПП (а); ПРПП с обводной (байпасной) линией (б); ПРПП с застойной зоной…

РИС. 9.11. Модель реактора с неполным перемешиванием и с застойной зоной.

 

(9.66а)

(9.666)

(9.6бв)

(9.66г)

Здесь

(9.67)

В этой модели скорость разведения, отвечающую вымыванию, можно определить, подставив в уравнения (9.66) s₀=s₁=s₂:

(9.68)

Поскольку первое выражение в правой части этого уравнения идентично выражению для скорости разведения, отвечающей вымыванию в системе с полным перемешиванием [уравнение (7.16)], то неполное перемешивание, очевидно, приведет к повышению скорости разведения, необходимой для начала вымывания. Если выражение, стоящее в квадратных скобках правой части уравнения (9.68), будет иметь отрицательное значение, это означает, что вымывание в данной

РИС. 9.12. Вычисленная с помощью модели реактора с застойной зоной (рис. 9.11) зависимость концентрации клеток в продуктах процесса x₁ от скорости разведения D при различных относительных объемах α зоны активного перемешивания. На верхнем графике представлены кривые зависимости скорости образования биомассы x₁D (γ=0,5) от той же переменной.

 

системе невозможно. (Какой физический смысл имеет такое решение уравнения?)

На рис. 9.12 представлены графики зависимостей концентрации клеток в продуктах процесса x₁ и продуктивности системы x₁D от скорости разведения при γ=0,5 и различных α. Эти зависимости были вычислены при тех же значениях K_s и s₀, что и зависимости на рис. 7.10; изменение характера кривых x=f(D) при снижений α от 1 (идеальное перемешивание) до 0,9 или 0,85 (небольшая застойная зона) очень напоминает различия между теоретическими и экспериментальными данными для хемостата (рис. 7.10), причем значение α=0,9 примерно соответствует находящейся над мешалкой доле объема экспериментального реактора, использовавшегося для получения представленных на рис. 7.10 опытных данных.

При изучении РВП до сих пор мы ограничивались реакторами с непрерывными потоками среды и культуры клеток, забывая о том, что в периодических процессах с аэрацией также участвуют газовые потоки. Функция РВП применялась и для оценки газосодержания и степени смешения газа в биореакторах периодического действия. Результаты исследований показали, что в этом случае многое определяется конструкцией применяемого смесителя и реологией реакционной смеси. Например, РВП в системе ТРПВ — ПРПП очень близко к РВП газа в реакторах с механическим перемешиванием, если эти реакторы заполнены маловязкими жидкостями (водой, водными растворами солей, суспензией Saccharomyces cerevisiae). Более сложные функции РВП газа характерны для перемешиваемых высоковязких растворов. На рис. 9.13 приведены результаты изучения распределения времен пребывания газа в реакторе, когда поток газа поступал через барботер в стандартный реактор с перемешиванием, содержащий суспензиюPenicillium chrysogenum (10 г/л). Соответствие этих экспериментальных данных расчетным было достигнуто только после введения в математическую модель (рис. 9.11) выражения, соответствующего элементу полного вытеснения.

Модели, построенные на основе идеальных реакторов разного типа, обычно называют комбинированными, или смешанными моделями; они представляют собой только один из множества способов описания неполного перемешивания. Комбинированные модели имеют то преимущество, что они могут одновременно являться полезным инструментом для теоретического изучения структуры течений и перемешивания в реакторе, служить основой для расчета параметров неидеального сосуда в качестве реактора, а также при конструировании лабораторных реакторов для изучения эффектов, вызываемых отклонениями от идеального режима в аппаратах большого объема.

Если для описания данного неидеального биореактора мы выбрали одну из указанных выше комбинированных моделей, то ее можно применять и для расчета параметров этого реактора. Иными словами, в рамках выбранной комбинированной теории можно записать и решить уравнения, характеризующие кинетику реакций и материальные балансы по субстратам, продуктам процесса и эффекторам реакций. Примером может служить приведенная выше система уравнений (9.66), основанная на модели типа изображенной на рис. 9.11 и уравнении Моно.

РИС. 9.13. Результаты экспериментального определения распределения времени пребывания газа в сосуде с перемешиванием (Δ). Сплошная кривая отвечает расчетным данным для того же распределения, полученным с помощью описанной в тексте комбинированной модели при указанны.х на рисунке значениях параметров. (Воспроизведено с разрешения из работы: Ророvіс М., Рараіехіои А., Reuβ М., Gas Residence Time Distribution in Stirred Tank Reactors, VI International Fermentation Symposium, London, Canada, 1980.)

 

При этом, однако, необходимо помнить о свойственных такому подходу ограничениях, поскольку даже если РВП комбинированной модели согласуется с РВП реального реактора, то в любом случае характеристики микросмешения и циркуляции для модели и реактора будут различными. Следовательно, комби нированная модель в некоторых случаях не может удовлетворительно описывать функционирование системы как реактора. Например, комбинированные модели типа изображенных на рис. 9.11 будут обеспечивать одно и то же РВП независимо от того, располагается ли трубчатый элемент полного вытеснения в начале или в конце системы, но в случае процесса с нелиней ной кинетикой расположение элемента полного вытеснения будет влиять и на параметры всей системы. Напротив, если все реакции и физические явления (например, массообмен) имеют первый порядок, то один и тот же результат будет получен независимо от положения элемента полного вытеснения.

Несмотря на указанные ограничения, комбинированные модели в некоторых ситуациях можно распространить и на такие процессы, в которых условия реакции пространственно неоднородны. Часто чисто интуитивно можно найти соответствие между различными идеальными компонентами комбинированной модели и реальными зонами и участками объема биореактора. Так, при обсуждении комбинированной модели, изображенной на рис. 9.11, мы уже отмечали, что один компонент модели может соответствовать зоне реактора, примыкающей к мешалке, а другой — остальному объему реактора. Если поток воздуха вводится в систему с помощью барботера вблизи мешалки, то можно допустить, что концентрация растворенного кислорода будет относительно высокой в первом элементе комбинированной модели, но сравнительно низкой во втором элементе и, соответственно, во всех удаленных от мешалки зонах жидкой фазы большого аппарата. Следовательно, в расчетах режимов работы реактора можно учитывать как результаты теоретической оценки различных сочетаний связанных реакторов, так и экспериментально найденные параметры условий процесса в различных зонах биореактора.

Для надежного моделирования процесса, осуществляющегося в однородных условиях, одних только данных о кинетике биологических превращений может оказаться недостаточно. К этой теме мы вернемся в следующем разделе. Возможность описания реальных крупномасштабных биореакторов с помощью модели с различными условиями реакций в различных идеальных элементах модели подсказывает один из подходов к решению проблемы обратного масштабного перехода. Под обратным масштабным переходом мы понимаем достаточно обоснованный метод разработки лабораторных экспериментов с целью моделирования и изучения функционирования больших неидеальных реакторов. Поскольку в лабораторных экспериментах с помощью ограниченного числа реакторов, насосов и соединительных устройств удается с достаточно хорошим приблилжением воспроизвести идеальные системы, особенно ПРПП, то такие эксперименты могут выполнять функции физической модеЛИ, отвечающей комбинированной математической модели. В отдельных небольших реакторах этой установки можно создать разные интенсивности перемешивания, степени аэрации, значения рН и другие условия и тем самым попытаться моделировать и изучить влияние изменение этих параметров на ход биологических процессов (в том числе на их кинетику) в больших аппаратах. Такой подход применим к изучению как реакторов периодического действия, так и проточных реакторов.

РИС. 9.14. Различные варианты модели на основе каскада последовательно соединенных реакторов: а — последовательные реакторы; б — последовательные реакторы с рециркуляцией; в — последовательные реакторы с обратным потоком.

 

Для моделирования каскадов реакторов и колонных реакторов, а также режимов перемешивания, приближающихся к режиму полного вытеснения, применяются различные типы комбинированных моделей с последовательно связанными идеальными ПРПП (рис. 9.14). Функции РВП для этих моделей можно определить с помощью уравнений материального баланса по индикатору в каскаде реакторов с перемешиванием путем определения распределения этого индикатора после его однократного импульсного введения. Если, как обычно, допустить, что общий объем системы V_R поделен между N равными по объему реакторами, т. е.

(9.69)

то после несложного математического анализа системы, схематично изображенной на рис. 9.14, а, получим:

(9.70)

Графики этой функции при различных N приведены на рис. 9.15. Нетрудно видеть, что при увеличении N функция E(t) изменяется от экспоненциально затухающей (N=1) до функции с резким максимумом при t=V_R/F(N=20).

Отклонение РВП, описываемого уравнением (9.70), равно:

(9.71)

Это уравнение полезно при разработке модели с последовательными ПРПП для произвольного сосуда, РВП которого определено экспериментально. Если принять, что общий объем каскада

РИС. 9.15. Кривые функции РВП для каскада пз N идеальных ПРПП (V_R — общий объем систе.мы, V_R/N — объем одного реактора).

 

ПРПП и скорость потока F равны соответствующим параметрам в реальном процессе, то среднее время пребывания для модели будет соответствовать среднему времени пребывания в реальном реакторе. Если, кроме того, принять N равным экспериментально найденному обратному отклонению РВП реального сосуда, то моменты второго порядка РВП модели каскада ПРПП и изучаемого сосуда также будут одинаковы. Модель с последовательными ПРПП, вероятно, будет удовлетворительно описывать функционирование реального реактора в том случае, когда кривая функции РВП этого реактора имеет ту же форму, что и кривые на рис. 9.15. (Напомним, что идентичные РВП гарантируют идентичные параметры работы реакторов только при полной сегрегации или в случае реакций первого порядка.) Обратите внимание на то, что при N→∞ РВП этой модели приближается к РВП реактора полного вытеснения.

На рис. 9.16 приведены результаты экспериментального изучения РВП в колонне с ситчатыми тарелками с параллельными потоками. Были выполнены две серии экспериментов, в которых колонна была разделена тремя тарелками на четыре секции, причем в первой серии тарелки имели отверстия диаметром 3 мм, а во второй — 2 мм, но общая поверхность отверстий составляла 10% поверхности тарелки в обоих случаях. Сравнение экспериментально найденных РВП с результатом, предсказываемым теорией при N=4 (рис. 9.16), показывает, что тарелки с отверстиями диаметром 2 мм обеспечивают удовлетворительную сегрегацию секций колонны.

РИС. 9.16. РВП, характеризующее структуру течений в колонне с ситчатыми тарелками и с параллельными потоками газовой и жидкой фаз; 1 — диаметр отверстий 3 мм, доля общей площади отверстий в тарелке 0,0981; 2 — диаметр отверстий 2 мм, доля общей площади отверстий в тарелке 0,0975; 3 — вычислено с помощью модели на основе каскада из 4 ПРПП. [Воспроизведено из статьи: Кеtаі А. et аі. Performance of a Perforated Plate Column as a Multistage Continuous Fermentor; Biotech, Bioeng., 11, 911 (1969).]

 

Очевидно, при большем диаметре отверстий в колонне наблюдается обратный поток через отверстия в тарелках. Таким образом, в данном случае изучение РВП может служить основой для выбора режима, обеспечивающего необходимую степень сегрегации в колонне.

Иногда введение в реактор растущей популяции микроорганизмов коренным образом меняет его РВП. Так, экспериментальное определение РВП для башни с 8 тарелками в отсутствие растущих организмов показало (рис. 9.17, а), что здесь проявляется четкий сегрегационный эффект. Если же в башне растет культура пекарских дрожжей, то найденное с помощью различных индикаторов РВП гораздо лучше соответствует одному идеальному ПРПП, чем каскаду из 8 ПРПП (сплошная кривая на рис. 9.17,6). Вероятно, исчезновение сегрегационного эффекта обусловлено осаждением дрожжевой суспензии.

 

РИС. 9.17. Определение РВП в колонне с 8 тарелками (доля общей площади отверстий в тарелке равна 0,15) различными методами и в различны.х условиях.

а — изучение с помощью солевого индикатора показывает, что повышение интенсивности аэрации уплощает и уширяет кривую распределения времени пребывания; б — колонна заполнена культурой дрожжей, а в качестве индикаторов использована меченая вода и меченые клетки. [Prokop А. et a/., Design and Physical Characteristics of a Multistage, Continuous Tower Fermentor; Biotech. Bioeng., 11, 945 (1969).]

Если в четырех тарелках колонны площадь отверстий будет составлять только 3%, то РВП колонны с растущей популяцией дрожжей будет практически таким же, что и в случае каскада из 4 ПРПП.

Теперь перейдем к изучению изображенных на рис. 9.14 каскадов ПРПП как биореакторов. Уравнение материального баланса по произвольному компоненту с в у'-м реакторе можно записать в следующем виде:

(9.72)

Если, например, мы рассмотрим рост культуры микроорганизмов в каскаде реакторов при условии нестерильности питательного вещества (х_f≠0), то уравнения материального баланса по биомассе для реакторов от 1- до N-го будут выглядеть следующим образом;

(9.73)

Решение этих уравнений дает;

(9.74)

и

(9.75)

Если объемы реакторов равны, то уравнение (9.75) упрощается:

(9.76)

Здесь D₁ — скорость разведения в каждом реакторе (D1=F!V₁).

Влияние сегрегационного эффекта и рециркуляции на скорость разведения в точке вымывания D_max можно оценить путем изучения системы, изображенной на рис. 9.14,6. Показано, что если кинетика клеточного роста подчиняется уравнению Моно с учетом метаболизма поддержания жизнедеятельности клеток [уравнение (7.22)], то при стерильной питательной среде, равных объемах реакторов и постоянстве экономического

коэффициента D_max удовлетворяет уравнению;

(9.77)

Здесь D, как обычно, выражено через параметры системы в целом:

(9.78)

Подстановка в уравнение (9.77) r = 0 дает выражение для критической скорости разведения в каскаде реакторов равных объемов без рециркуляции. Если, кроме того, принять k_e = 0, т. е. допустить, что кинетика клеточного роста описывается уравнением Моно в его первичной форме, то уравнение (9.77) упростится до уже известного нам выражения [ср. уравнение(7.16)]:

(9.79)

Такой результат можно было бы предполагать интуитивно; действительно, если вымывание происходит в первом из ряда последовательно соединенных реакторов равного объема, то культура будет вымываться и из всех последующих реакторов. (Что произойдет, если объемы реакторов не равны и если F>V_jD*_max при j=1, 2,…, k—1 и F< V_kD*_max?)

Теоретической модели каскада ПРПП с обратным потоком (рис. 9.14,0) близка дисперсионная модель, которая представляет собой модификацию модели идеального ТРПВ; в ней дополнительно учитывается процесс осевой диффузии, налагающийся на процесс конвективного потока через трубу. Для этого модель элементарного объема ТРПВ, изображенную на рис. 9.5, нужно дополнить членом, описывающим дисперсионный поток A(D_zdc/dz)_z; аналогичное слагаемое А(—D_zdc/dz)_z+Δz вводится в левую часть уравнения (9.13). Произведя описанные выше преобразования с учетом лимитирующих процессов, это уравнение можно перевести в следующее уравнение материального баланса по компоненту с дисперсионной модели:

(9.80)

В случае жидкостей и и коэффициент эффективной осевой дисперсии D_z обычно приблизительно постоянны и уравнение (9.80) принимает вид:

(9.81)

Поскольку (9.81) является дифференциальным уравнением второго порядка, необходимы два граничных условия. Обычно принимают следующие условия:

(9.82)

(9.83)

Если, как это часто бывает, D_z не слишком велико, то сложное условие (9.82) можно упростить:

(9.84)

В этом случае отклонение РВП дисперсионной модели будет равно:

(9.85)

Здесь осевое число Пекле Ре определяется как

(9.86)

С точки зрения физического смысла Ре можно рассматривать как отношение конвективной массопередачи (≈uc) к массопередаче за счет дисперсии (≈D_zc/L). Анализируя пределы уравнения (9.85), нетрудно найти, что при Ре→0, как и в случае отклонения РВП идеального ПРПП, σ²→1. При очень больших числах Пекле σ²→0, что отвечает режиму идеального вытеснения. Как и в случае моделей с каскадами реакторов, уравнение (9.85) можно использовать для определения числа Ре дисперсионной модели, если величина σ² найдена экспериментально. При условии, что кинетика клеточного роста описываетсяуравнением Моно с учетом метаболизма поддержания, скорость разведения в точке вымывания D_max для дисперсионной модели определяется уравнением:

(9.87)

Когда влияние дисперсии очень мало (Ре→0), то D_max уменьшается до нуля. Этот вывод согласуется с очевидным фактом: в идеальном ТРПВ не поддерживается существование популяции при условии стерильности исходных веществ.

Следует подчеркнуть, что коэффициент осевой дисперсии D_z обычно не равен коэффициенту молекулярной диффузии. D_z представляет собой модельный параметр, отражающий разносторонние эффекты ряда физических явлений. Из такого рода явлений мы упомянем три — ламинарное течение в трубах, турбулентное течение в трубах и течение в слоях насадки.

Если осевая и радиальная диффузия, характеризующаяся коэффициентом диффузии D, налагается на осевой конвективный перенос, обусловленный ламинарным течением, то можно показать, что коэффициент эффективной осевой дисперсии будет определяться уравнением;

(9.88)

Здесь u — средняя осевая скорость (u равно половине скорости в средней линии). Дисперсионная модель, D_z которой определяется уравнением (9.88), хорошо описывает РВП ламинарного потока с учетом диффузии для труб достаточно большой длины (L>>d_t²/40D).

При турбулентном течении в трубах (Re>2100) перенос масс, количества движения и энергии осуществляется главным образом путем движения макроскопических вихрей жидкой фазы. Влияние вихревого переноса напоминает влияние процессов молекулярной диффузии, но турбулентные потоки обычно гораздо более интенсивны. Следовательно, в этом случае коэффициент эффективной осевой дисперсии зависит главным образом от режима потока жидкой фазы. Число Пекле для турбулентного потока обычно равно примерно 3, но уменьшается при снижении числа Рейнольдса. Такое поведение турбулентных потоков, а также ряд данных, относящихся к ламинарным потокам, представлены на рис. 9.18. Одним из наиболее известных биологических трубчатых реакторов без насадки является, вероятно, проточный стерилизатор жидкостей, подробно рассматриваемый в следующем разделе.

В некоторых трубчатых реакторах применяется насадка из твердых частиц иммобилизованного фермента или иного биокатализатора. Частицы катализатора составляют неподвижный слой, и текущая по трубе жидкость омывает эти частицы. Поскольку жидкость течет в промежутках между твердыми частицами, то любой элемент жидкой фазы при осевом движении совершает также беспорядочные перемещения в радиальных направлениях. Влияние такого прерываемого твердыми частицами движения на РВП системы может быть описано с помощью дисперсионной модели. Теория предсказывает, что осевое число Пекле Pe_p, учитывающее диаметр частиц, т. е.

(9.89)

в данном случае равно приблизительно 2 (d_p — диаметр частиц). Это предположение в ряде случаев было подтверждено экспериментально, но, как показано на рис. 9.19, в общем случае Pe_p зависит от Sc и Re_p.

РИС. 9.18. Зависимость осевого числа Пекле (Ре) от чисел Рейнольдса (Re) и Шмидта (Sc) для течения жидкости в трубах.

 

В заключение нашего анализа процессов, связанных с дисперсией, следует отметить, что характер течения жидкостей может осложняться в результате влияния других факторов, например изгибов трубопроводов, изменений профиля рек и других водных потоков. В таких сложных случаях установить D_z расчетным путем не представляется возможным, и для определения этого параметра приходится опираться только на данные о РВП, найденные экспериментальным путем.

Описанные выше модели с каскадом последовательно соединенных реакторов и дисперсионного типа содержат по одному параметру (N и D_z соответственно) и описывают режимы неполного перемешивания. Каждая из этих моделей относится к определенному диапазону состояний смешения и сегрегации, начиная от идеального ПРПП и кончая идеальным ТРВП. Таким образом, в каждом конкретном случае мы должны выбрать модель определенного типа. С точки зрения удобства расчета и анализа модель каскада последовательно соединенных реакторов обычно намного выгоднее. Кроме того, применение дисперсионной модели при большом обратном смешении (σ²) обычно связано с рядом трудностей. С другой стороны, как показано на рис. 9.14, для описания режима, близкого к режиму полного вытеснения, необходимо очень большое число реакторов в каскаде.

РИС. 9.19. Зависимости осевого числа Пекле Ре_p от Re_p и Sc для течения в трубах с насадкой. Обратите внимание на то, что в выражения для критериев подобия в данном случае входит диаметр частиц d_p, а не диаметр трубы d_t.

 

По этой причине дисперсионная модель предпочтительнее при небольших отклонениях от режима полного вытеснения (например, при σ², равном или меньшем 0,05), а модель с каскадом последовательно соединенных реакторов точнее описывает режимы при существенном обратном смешении (σ²≥0,2). Последняя ситуация типична для ферментеров и бассейнов для биологической переработки отходов. Небольшие отклонения от режима полного вытеснения встречаются при непрерывной стерилизации жидкостей, которую мы рассмотрим позднее в этой же главе.

 

Взаимосвязь между перемешиванием и биологическими превращениями

Характер течений и явления переноса влияют на кинетику клеточных процессов в различных масштабах. Так, эффекты, проявляюш,иеся при определенных… Изучение начнем с анализа наибольшего масштаба, включающего циркуляцию всей… Для того чтобы оценить влияние циркуляции жидкой фазы с количественной стороны в более общем виде, а также чтобы…

Стерилизаторы

Жидкости, обычно водные растворы, можно стерилизовать несколькими методами, в том числе облучением (ультрафиолетовым или рентгеновским излучением),… Необходимые для разрушения жизнеспособных микроорганизмов и вирусов условия… Процессы с участием чистых культур, работа с культурами тканей и обработка некоторых пищевых продуктов требуют гораздо…

Периодическая стерилизация

Изучение процессов стерилизации мы начнем с анализа закрытого сосуда с полным перемешиванием, содержаш,его суспензию клеток или спор. Жидкость… (9.92) В это уравнение в явной форме включена зависимость температуры жидкости от времени. Путем разделения переменных в…

Таблица 9.5. Приближенные величины энергии активации некоторых нежелательных побочных реакций, происходящих при тепловой обработке

 

Непрерывная стерилизация

На рис. 9.24 схематично изображены два основных типа непрерывных стерилизаторов. В первом из них (рис. 9.24, а) нагревание осуществляется путем… Если допустить, что температура в каждой точке непрерывного стерилизатора… (9.107)

Иммобилизованные биокатализаторы

Работа биологического реактора в основном определяется свойствами применяющихся биокатализаторов. Ранее мы обсуждали различные методы и способы… Этот раздел мы посвятим в основном изучению катализаторов на основе… Прежде чем перейти к изучению методов иммобилизации клеток и некоторых экспериментов, выполненных к настоящему времени…

РИС. 9.26. Различные уровни сложности сети реакций, осуществляемых катализаторами на основе иммобилизованных клеток.

 

Таким образом можно повысить производительность процесса в какой-то мере независимо от скорости роста организмов. Если клетки полностью удерживаются в реакторе, то в силу отсутствия затрат питательных веществ и энергии на клеточный рост можно ожидать проявления полного спектра каталитической активности. В сущности в таких случаях клеточный рост часто вообще нежелателен, поскольку он может привести к снижению выхода необходимого продукта и поскольку накопление клеточной массы может нарушить гидродинамические и реологические свойства системы.

На самом низком уровне катализ иммобилизованными клетками сводится к проявлению активности одного или нескольких ферментов (без участия кофакторов). В этом случае иммобилизованные клетки выполняют ту же функцию, что и иммобилизованные ферментные катализаторы, и применение целых клеток целесообразно только с точки зрения снижения трудоемкости и стоимости процесса изготовления иммобилизованного катализатора. При использовании таких катализаторов следует, однако, учитывать трудности, связанные с дополнительным сопротивлением клеточной оболочки массопереносу и с возможностью расщепления необходимого фермента внутриклеточными протеазами. Впрочем, в других случаях нативное клеточное окружение может способствовать стабилизации некоторых ферментов.

Далее, нерастущие иммобилизованные клетки могут катализировать многостадийные превращения, включая стадии утилизации и регенерации кофактора. Если в системе присутствуютвсе кофакторы, ферменты, субстраты и регенерирующие вещества, то в общем случае связанные с этими каталитическими процессами биосинтетические реакции и клеточный рост не нужны;если к тому же в организме уже существует определенный путь метаболизма с участием кофакторов, то иногда целесообразно использовать этот естественный путь, а не пытаться создать другой механизм утилизации и регенерации кофактора.

На следующем по степени сложности каталитической активности уровне осуществляются процессы биосинтеза и поддержания жизнедеятельности клеток, но их рост и деление несущественны. Наконец, в самом сложном случае активна вся метаболическая сеть, клетки растут и делятся. В упоминавшихся выше реакторах периодического действия с участием культур иммобилизованных клеток, например, возникает каталитическая активность именно этого наивысшего уровня сложности. Такой же уровень каталитической активности иммобилизованных клеток иногда целесообразен и в реакторах непрерывного действия с регенерацией катализатора, поскольку некоторые организмы плохо реагируют на среду, которая не способствует росту, и в таких условиях быстро теряют активность. Как мы увидим в приведенных ниже примерах, чередование условий процесса с менее сложным уровнем каталитической активности клеток до режима полного роста представляет собой обычный прием, позволяющий продлить срок службы катализатора.

Катализатор, который выполняет необходимые каталитические функции, но не инициирует большое число побочных реакций, имеет два преимущества. Первое из них связано с увеличением выхода продукта. Если субстрат можно стехиометрически превратить в конкретный продукт определенного пути метаболизма микроорганизмов, избежав при этом клеточный рост или образование других конечных веществ, то выход необходимого продукта в таких условиях, очевидно, будет максимальным. Другое преимущество обсуждаемых катализаторов

заключается в более высокой общей скорости реакций. По мере усложнения каталитического процесса от простейшего одноферментного до наиболее сложного — полного клеточного роста (рис. 9.26)—резко возрастает и характерное время пребывания в реакторе, необходимое для существенного превращения субстрата. На одноферментном уровне скорости реакций определяются скоростями катализируемых ферментом отдельных элементарных стадий, которые обычно завершаются примерно за одну минуту. Напротив, время удвоения клеток, характеризующее время осуществления всей сети метаболических превращений, обычно составляет от нескольких часов до нескольких суток во всех случаях за исключением наиболее быстро растущих бактерий. Поэтому- по мере усложнения метаболических превращений (см. рис. 9.26) в общем случае значительно возрастает и время пребывания реакционной смеси в реакторе, необходимое для превращения значительной доли субстрата. Отсюда следует, что выгоднее использовать только ферменты и кофакторы, необходимые для данного превращения; если этот путь удается реализовать, то тем самым удается существенно сократить расчетное время пребывания компонентов в реакторе.

Закончив на этом изложение основ проблемы использования иммобилизованных клеток, перейдем теперь к изучению катализаторов на основе иммобилизованных клеток, методов их получения и изучения, а затем рассмотрим ряд примеров, иллюстрирующих различные области применения этих катализаторов,

 

Типы биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток и их свойства

 

В этом разделе мы рассмотрим методы, применявшиеся для иммобилизации клеток и изучения свойств полученных катали заторов, играющих важнейшую роль в процессах с их участием. Иммобилизация клеток чаще всего осуществляется путем их включения в полимерный носитель. В табл. 9.6 перечислены различные методы, применявшиеся для создания сшитых поперечными связями полимерных носителей. Гораздо чаще других применяется метод включения клеток в слой или в гранулу альгината (природного полисахарида) путем сшивки последнего ионными поперечными связями. Мягкие условия процедуры сшивки (в отличие от методов химической полимеризации) обеспечивают значительно более высокий уровень жизнеспособности иммобилизованных клеток. На рис. 9.27 представлена схема одной из методик получения сферических гранул альгината кальция, содержащих иммобилизованные клетки.

 

Таблица 9.6. Полимерные носители, применяющиеся для иммобилизации клеток

При выборе методики и конкретных условий включения в полимерный носитель необходимо учитывать и конечные свойства получаемого иммобилизованного катализатора. В табл. 9.7 перечислены некоторые основные свойства носителей, представляющие наибольший интерес с точки зрения процесса, в котором будет использоваться катализатор. На проницаемость носителя по отношению к субстратам, ингибиторам, продуктам реакции и другим компонентам среды могут влиять как химические, так и механические характеристики носителя. Так, например, механические свойства носителя могут налагать определенные ограничения на допустимую геометрию частиц катализатора.

 

Таблица 9.7. Важнейшие свойства полимерных носителей, применяющихся для иммобилизации клеток

Сжимаемость и другие механические свойства катализатора, не столь существенные в лабораторных экспериментах, могут оказаться чрезвычайно важными в крупномасштабных процессах. Гранулированные полисахаридные носители, широко использующиеся в лабораторных исследованиях благодаря своей высокой биосовместимости, мало подходят для крупномасштабного производства из-за большой сжимаемости и по этой причине их можно применять только в невысоких реакторах колонного типа. Точно так же неустойчивые к ударам иммобилизованные катализаторы непригодны в тех случаях, когда гранулы катализатора должны выдерживать соударения без истирания и разрушения (например, в реакторах с перемешиванием).

 

РИС. 9.27. Схема методики включения клеток в гранулы альгината.

Перечисленные в табл. 9.7 химические свойства носителей могут влиять на каталитическую активность иммобилизованных клеток непосредственно, т. е. путем воздействия на системы регуляции клеточного метаболизма, или опосредованно, через локальное окружение клеток. Если, например, полимерный носитель содержит токсичные вещества, то можно ожидать снижения активности клеток. Заряд, ионный состав и гидрофобные свойства носителя могут влиять на коэффициенты распределения компонентов реакционной смеси и тем самым вызывать изменение их концентрации в зонах непосредственного контакта с клетками по сравнению с концентрациями в жидкой фазе, не контактирующей с частицами катализатора.

Другой метод иммобилизации клеток состоит в их включении в полупроницаемые или пористые материалы. В качестве носителей для растущих микроорганизмов использовали очень мелкие сита из нержавеющей стали. Кроме того, как посевной материал для периодических процессов применяли споры плесневых грибов, включенные в автоклавированные гранулы пористого фильтрующего материала. Клетки также включали в макропористые зоны асимметричных полых волокон. Помимо указанных методов включения клеток в носители полная или частичная иммобилизация клеток, как мы уже не раз упоминали, может быть достигнута в масштабе всего реактора путем их рециркуляции.

 

Таблица 9.8. Примеры иммобилизации клеток путем связывания с поверхностью носителей

В альтернативном подходе относительно низкомолекулярные продукты выделяют из суспензии клеток методом диализа или ультрафильтрации с помощью помещенного в суспензию мембранного устройства; таким же путем можно вводить субстрат в суспензию клеток.

Клетки многих типов иммобилизовали путем адсорбции или ковалентного связывания с поверхностями твердых носителей. Примеры иммобилизованных клеток (от бактерий до клеток тканей животных) и соответствующих природных или синтетических носителей приведены в табл. 9.8. Другие сведения о методах иммобилизации читатель может найти в приведенной в конце главы литературе, а также в литературе, цитируемой в рассматриваемых ниже примерах.

 

Применение биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток

Рассматривая примеры, иллюстрирующие степень сложности процессов катализа с участием иммобилизованных клеток, мы начнем с самого простого случая и… РИС. 9.28. Инактивация аспартазы и фумаразы в суспендированных и иммобилизованных клетках. (Воспроизведено с…

Таблица 9.10. Примеры процессов биосинтеза, осуществляемых с помощью иммобилизованных клеток

Пока что в области применения иммобилизованных клеток для биосинтеза продуктов метаболизма и биополимеров успехи не очень велики. Это и не удивительно, если принять во внимание указанные выше осложнения и тот факт, что разработка методов осуществления многостадийных превращений, катализируемых иммобилизованными клетками, по сути дела, пока еще только начинается. В табл. 9.10 перечислены некоторые результаты экспериментального изучения методов биосинтеза ряда веществ с участием иммобилизованных клеток. В некоторых из приведенных примеров рост клеток был существенно ограничен, в других для расширения периода активной жизни клеток применялось чередование фаз полного клеточного роста и подавления роста, а в третьих рост клеток вообще не ограничивался. Разумеется, при росте клеток с некоторой ограниченной скоростью должны иметь место вымывание или лизис клеток, причем скорость этих процессов должна уравновешиваться скоростью клеточного роста; в противном случае не будет достигнуто стационарное состояние. При культивировании на твердых поверхностях клеток тканей животных регуляторные механизмы останавливают рост клеток примерно на стадии монослоя и затем переключают метаболизм с роста на образование продуктов метаболизма. Однако для достижения идеала — системы с иммобилизованными клетками, способной синтезировать сложные вещества с высокими выходом и скоростью в проточных реакторах, — нам еще предстоит исследовать множество проблем.

 

Биореакторы с многофазными системами

 

В биореакторах реакционная масса почти всегда состоит из нескольких фаз (клетки, малорастворимые субстраты или продукты процесса, газовые пузырьки или частицы катализатора); тем не менее, во многих случаях целесообразно приближенно описывать реакционную массу как практически гомогенную. В других случаях, однако, при расчете или анализе работы реактора важно принимать во внимание многофазную природу содержимого реактора. В этом разделе мы сосредоточим внимание именно на таких подходах к изучению реакторов и на некоторых методах математического описания многофазных систем.

 

Превращение нерастворимых субстратов

Превращение нерастворимых субстратов типично для процессов утилизации крахмала и целлюлозы, модификации стероидов, а также для роста микроорганизмов…   Пример 9.2. Расчет ПРПП для микробиологической переработки жидких углеводородов*.

Реакторы с неподвижным слоем биокатализатора

Колонны с насадкой иммобилизованного катализатора в настоящее время используются в нескольких промышленных процессах, и есть все основания полагать,… В простейшем и часто довольно успешно применяющемся математическом описании… (9.114)

Биореакторы типа барботажных колонн

Под биореакторами типа барботажных колонн мы подразумеваем реакторы с большим отношением высоты к диаметру,которые в отличие от реакторов с… В некоторых случаях применяют только одну колонну, которую иногда снабжают… В гл. 8 мы показали, что при достаточной плотности культуры быстро растущих аэробных организмов общая скорость…

Биореакторы с псевдоожиженным слоем катализатора

Процессы в псевдоожиженном слое катализатора обычно осуществляют в реакторах колонного типа, рассмотренных в предыдущем разделе, поэтому если такие… В башенном реакторе с псевдоожиженным слоем катализатора, например в… Биологические реакторы с псевдоожиженным слоем катализатора намного сложнее рассмотренных нами ранее ПРПП и ТРПВ.…

РИС. 9.31. Башенные ферментеры, применяющиеся в непрерывных процессах пивоварения. (Фотография любезно представлена компанией А. P. V. Co., Ltd.)

 

Так, вблизи зоны поступления исходных питательных веществ превращениям подвергаются

прежде всего легко ферментируемые сахара (глюкоза, фруктоза, сахароза, частично мальтоза), что приводит к снижениюплотности среды. В средней и верхней зонах башни скопления дрожжевых клеток мальтотриозу и отчасти мальтозу. Такая картина, характеризующаяся быстрыми реакциями в начальной стадии процесса и последующими более медленными реакциями с участием менее «удобных» субстратов, согласуется с экспериментальными данными, представленными на рис. 9.32.

Рудиментарная модель реакторов с псевдоожиженным слоем катализатора может быть разработана, если допустить, во-первых, что частицы биологического катализатора (хлопья скоплений микроорганизмов или частицы иммобилизованного фермента) однородны по форме и размерам; во-вторых, что плотность жидкой фазы является функцией концентрации субстрата; в-третьих, что движение жидкой фазы в реакторе осуществляется в режиме полного вытеснения; в-четвертых, что реакция утилизации субстрата имеет первый порядок по биомассе, но нулевой порядок по субстрату; в-пятых, что числа Рейнольдса частиц катализатора, рассчитанные по йх конечной скорости, достаточно малы, так что движение частиц может быть описано законом Стокса (вспомните пример 1.1). Четвертое и пятое допущения достаточно обоснованны во многих ситуациях; первое, второе и третье допущения в ряде случаев также могут быть оправданны.

РИС. 9.32. Рост дрожжей в реакторе колонного типа на смеси сахаров; в начале процесса субстраты утилизируются очень быстро (что отражается в изменении удельной плотности сусла), а затем следует период значительно более медленного усвоения Сахаров. (Из работы: Greenshield R. N., Smith Е. L., Tower-Fermentation Systems and Their Applications; The Chemical Engineer, May 1971, 182.)

 

При указанных допущениях скорость утилизации субстрата можно описать уравнением типа (9.15):

или

(9.121)

Если движение частиц (клеток) описывается законом Стокса, то зависимость концентрации суспендированной биомассы от скорости потока жидкости в псевдоожиженном слое должна подчиняться уравнению;

(9.122)

Здесь ρ₀ — плотность культуры микроорганизмов (масса сухого клеточного вещества в единице объема), а u_t — конечная скорость сферы в стоксовом потоке [уравнение (8.34)]. (Какую плотность биомассы — рассчитанную по сухой или влажной массе клеток — следует учитывать в формуле для определения конечной скорости?) Обратите внимание на то, что при анализе процессов в реакторах с псевдоожиженным слоем катализатора мы допускаем, что локальная концентрация биомассы определяется только гидродинамическими факторами. Этим рассматриваемые реакторы резко отличаются от реакторов других типов, в которых определяющую роль играют биохимические реакции и метаболизм организмов. Подстановка уравнения (9.122) в уравнение (9.121) приводит к выражению с двумя неизвестными s и u, величина которых зависит от положения z в реакторе.

Построение модели завершается применением уравнения (9.15) при условии, что r_f = 0:

(9.123)

Раскрыв уравнение (9.123) и подставив ρ(s) вместо ρ, получим

(9.124)

Чтобы перевести это уравнение в форму, пригодную для интегрирования в численной форме, рассмотрим уравнения (9.121) и (9.124) как систему алгебраических уравнений с неизвестными ds/dz и du/dz. Решение этой системы уравнений, приводить которое здесь полностью нет необходимости, дает выражения для ds/dz и du/dz, определяемые через переменные s и u, т. е. систему двух дифференциальных уравнений, которые следует интегрировать при начальных условиях:

(9.125)

Здесь A_f — площадь поперечного сечения нижней секции башни. Концентрация субстрата в продуктах процесса s_e зависит от высоты реактора L: s_e = s (z = L).

Положение существенно упрощается, если допустить, что любое изменение плотности жидкой фазы мало сказывается на величине и. Если и не зависит от положения в реакторе, то уравнение (9.121) можно проинтегрировать непосредственно и таким путем получить

(9.126)

Здесь L — высота башни; при выводе этого уравнения принималось, что x определяется уравнением (9.122). Отражаемая уравнением (9.126) линейная зависимость концентрации субстрата от среднего времени реакции L/u (если допустить, что ρ также линейно зависит от s) действительно наблюдается, по меньшей мере, на некоторых участках соответствующей кривой (рис. 9.32).

Как показывают данные, представленные на рис. 9.32, основным недостатком этой модели является обезличивание субстратов. Действительно, в обсуждаемой модели различные сахара, утилизируемые в ходе анаэробного спиртового брожения, сгруппированы в некий гипотетический единый или средний субстрат. При таком подходе мы лишены возможности учесть эффект глюкозы, играющий очень важную роль в процессах пивоварения в башенных ферментерах непрерывного действия.

Что касается потока жидкой фазы через псевдоожиженный слой, то обычно желательно поддерживать режим полного вытеснения. Нестабильная структура течений в слое в ряде случаев может вызывать существенное обратное смешение, нарушающее ход процесса и нормальную работу реактора. Вероятность обратного смешения возрастает при уменьшении диаметра колонны и снижении скорости потока жидкой фазы. В то же время в биореакторах с псевдоожиженным слоем катализатора в силу малых размеров его частиц и небольшого различия между плотностями жидкой фазы и катализатора приходится ограничиваться относительно невысокими линейными скоростями потока жидкости. Кроме того, при понижении скорости потока жидкой фазы повышается концентрация катализатора в реакторе. Показано, что введение в биореактор с псевдоожиженным слоем катализатора статических элементов перемешивания может значительно улучшить характеристики расширения слоя и снизить нежелательное обратное смешение [44].

Поскольку реакторы с неподвижным слоем катализатора в общем случае ближе к реакторам полного вытеснения, может возникнуть вопрос о целесообразности и преимуществах биореакторов с псевдоожиженным слоем катализатора. Прежде всего, преимущества реакторов с псевдоожиженным слоем очень ярко проявляются при необходимости контакта реакционной смеси с газами. В реакторах с неподвижным слоем катализатора довольно трудно добиться эффективной аэрации (особенно при большом объеме реактора), а если в ходе процесса образуются газообразные продукты, например СО₂, то нелегко и предупредить избыточное накопление газа в верхней части реактора с неподвижным слоем. Реактор с псевдоожиженным слоем катализатора обеспечивает режимы течений, в большей степени способствующие межфазному контакту в системе газ — жидкость — твердое тело. Хороший контакт между газовой и жидкой фазами, с одной стороны, и биокатализатором, с другой, обеспечивают также реакторы со струйным течением жидкости, которые мы и рассмотрим в заключение этого раздела.

 

Реакторы с неподвижным слоем катализатора и со струйным течением жидкости

Содержимое реакторов с неподвижным слоем катализатора и струйным течением жидкости представляет собой трехфазную систему, состоящую из неподвижного… К числу важных характеристик таких реакторов и содержащихся в них систем… Одной из первых областей применения биореакторов с насадкой и струйным течением жидкости, сохраняющей свое значение и…

Технология микробиологических процессов

Для того чтобы получить некоторое представление о различных практических аспектах расчета и эксплуатации биореакторов, а также об осуществляемых в… На рис. 9.34 представлена схема важнейших этапов типичного…  

РИС. 9.34. Основные этапы и операции типичного аэробного микробиологического процесса.

 

Подбор состава среды

При подборе необходимого для определенного микробиологического процесса состава среды следует принимать во внимание множество факторов. Один из них…   Таблица 9.12. Элементный состав различных микроорганизмова

Проектирование типичного асептического аэробного микробиологического процесса и его ведение

Большинство промышленных микробиологических процессов имеют те или иные общие черты, однако на практике появляются существенно различающиеся проекты… В этом разделе основное внимание будет уделено способам поддержания… Подготовка посевного материала сводится к пролиферации небольшого числа клеток в строго контролируемых условиях до…

Биореакторы других типов

В табл. 9.13 перечислен ряд факторов, стимулировавших разработку новых типов и конструкций биореакторов. Многие из этих факторов сыграли свою роль…   Таблица 9.13. Факторы, оказавшие влияние на разработку реакторов новых типов [50]

Особенности технологии процессов с участием растительных и животных клеток и соответствующих реакторов

В настоящее время культуры животных клеток используются для производства ряда ценных продуктов, в том числе вакцин, протеолитического фермента… Многие полезные и интересные вещества в принципе можно синтезировать в…

Культивирование животных клеток; требования к среде

По сравнению с микроорганизмами для культивирования животных клеток требуются более сложные и дорогие среды. Обычно для предотвращения заражения в… Вместе с тем использование сыворотки для культивирования животных клеток не…

РИС. 9.40. Культивирование клеток с применением в качестве одного из компонентов среды профильтрованной лимфы крупного рогатого скота. (Воспроизведено с разрешения Bio-Response, Inc.)

 

На рис. 9.40 представлена схема недавно предложенного иного подхода к снижению стоимости сложных компонентов среды. В этом методе цельную лимфу живой коровы фильтруют и вводят в камеру клеточного роста, где лимфа через полупроницаемые полые волокна контактирует с клетками. На рисунке указано также положение устройств для введения других компонентов среды и газообмена.

Большие успехи достигнуты в создании бессывороточных сред определенного гормонального состава. К потенциальным преимуществам таких сред относятся возможность регулирования состава среды в соответствии с особенностями клеток данного типа и условий культивирования, снижение опасности заражения, лучшая воспроизводимость результатов. С другой стороны, подобные среды определенного состава имеют более высокую стоимость и к тому же могут оказывать то или иное воздействие на организмы, которое проявляется лишь спустя некоторое время и которое трудно предвидеть заранее или обнаружить в ходе сравнительно кратковременных экспериментов по подбору состава среды.

Животные клетки не имеют типичных для микроорганизмов клеточных стенок, обеспечивающих механическую прочность; кроме того, животные клетки обычно значительно крупнее клеток микроорганизмов. Поэтому на любое механическое воздействие на культуру животных клеток (перемешивание суспензии клеток или частиц носителей, содержащих клетки на поверхности или во всем объеме, с целью поддержания однородности реакционной массы или ускорения переноса кислорода к клеткам) должны налагаться определенные ограничения. Для культур животных клеток концентрация кислорода должна составлять приблизительно 25—40% от концентрации кислорода в насыщенной воздухом системе, поэтому проектирование систем подачи кислорода в большой объем культуры животных клеток всегда представляет собой сложную инженерную проблему. Жесткие требования, предъявляемые к насыщению системы кислородом, могут быть несколько смягчены благодаря низким скоростям роста животных клеток и протеканию метаболических процессов в клетках.

При типичной плотности культуры, составляющей 10⁶ клеток в 1 мл, потребность в кислороде составляет 0,05—0,6 ммоль О₂ на литр культуры в час. В небольших сосудах, обычных для лабораторных экспериментов, потребность в кислороде может быть удовлетворена за счет диффузии кислорода из газовой смеси, находящейся над поверхностью жидкости, в жидкую фазу. При переходе к реакторам большего объема такой механизм переноса кислорода уже не может обеспечить потребность культуры в кислороде. Иногда в таких случаях с успехом применяется прямой барботаж газа в жидкую фазу. В других ситуациях непосредственный барботаж повреждает клетки и может вызвать интенсивное пенообразование, особенно если в состав среды входит значительное количество сыворотки. Для насыщения культуры животных клеток кислородом предлагался и другой метод, заключающийся во введении в культуру силиконовых трубок, через стенки которых кислород диффундирует в среду, не образуя пузырьков. Общий коэффициент массопередачи кислорода через стенку силиконовой трубки составляет около 0,35 ммоль 02/(атм·см²·ч); по этой величине можно рассчитать необходимое количество трубок. По мере увеличения масштаба процесса возможность обеспечения культуры кислородом с помощью силиконовых трубок становится все более и более проблематичной.

В относительно хорошо отработанных технологических процессах с участием культур животных клеток рН культуры постоянно контролируется и поддерживается на постоянном уровне, обычно около 7,0. К настоящему времени накоплен лишь очень небольшой опыт работы с культурами животных клеток в реакторах, снабженных всеми необходимыми контрольно-измерительными приборами, обеспечивающими получение наиболее полного набора аналитических данных и самые разнообразные методы контроля. Как мы увидим в следующей главе, многие контрольно-измерительные приборы и методы, которые находят применение при работе микробиологических реакторов, в будущем можно будет использовать и для оптимизации работы реакторов с культурами животных клеток.

Регулирование рН культуры клеток осуществляется несколькими способами. Введение в состав среды компонентов с буферными свойствами может сглаживать флуктуации рН, часто обусловленные продуцируемой клетками молочной кислотой. Величиной рН среды можно также управлять путем изменения концентрации СО₂ в газовой фазе, находящейся в контакте с культурой. Другим методом регулирования рН является непосредственное добавление основания. Флуктуации рН в реакторах могут быть сглажены и путем постоянной или периодической замены среды в реакторе на свежую.

 

Промышленные реакторы для крупномасштабных процессов с участием животных клеток

Все животные клетки по способности к росту в суспензии можно разделить на две группы. Так, клетки крови, лимфы, опухолевой ткани и многие… По своей конструкции многие реакторы, предназначенные для культивирования… В случае культур животных клеток понятие о крупномасштабном процессе приобретает несколько иной смысл. В силу высокой…

Культивирование растительных клеток

Растительные ткани, выделенные из внутренних частей органов растений, после промывки и дезинфекции можно культивировать на агаре в соответствующей… РИС. 9.45. Сравнение методов получения моноклональных антител в периодическом процессе (б) и в периодическом процессе…

Заключение

 

В этой главе мы рассмотрели основы расчета и проектирования реакторов и основные принципы соответствующих технологий, которые находят применение в настоящее время и, возможно, будут использоваться в будущем для производства тех или иных продуктов с помощью микроорганизмов или клеток высших организмов. Мы попытались показать, как на основе данных о кинетике биологических процессов и параметров, характеризующих течения и перемешивание в реакторе, можно составить математическое описание процесса, пригодное для его расчета и оптимизации. Такой традиционный и успешно применявшийся в классической химической технологии подход к решению проблем технологии химических реакций уходит своими корнями в химическую и нефтеперерабатывающую промышленность. К сожалению, вследствие отсутствия достаточного количества данных о кинетике биологических превращений, применения сложных сред с неопределенным составом и непредсказуемыми эффектами, использования реакторов с нечетко определенными структурой течений и параметрами перемешивания, а также в силу того, что до сих пор не проводилось комплексных работ по поиску более систематических универсальных и надежных методов расчета биореакторов, разработанные с помощью описанной в этой главе систематической методологии режимы работы биореакторов и спецификации соответствующих проектов встречаются крайне редко. Масштабирование биопроцессов чаще всего осуществляют в нескольких последовательных экспериментах с постепенным увеличением масштаба (что, естественно, приводит к удорожанию проектных работ), причем масштабы последовательных экспериментов гораздо меньше отличаются один от другого, чем в случае аппаратов и процессов химической технологии. При разработке биологического реактора периодического действия в настоящее время основная задача, скорее всего, будет заключаться в обеспечении необходимой скорости массопереноса, а не в расчете оптимального режима работы реактора на основе данных о кинетике процесса.

Опыт работы отраслей промышленности, в которых широко применяются методы химической технологии, показывает, что за счет оптимизации процессов можно добиться существенного снижения капитальных вложений и эксплуатационных расходов, уменьшения количества побочных продуктов и повышения выхода основного продукта. Кроме того, в нефтеперерабатывающей промышленности благодаря хорошо разработанной теории процессов и аппаратов масштаб процесса можно обычно увеличивать в 10 000 раз, что соответствует непосредственному переходу от лабораторной установки к крупномасштабному аппарату. Поскольку в ближайшем будущем откроется возможность получения многих новых продуктов с помощью новых организмов и новых процессов, мы вправе надеяться на развитие технологии биохимических процессов, что позволит обеспечить большую эффективность масштабирования, проектирования к эксплуатации биореакторов. Это в свою очередь будет способствовать повышению их надежности и ускорению экономически оправданного внедрения биопроцессов в промышленность.

Следующая глава будет посвящена знакомству с контрольно-измерительной аппаратурой для биореакторов. Отсутствие данных о явлениях переноса основных компонентов системы и химических процессах в реакторе ограничивают число методов контроля для установления оптимального режима работы реактора. Хотя в следующей главе основное внимание будет уделено контролю и регулированию процессов в емкостных реакторах, большая часть рассматриваемых контрольно-измерительных приборов может с тем же успехом применяться и для аппаратов с восходящим или нисходящим потоком. Закончив изучение контрольно-измерительной аппаратуры, мы перейдем к рассмотрению основных процессов разделения, позволяющих превратить выходящий из биореактора поток смеси веществ в достаточно чистый целевой продукт.

 

Упражнения

9.1. Анализ ПРПП. а) Проверьте справедливость всех приведенных в табл. 9.1. уравнений, описывающих процессы в ПРПП. б) Как с помощью соответствующих графиков можно определить все параметры,… 9.2. Анализ ТРПВ. а) Проверьте справедливость приведенных в табл. 9.2 выражений путем их интегрирования.

РИС. 9У17.1. Ход периодического процесса биосинтеза пенициллина во времени.

9.16. Каскад реакторов; переработка углеводородов. Предположим, что в вашем распоряжении имеется кривая, описывающая изменение скорости клеточного роста в периодическом процессе переработки углеводородов с помощью микроорганизмов; этот процесс очень живо описан Мимурой и др. (разд. 8.8). В упражнении 8.11 вы определяли возможные лимитирующие процесс сопротивления на каждой из его фаз. Ваща компания рещила (в ваше отсутствие) расширить масштаб производства, дополнив установку п последовательно соединенными реакторами, где п—число реакторов, равное числу фаз с определенной структурой системы клетка — пузырек — субстрат (рис. 8.14). Найдите лимитирующие процесс сопротивления для каждой фазы и обсудите (учитывая количественные аспекты), как можно осуществить масштабный переход от лабораторной к промышленной установке, если рабочий объем или потребляемая мощность, или другие параметры последней превосходят соответствующие параметры лабораторной установки в 5000 раз.

9.17. Производство пенициллина. Приведенные на рис. 9У17.1 данные относятся к процессу синтеза пенициллина в культуре Репісіllіum chrysogenum. Эксперимент проводили в реакторе периодического действия с полным перемешиванием объемом 10 л, при объемной скорости аэрации 0,2 объема газа на объем ферментера в минуту. Начальный состав среды, в которой осуществляется рост культуры и биосинтез пенициллина (в г/л); КН₂РО₄ — 3,0; Na₂SO₄ —0,9; MgCl₂ —0,25; MgSO₄·H₂O — 0,05; глюкоза—10; NH₄CI —2. Кроме того, в ходе процесса в среду постоянно вводили глюкозу, а рН регулировали добавлением NH₄OH. Бензилпенициллин имеет брутто-формулу C₁₆H₁₈N₂O₄S.

а) Объясните характер изменения концентраций биомассы, пенициллина, глюкозы и NH₃ в этом периодическом процессе.

б) Совершенно неожиданно биосинтез пенициллина резко прекратился, хотя организм был способен синтезировать еще в 5 раз больше пенициллина, чем было накоплено в системе к моменту прекращения синтеза. Как главного консультанта компании Antibiotics Unlimited. Ltd., вас попросили найти причину прекращения синтеза пенициллина.

9.18. Полупериодические процессы. В общем случае поддерживать низкую, строго контролируемую скорость поступления питательных веществ в реактор труднее, чем периодически добавлять субстрат, одновременно отбирая равный объем культуральной жидкости. Допустим, что рост микроорганизмов лимитируется одним субстратом в соответствии с уравнением типа уравнения Моно и что скорость клеточного роста пропорциональна скорости изменения концентрации субстрата. Пусть процесс начинается при t=0 (т. е. продолжительность лаг-фазы пренебрежимо мала). В момент времени t из ферментера (с объемом жидкой фазы V) отбирают объем V₁ и добавляют точно такой же объем свежей питательной среды с концентрацией субстрата s_f.

а) Покажите, что в момент времени t (до отбора V₁) концентрация субстрата s описывается уравнением:

б) В момент времени t отбирают объем V₁, добавляют свежую питательную среду, после чего процесс возобновляется. Выразите s₀, x₀ через s, xt.

в) Покажите также, что эффективность утилизации субстрата описывается выражением

где φ= V₁/V.

г) Покажите, что при φ→0 эффективность утилизации субстрата становится такой же, как и в случае непрерывной культуры:

где V_t/V₁ — обратная скорость разведения.

д) Покажите графически, что при s_f/K_s = 1,0 и конечном значении φ (при периодическом добавлении свежей среды) параметр β больше, чем для проточного реактора, если (μ_mVt/Vi)>4.

9.19. Культура тканевых клеток в псевдоожиженном слое. Непрерывные культуры тканевых клеток предлагалось выращивать в псевдоожиженном слое на непористом гранулированном носителе (рис. 9У19.1). При этом питательная среда движется снизу вверх, поддерживая носитель в суспендированном состоянии, выходит из реактора через ситчатый фильтр, задерживающий гранулы носителя, и затем поступает в насос. Если разность плотностей гранул носителя и воды невелика, то процесс может идти и при невысокой объемной скорости жидкой фазы, и тогда насос не повреждает содержащиеся в ней макромолекулы. Допустим, что жидкая фаза движется в режиме полного вытеснения и что гранулы носителя полностью диспергированы во всем объеме реактора. Гранулы, проходящие через выходную воронку, осаждаются на ней и постоянно отбираются; выходящая из реактора жидкая фаза после фильтрования вновь поступает в реактор.

а) Допустим, что приведенные на рис. 9У19.2 данные отражают кинетику клеточного роста на каждой грануле, причем μ=0 при t>160 ч [вследствие завершения образования монослоя клеток (контактное ингибирование)]. Найдите выражение, описывающее концентрацию биомассы, отнесенную к одной грануле, на выходе из реактора через объем пустот в псевдоожиженном слое ε, скорость введения в реактор инокулированных гранул носителя (Z ч^-1), объем реактора V_R и соответствующее уравнение скорости клеточного роста.

РИС. 9У19.1. Биореактор с псевдоожиженным слоем микроносителя для процессов с участием культур клеток тканей.

 

Примите, что начальная концентрация клеток на гранулах равна c₀ (в расчете на одну гранулу).

б) Повторите решение предыдущего упражнения для случая, когда концентрация клеток на поступающих в реактор частицах носителя характеризуется распределением типа:

 

Вероятность нахождения у клеток на одной грануле=

где А — нормализующий фактор.

в) Предложите конструкцию системы, обеспечивающей «непрерывную» подачу в реактор свежих гранул носителя и непрерывную регенерацию жидкой среды в стерильных условиях.

9.20. Ингибирование роста культур тканевых клеток носителем. Экспериментально показано, что твердые носители в высоких концентрациях (см²/см³) могут ингибировать клеточный рост в силу адсорбции на поверхностях этих носителей факторов роста и сывороточных белков из среды, причем адсорбированные белки не могут взаимодействовать с клетками [Horng С. В., McLimens W., Biotech. Bioeng., 17, 713 (1975)]. Рассмотрим реактор с полным перемешиванием, содержащий культуру клеток тканей на микроносителе, частицы которого равномерно распределены в жидкой фазе.

а) Найдите выражение, описывающее изменение общего количества биомассы в системе во времени, если рост клеток подчиняется логарифмическому закону (все питательные вещества присутствуют в избытке) до тех пор, пока на всей доступной поверхности частиц носителя не образуется монослой клеток (см. рис. 9У19.2).

РИС. 9У19.2. Изменение количества клеток и титра вируса во времени, и — зависимость c_t/c₀ от времени (c_t и с₀ — концентрация связанных с носителем клеток в момент времени t и при t=0 соответственно; ―— 75%-ное насыщение О₂;---5%-ное насыщение О₂); б — зависимость TCID₅₀ от времени(TCID₅₀ — доза вирусов, приводящая к 50%—ному заражению культуры ткани в 1 мл; —— начальная концентрация клеток 13·10⁵ в 1 мл;---начальная концентрация клеток 3,5·10⁵ в мл). (Из статьи; van Wezel А. L., Microcarrier Cultures of Animal Cells, in Tissue Culture: Methods and Applications, p. 372, Academic Press, Inc., New York, 1973.)

 

6) Теперь допустим, что скорость роста клеток зависит от концентраций фактора роста s_g, не расходующегося в процессе роста, и что зависимость скорости клеточного роста от s_g описывается уравнением типа уравнения Моно. Выведите аналогичное уравнение для зависимости количества биомассы от времени, если фактор роста обратимо адсорбируется на твердой поверхности (и при этом обратимо инактивируется) и если процесс адсорбции описывается линейным уравнением:

в) Покажите, что при конечном времени существования периодической культуры (например, 6 сут) существует оптимальная величина начальной загрузки носителя в посевной материал культуры клеток ткани, если в конце концов рост клеток прекращается из-за отсутствия свободной поверхности носителя, Выведите уравнение, с помощью которого можно определить эту величину.

г) Поскольку частицы носителя в известном смысле выполняют роль ингибитора клеточного роста, казалось бы, в этом случае целесообразно вместо одного реактора использовать каскад реакторов. С какими трудностями столкнется экспериментатор, если он приступит к изучению системы с каскадом реакторов?

9.21. Деацилирование пенициллина V; реакции, протекающие по нескольким направлениям.Фермеи.тативное деацилирование пенициллина V (феноксиметилпенициллнна) до 6-аминопенициллановой кислоты (6-АРА; гл. 12), являющейся исходным веществом для получения полусинтетических пенициллинов, включает следующие последовательные и параллельные реакции:

Существует некоторое оптимальное для этого процесса значение рН, поскольку протонирование Р^- приводит к стабильному соединению HP, однако дальнейшее повышение кислотности снижает скорость первой реакции r₁.

а) Допустим, что скорость первой реакции r₁ можно описать уравнением Михаэлиса — Ментен с учетом неконкурентного ингибирования протонами, а r₂ и r₃ можно выразить через простые уравнения скорости необратимой реакции первого порядка. Запишите эти уравнения, а также уравнения, описывающие скорости двух последних (предположительно обратимых) процессов.

б) Выведите уравнение для стационарного режима в ПРПП с полной рециркуляцией фермента, описывающее концентрацию А^- в исходной смеси, при которой обеспечивается максимальная степень превращения А^- в Р^-.

в) Для обеспечения очень высокой степени превращения дорогого исходного вещества представляется целесообразным применение каскада из нескольких ПРПП. Обсудите преимущества и недостатки такой системы; приведите соответствующие расчеты. Считайте, что величины r₂ и r₃ составляют примерно 2—5% от скорости r₁ в первом реакторе. [Karlsen L. G., Villadsen J., Optimization of a Reactor Assembly for the Production of 6-APA from Penicillin V; Biotech. Bioeng., 26, 1485 (1984).]

9.22. Производительность реактора с полыми волокнами. Реакторы различных типов резко отличаются друг от друга по плотности микроорганизмов и производительности. Так, например, по сравнению с реактором с суспензионной культурой в реакторе с полыми волокнами достигается в 5 раз меньшая удельная β-лактамазная активность:

а) Вычислите производительность реактора каждого типа (в единицах ферментативной активности в объеме реактора за 1 ч), если концентрация биомассы в реакторе с полыми волокнами в 1000 раз выше, чем в реакторе с суспендированной культурой. Примите, что концентрация биомассы x в сосуде с перемешиванием (встряхиванием) равна 10⁹ клеток/мл.

б) Считается, что выход β-лактамазы несколько повышается за счет лизиса клеток в полых волокнах и секреции белка. Объясните, как бы вы определили параметры кинетики лизиса клеток, чтобы затем с помощью этих параметров описать процесс образования β-лактамазы путем секреции и лизиса. [Inloes D. S. et al.. Hollow Fiber Membrane Bioreactors Using Immobilized E. coli for Protein Synthesis; Biotech. Bioeng., 25, 2653 (1983).]

9.23. Образование не связанного с клеточным ростом продукта жизнедеятельности в периодическом процессе. Периодический микробиологический процесс обычно включает фазы роста биомассы и образования продукта жизнедеятельности клеток, причем субстрат утилизируется в каждой из фаз. Предположим, что рост периодической культуры описывается логистическим уравнением, а x_max соответствует решению такого уравнения при начальной концентрации второго субстрата s₂ (не используемого для образования продукта метаболизма). Тогда для процесса образования не связанного с клеточным ростом продукта жизнедеятельности микроорганизмов (например, L-глутамата в культуре Micrococcus glutamicus) можно записать

а) Путем интегрирования каждого из указанных уравнений найдите выражения, описывающие зависимости x(t), p(t) и s(t).

б) Обсудите, как вы смогли бы найти x_max, если вам необходимо добиться максимальной величины p(θ) или p(θ)/Δs(θ), где θ — известное время окончания процесса ферментации.

в) При каких обстоятельствах вы бы стали искать максимум p(θ) и при каких — максимум p(θ)/Δs(θ)?

 

Литература

 

Довольно много сведений о проектировании и анализе реакторов содержится в литературе, приведенной в гл. 7.

 

Дополнительные данные можно найти в следующих источниках:

1. Levenspiel О., Chemical Reaction Engineering, 2d ed., John Wiley and Sons,. Inc., New York, 1972. Эта книга, возможно, является лучшей монографией по проблемам перемешивания и распределения времени пребывания; в то же время здесь рассматриваются и многие другие вопросы проектирования реакторов. Имеется перевод первого издания этой книги; Левеншпиль О., Инженерное оформление химических процессов. — М.: Химия, 1969.

2. Smith J. М., Chemical Engineering Kinetics, 2d ed., McGraw-Hill Book Company, New York, 19'70. Одна из наиболее популярных книг в этой области; ее достоинством является множество конкретных примеров, рассмотренных в применении к реальным реакторам.

3. СаrЬеrrу J. Chemical and Catalytic Reaction Engineering, McGraw-Hill Book Company, New York, 1976. Книга очень информативна; особое внимание в ней уделяется гетерогенному катализу и многофазным реакторам.

4. Нill С. е., Jr., An Introduction to Chemical Engineering Kinetics and Reactor Design, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1977. Здесь хорошо представлены многие темы, начиная от проблем кинетики и кончая технологией реакторов.

 

В перечисленных ниже источниках широко трактуются многие вопросы проектирования и анализа биореакторов:

5. Аткинсон Б., Биологические реакторы. — М.: Пищевая промышленность, 1979.

6. Erickson L е., Stephanopoulos G., Biological Reactors, Chap. 13 in Chemical Reaction and Reactor Engineering, Carberry J. J., Varma A. (eds,), Marcel Dekker, Inc., New York, 1985.

 

Влияние пристеночного роста на работу биологических реакторов рассмотрено в статье:

7. Howell J. А., Chi С. Т., Pawlowsky U., Effect of Wall Groth on Scale-Up Problems and Dynamic Operating Characteristics of the Biological Aerator; Biotech. Bioeng., 14, 253 (1972).

 

Хорошие обзоры по проблеме масштабов времени и длины и ее роли в проектировании реакторов даны в статьях:

8. Kossen N. W. F., Models in Bioreactor Design, p. 23 in Computer Applications in Fermentation Technology, Society of Chemical Industry, London, 1982.

9. Roets J. A., Mathematical Models and the Design of Biochemical Reactors; J. Chem. Tech. Biotechnol., 32, 59 (1982).

 

Элементарная теория устойчивости и динамика реакторов рассмотрены в статьях:

10. Amundson N. R., Aris R., An Analysis of Chemical Reactor Stability and Control, Parts I—III; Chem. Eng. Sci., 7, 121 (1958).

11. leffreson C. P., Smith J. M., Stationary and Nonstationary Models of Bacterial Kinetics in Well-Mixed Flow Reactors; Chem. Eng. Sci., 28, 629 (1973).

12. Ramkrishna D., Fredrickson A. G., Tsuchiya H. M., Dynamics of Microbial Propagation: Models Considering Inhibitors and Variable Cell Composition; Biotech. Bioeng., 9, 129 (Ш67).

13. Lee S. S., Jackman A. P., Schroeder E. D., A Two-State Microbial Growth Kinetic Model; Water Res., 9, 491 (1975).

14. Young T. В., Brutey D. F., Bungay H. R., Ill, A Dynamic Mathematical Model of the Chemostat; Biotech, Bioeng., 12, 747 (1970).

 

Проблемы, связанные с неидеальным перемешиванием в реакторах, освещаются в следующих источниках:

15. Nagata S., Mixing: Principles and Applications, Wiley, New York, 1975.

16. Shinnar R., Residence Time and Contact Time Distributions in Chemical Reactor Design, in Chemical Reaction and Reactor Engineering, Carberry J. J., Varma A. (eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, 1985.

17. Villermaux Mixing in Chemical Reactors, p. 135 in Chemical Reaction Engineering —Plenary Lectures, Wei J., Georgakis C. (eds.), American Chemical Society, Washington, D.C,, 1983.

18. Charles M., Technical Aspects of the Rheological Properties of Microbial Cultures, p. 1 in Advances in Biochemical Engineering, vol. 8, Ghose T. K., Fiechter A., Blakebrough N. (eds.), Springer-Verlag, New York. 1978.

19. Bryant J., The Characterization of Mixing in Fermenters, p. 101 in Advances in Biochemical Engineering, vol. 5, Ghose T. K., Fiechter A., Blakebrough N. (eds.), Springer-Verlag, New York, 1977.

20. Zweitering Th. N., The Degree of Mixing in Continuous Flow Systems; Chem. Eng. Sci,, 11, 1 (1959).

21. Popovic M., Papalexiou A., Reuss M., Gas Residence Time Distribution in Stirred Tank Bioreactors; Chem. Eng. Sci., 38, 2015 (1983).

 

Модели нендеальных реакторов:

22. Sinclair С. G., Brown D. E., The Effect of Incomplete Mixing on the Analysis of the Static Behavior of Continuous Cultures; Biotech. Bioeng., 12, 1001 (1970).

23. Gschwend K., Fiechter A., Widmer F., Oxygen Transfer in a Loop Reactor for Viscous Non-Newtonian Biosystems; J. Ferment. Technol., 61, 491 (1983).

 

Взаимосвязь между перемешиванием и биореакцией:

24. Vardar F., Problems of Mass and Momentum Transfer in Large Fermenters; Process Biochem., 18, 21 (1983).

25. Ujcovd E., Fend Z., Musi'lkovd M., Seichert L., Dependence of Release of Nucleotides from Fungi on Fermentor Turbine Speed; Biotech. Bioeng., 22, 237 (1980).

26. van Suihdam I. C., Metz В., Influence of Engineering Variables upon the Morphology of Filamentous Molds; Biotech. Bioeng., 23, 111 (1981).

27. Wang D. I. C., Fewkes R. C. Effect of Operating and Geometric Parameters on the Behavior of Non-Newtonian, Mycelial, Antibiotic Fermentations; Devel. Ind. Microbiol., 18, 39 (1977).

28. Vardar F., Lilly M. D., Effect of Cycling Dissolved Oxygen Concentrations on Product Formation in Penicillin Fermentations; European J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 14, 203 (1982).

 

Вопросы теплопроводности в неустановившемся состоянии в твердых телах рассмотрены в известной монографии:

29. Карслоу Г. С., Егер Д., Теплопроводность твердых тел. — М.: Наука, 1964.

 

Процессы и аппараты для тепловой обработки в пищевой промышленности рассматриваются в монографии:

30. Charm S. Е., The Fundamentals of Food Engineering, 2d ed., Avi Publishing Co., Inc., Westport, Conn., 1971.

 

Проблемы получения, изучения и применения биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток изложены в ссылках [14, 15] гл. 4, а также в следующих источниках:

31. Immobilized Microbial Cells, Venkatsubramanian К. (ed.), ACS Symposium Series 106, American Chemical Society, Washington, D.C., 1979.

32. Jack T. R., Zajic J. E., The Immobilization of Whole Cells, p. 125 in Advances in Biochemical Engineering, vol. 5, Ghose T. K., Fiechter A., Blakebrough N. (eds.), Springer-Verlag, New York, 1977.

33. Gbewonyo K., Wang D. I. C., Confining Mycelial Growth to Porous Microbeads. A Novel Technique to Alter the Morphology of Non-Newtonian Mycelial Cultures; Biotech. Bioeng., 25, 967 (1983).

34. Nagashima M., Azuma M., Noguchi S., Technology Developments in Bjomass Alcohol Production in Japan: Continuous Alcohol Production with Immobilized Microbial Cells; Ann. N.Y. Acad. Sci., 413, 457 (1983).

35. Forberg C., Enfors S.-O., Haggstrom L., Control of Immobilized, Non-Growing Cells for Continuous Production of Metabolites; Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 17, 143 (1983).

 

Башеииые и эрлифтные реакторы;

36. Schugerl К., LUcke J.. Oels U., Bubble Column Bioreactors (Tower Bioreactors Without Mechanical Agitation), p. 1 in Advances in Biochemical Engineering, vol. 7, Ghose T. K., Fiechter A., Blakebrough N. (eds.), Springer-Verlag, New York, 1977.

37. SchUgerl K., Characterization and Performance of Single- and Multistage Tower Reactors with Outer Loop for Cell Mass Production, p. 93 in Advances in Biochemical Engineering, 22, Fiechter A. (ed.), Springer-Verlag, New York, 1982.

38. Kitai A., Tone H., Ozaki A., Performance of a Perforated Plate Column as a Multistage Continuous Fermentor; Biotech. Bioeng., 11, 911 (1969).

39. Prokop A. et al. Design and Physical Characteristics of a Multistage Continuous Tower Fermentor; Biotech. Bioeng., 11, 945 (1969).

40. Falch E. A., Gaden E. L, Jr., A Continuous, Multistage Tower Fermentor, I: Design and Performance Tests; Biotech. Bioeng., 11, 927 (1969); II: Analysis of Reactor Performance; ibid., 12, 465 (1970).

41. Ault R. G. et al. Biological and Biochemical Aspects of Tower Fermentation; J. Inst. Brewing, 75, 260 (I960).

42. Greenshields R. N., Smith E. L., Tower-Fermentation Systems and Their Applications, Chem. Eng. London, May 1971, p. 182.

 

Реакторы с псевдоожижеиным слоем, насадкой и струйным течением жидкости:

43. Scott С. D., Fluidized-Bed Bioreactors Using а Flocculating Strain of Zymomonas mobilis for Ethanol Production; Ann. N.Y. Acad. Sci,, 413, 448 (1983).

44. Flaschet E., Fauquex P.-F., Renken A., Zum Verhalten von Fliissigkeits Wirbelschichten mit Einbauten; Chem.-Ing.-Tech., 54, 54 (1982).

45. van de Vusse J. G., Wesselingh J. A., Multiphase Reactors, p. 561 in 4^th International/6th European Symposium on Chemical Reaction Engineering, vol. 2, DECHEMA, Deutsche Gesellschaft fiir Chemisches Apparatewesen, e. v., Frankfurt, 1976.

46. Briffaud J., Engasser J., Citric Acid Production from Glucose. II. Growth and Excretion Kinetics in a Trickle-Flow Fermentor; Biotech. Bioeng., 21, 2093 (1979).

 

Технология микробиологических процессов:

47. Microbial Technology, Peppier H. J., Perlman D. (eds.), 2d ed., vols. I and II, Academic Press, Inc., New York, 1979. Необычно обширный сборник обзорных статей по технологии, продуктам и применению процессов микробиологической технологии.

48. Casida L. Е., Jr., Industrial Microbiology, John Wiley and Sons, Inc.. New York, 1968. Хороший обзор продуктов, процессов и методов микробиологической промышленности, в том числе проблем патентоведения и экономики. Многочисленные иллюстрации дают достаточно полное представление о практической стороне этой отрасли промышленности.

49. Уэбб Ф. Ч., Биохимическая технология и микробиологический синтез.— М.: Медицина, 1969. В этой монографии обсуждены проблемы проектирования аппаратов для микробиологической промышленности, рассмотрены получаемые в них продукты. Особенностью этой книги является анализ ряда других важных тем, в том числе посвященных коллоидным системам, эмульсиям, редокс-потенциалам, химической дезинфекции, дегидратации, радиации и производству вакцин.

50. SchUgerl К.-, New Bioreactors for Aerobic Processes; Int. Chem. Eng 22 591 (1982).

 

Культуры животных клеток:

51. Feder J., Tolbert W. R., The Large-Scale Production of Mammalian Cells; Scientific American, 248, 36 (1983).

52. Tolbert \F. R., Schbenfeld R. A.� Lewis C., Feder J., Large-Scale Mammalian Cell Culture: Design and Use of an Economical Batch Suspension System; Biotech. Bioeng., 24, 1671 (1982).

53. Fiechter A., Batch and Continuous Culture of Microbial, Plant and Animal Cells, p. 453 in Biotechnology, vol. 1, Rehm H.-J., Reed G. (eds.), Verlag Chemie, Weinfieim, 1982.

54. Katinger H. W. D., Scheirer W., Status and Development of Animal Cell Technology using Suspension Culture Techniques; Acta Biotechnologica, 2 3 (1982).

55. Glacken Al. W., Fleischaker R. J., Sinskey A. J., Large-scale Production of Mammalian Cell and Their Products; Engineering Principles and Barriers to Scale-up; Ann. N.Y. Acad. Sci., 413, 355 (1983).

56. Kruse P. F., Jr., Patterson M. K., Jr.� Tissue Culture; Methods and Application, Academic Press, Inc., 1973.

57. Johnson I. S., Boder G. В., Metabolites from Animal and Plant Cell Culture; Adv. Microbiol., 15, 215 (1973).

58. Cell Culture and its Application, Acton R., Lynn J. D. (eds.). Academic Press, New York, 1977.

59. Acton R. Т., Lynn J. D., Description and Operation of a Large-Scale, Mam: malian Cell, Suspension Culture Facility, in Advances in Biochemical Engineering, vol. 7, Ghose T. K., Fiechter A., Blakebrough N. (eds.), Springer-Verlag, New York, 1977.

60. Lim F., Moss R. D., Microencapsulation of Living Cells and Tissues; J. Pharm. Sci., 70, 351 (1981).

61. Ku K-, Kuo M. J., Detente J., Wildi B. S., Feder J., Development of a Hollow-Fiber System for Large-Scale Culture of Mammalian Cells; Biotech, Bioeng., 23, 79 (1981).

62. Scattergood E. M., Schlabach A. J., McAleer W. J., Hilleman M. R., Scale-Up of Chick Cell Growth on Microcarriers in Fermenters for Vaccine Production; Ann. N. Y. Acad. Sci., 413, 332 (1983).

63. White R. J., Klein F., Chen J. A., Stroshane R. M., Large-Scale Production of Human Interferons, in Annual Reports on Fermentation Processes, vol. 4, Tsao G. T. (ed.), Academic Press, 1980.

 

Культуры растительных клеток:

64. Tissue Culture and Plant Science, Street H. E. (ed.), Academic Press, London, 1974.

65. Advances in Biochemical Engineering, Fiechter A. (ed.), vols. 16, 18, Springer-Verlag, Berlin, 1980.

66. Wilson G., Continuous Culture of Plant Cells Using the Chemostat Principle, p. 1 in Advances in Biochemical Engineering, vol. 16, Fiechter A. (ed.), Springer-Verlag, New York, 1980.

67 Shuler M. L., Sahai 0. P., Hallsby G. A., Entrapped Plant Cell Tissue Cultures; Ann. N.Y. Acad. Sci., 413, 373 (1983).

68. Brodelius P., Production of Biochemicals with Immobilized Plant Cells; Possibilities and Problems; Ann. N.Y. Acad. Sci., 413, 383 (1983).

69. Curtin M. E., Harvesting Profitable Products from Plant Tissue Culture; Bio/Technology, 1, 649 (1983).

Глава 10

 

Контрольно-измерительная аппаратура и управление процессами биохимической технологии

В предыдущих главах мы уже неоднократно имели возможность убедиться в том, что активность и полезное время жизни ферментного катализатора или…  

Детекторы для определения физических и химических параметров среды и газов

На рис. 10.1 представлена одна из последних схем приборного оснащения биохимического реактора. Она предназначена в основном для определения химического состава и физических свойств среды и газовой фазы и лишь очень немногих особенностей популяции клеток. Следовательно, при анализе результатов определения параметров системы в биореакторе желательно (или даже необходимо) оценить особенности популяции клеток по доступным данным физико-химического анализа газовой фазы и среды. В этом разделе мы сконцентрируем внимание на неавтономной аппаратуре, работающей в реальном масштабе времени и предназначенной для контроля физических и химических параметров системы в биореакторе.

 

Детекторы для определения физических свойств среды и газов

Из параметров, влияющих на жизнедеятельность клеток и экономичность биопроцесса, в ходе процесса можно непрерывно определять температуру, давление,… В качестве датчика температуры чаще всего применяют терморезисторы —… Контроль давления особенно важен при стерилизации, когда в реакторе необходимо поддерживать небольшое избыточное…

Детекторы для определения химического состава среды

В настоящее время разработаны электроды для определения рН, окислительно-восстановительного потенциала (Eh), парциального давления растворенного…  

РИС. 10.2. Комбинированный электрод типа Ingold 465 для определения рН, выдерживающий стерилизацию паром в автоклаве. (С любезного разрешения Ingold Electrodes Inc.)

Для определения концентрации растворенного кислорода применяют гальванические (потенциометрические) или полярографические (амперометрические или электрод Кларка) зонды. По сути дела, эти электроды измеряют не концентрацию растворенного кислорода, а его парциальное давление (или активность). И в первом, и во втором зонде собственно электрод обычно отделен от среды мембраной (рис. 10.3), а на поверхности катода осуществляется восстановление кислорода

Катод:

(10.1)

Реакция на аноде в гальваническом электроде:

Анод (гальванический электрод):

(10.2)

Катод и анод образуют гальванический элемент, напряжение которого зависит от количества кислорода, достигающего поверхности электрода. В кислородном электроде полярографического типа на катоде также происходит реакция (10.1), а на аноде осуществляется другой процесс

Анод (полярографический):

(10.3)

Между катодом и анодом устанавливают постоянное напряжение и измеряют силу тока, которая зависит от притока кислорода к катоду. Недостатком как первого, так и второго электрода является дрейф сигнала (силы тока или напряжения), обусловленный накоплением гидроксильных ионов или ионов металла или истощением Cl^-.

РИС. 10.3. Устройство и основные элементы электрохимического зонда для определения парциального давления растворенного кислорода. (Воспроизведено с разрешения из работы: Wang N. S., Stephanopoulos G., Computer Application to Fermentation Processes, ORG Critical Reviews in Biotechnology, vol. 2, p. 1. © CRC Press, Inc., 1974.)

 

Дрейфу способствует также загрязнение наружной поверхности мембраны.

В стационарном состоянии приток кислорода к катоду зависит от ряда процессов переноса, включая перенос кислорода из жидкой фазы к наружной поверхности мембраны, диффузию через мембрану и, наконец, диффузию через раствор электролита к поверхности катода, где реакция происходит практически мгновенно. Если общая скорость переноса, а, следовательно, и концентрация кислорода вблизи катода лимитируется первой стадией, то сигнал электрода будет зависеть от свойств жидкой фазы (например, от ее вязкости) и локальных гидродинамических условий вблизи электрода. По этой причине, в частности, рекомендовалось, чтобы скорость движения жидкости вблизи полярографического электрода была не менее 0,55 м/с. Чувствительность сигнала электрода к переносу через наружный граничный слой можно снизить за счет применения менее проницаемой мембраны. (Почему?) Однако в этом случае увеличивается запаздывание отклика электрода на изменение парциального давления кислорода, которое в случае мембранных электродов и без того довольно велико (10—100 с). В то же время, как показано в приведенном ниже примере, такие электроды можно применять и для изучения процессов массопереноса в биореакторах в переходном состоянии, если при анализе данных учитывать диффузию через мембрану электрода.

Пример 10.1. Электрохимическое определение k_la. В аэрируемом с постоянной скоростью реакторе периодического или непрерывного действия устанавливают кислородный электрод. После того, как отклик электрода достигнет некоторого постоянного уровня, ток кислорода резко прерывают и сразу же с такой же скоростью начинают пропускать азот, который постепенно вытесняет кислород из среды. В этом случае изменение напряжения на электроде во времени можно описать уравнением [11]

(10П1.1)

Здесь τ=βL²/D_O2; E(t) —напряжение на электроде в момент времени t, E₀ — напряжение на электроде в нулевое время; F_g — скорость потока газа; V — объем жидкости в реакторе; М — константа в уравнении закона Генри; L — толщина мембраны электрода; D_O2 —коэффициент диффузии О₂ через мембрану электрода;, D_O2=P_m/L, где P_m — проницаемость мембраны.

(10П1.2)

Если постоянная времени системы велика (т. е. k_la мало), то величину β определяют по напряжению на электроде при времени, значительно превышающем время отклика электрода; в этом случае вклад второго слагаемого в правой части уравнения (10П1.1) пренебрежимо мал. Большие значения k_la (50—500 ч^-1) Вернан и Уилке [11] предложили определять по наклону касательной к кривой Зависимости отклика электрода от времени в точке ее перегиба (где вторая производная E по t равна нулю). Как было показано, этот метод обеспечивает такую же точность результатов, как и подбор эмпирической кривой с помощью вычислительных машин во всем диапазоне E(t). При непостоянном времени релаксации электрода обратное время релаксации можно определить по графику зависимости этого параметра от наклона касательной к кривой E(t) в точке перегиба.

Далее искомую величину kia находят в три этапа:

1. Определяют наклон касательной к кривой зависимости отклика Е от t в точке перегиба (рис. 10П1.1).

2. По обобщенной графической зависимости, описываемой уравнением (10П1.2), (рис. 10П1.2), определяют β для данных величин наклона касательной к кривой и постоянной времени электрода.

3. По приведенному выше определению постоянной времени системы (1/β) находят k_la.

Очевидно, что полезность этого метода, особенно в случае больших величин k_la, определяется той точностью, с которой может быть найден отклик электрода.

При высоких концентрациях растворенных веществ могут изменяться растворимость кислорода (табл. 8.1), коэффициент диффузии кислорода и характеристики самого электрода, в том числе и его отклик. Для того чтобы учесть каждый из этих факторов, необходима калибровка электрода с помощью независимых методов определения концентрации растворенного кислорода.

РИС. 10П1.1. Наклон кривой в точке перегиба определяют по графику зависимости отклика электрода на замену барботируемого кислородсодержащего газа азотом. [Воспроизведено из статьи: Wernan W. С., Wlike С. R., New Method for Evaluation of Dissolved Oxygen Response for k_La Determination; Biotech. Bioeng., 15, 571 (1973).]

 

Выдерживающие стерилизацию паром электрохимические детекторы для определения парциального давления растворенного СО₂ применяются сравнительно недавно. В таких детекторах, выпускаемых, в частности, компанией Ingold Electrodes Inc., определение p_CO2 основано на измерении рН стандартного раствора бикарбоната, отделенного от изучаемой жидкости газопроницаемой мембраной. Детекторы калибруют посредством замены раствора бикарбоната на стандартный буферный раствор с последующим определением рН.

В другом методе неавтономного определения летучих компонентов среды и растворенных газов в изучаемую жидкость погружают трубку известной длины, стенки которой проницаемы для определяемого компонента системы. Через трубку непрерывно пропускают поток газа-носителя, который уносит проникающие внутрь трубки компоненты в газоанализатор (см. следующий раздел), где они и определяются. Недостатком такого подхода является существенное запаздывание (2—10мин) отклика анализатора, что делает его мало пригодным для контроля быстрых изменений концентраций.

РИС. 10П1.2. Эти графики позволяют определить величину β по наклону кривой в точке перегиба и параметрам транспорта через мембрану. Затем по уравнению (10П1.2) находят k_la. [Из статьи: Wernan W. С., Wilke С. R., New Method for Evaluation of Dissolved Oxygen Response for k_La Determination; Biotech. Bioeng., 15, 571 (1973).]

 

Для определения специфических компонентов жидкой фазы разработан ряд биодетекторов (биосенсоров). Принцип действия биосенсоров заключается в определении с помощью того или иного аналитического устройства конкретного продукта реакции, катализируемой иммобилизованными ферментом или клетками. Примеры сочетания катализируемых ферментами реакций с электрохимическими детекторами мы уже рассматривали в разд. 4.3.3. Широко изучаются также ферментные терморезисторы, в которых с помощью калориметра определяется количество теплоты, выделяющейся в процессе катализируемойферментом реакции. В табл. 10.1 перечислены некоторые определявшиеся этим методом соединения и соответствующие ферменты.

 

Таблица 10.1. Примеры применения ферментных терморезисторов в аналитической химии^а

 

Иммобилизованные ферменты можно применять и в биосенсорах других типов, например в таких, в которых продукты реакции (водород) изменяют электронную проводимость полупроводниковых устройств (кремниевых кристаллов, на которые нанесен слой SiO₂ и пленка Pd).

Сферу применения биосенсоров можно существенно расширить за счет использования различных биохимических превращений, в том числе многостадийных и разветвленных реакций, в результате которых образуется детектируемое вещество. Во многих случаях с помощью иммобилизованных клеток анализируемое соединение можно превратить в более подходящее для непосредственного определения соединение. В основу разработки и применения биосенсоров с иммобилизованными клетками была положена дыхательная активность интактных иммобили зованных клеток (определение с помощью кислородного электрода), а также образование или поглощение интактными клетками электроактивных метаболитов (определение с помощью топливного электрода, рН- или СО₂-электродов).

 

Таблица 10.2. Микробиологические детекторы для определения компонентов жидкой фазы

В табл. 10.2 приведены свойства ряда биосенсоров на основе иммобилизованных клеток; подробнее подобные аналитические устройства описаны в работе [12].

Шульц и сотрудники [13] разработали и описали другой интересный и перспективный подход к определению индивидуальных метаболитов, основанный на применении специфичных «аффинных сенсоров». Для реализации этого подхода необходимы агент, специфично связывающий определяемое соединение; меченое соединение, конкурентно связываемое тем же самым агентом; метод выделения связывающего агента из анализируемого раствора. Так, например, для определения глюкозы с помощью иммобилизованного конкопавалина А (Con-А) [белка из канавалии мечевидной (растения семейства бобовых), селективно связывающего сахара] создан флуоресцентный детектор на основе волоконной оптики, в котором Con-А иммобилизован на внутренней поверхности аналитической ячейки. Последняя отделена от анализируемого раствора диализационной мембраной, проницаемой для глюкозы, и содержит также декстран, меченный флуорохромом — флуоресцеинизотиоцианатом (ФИЦ). Мембрана непроницаема для ФИЦ-декстрана, который конкурирует с глюкозой за связывание с Con-А:

Таким образом, количество несвязанного ФИЦ-декстрана, а следовательно, и интенсивность флуоресценции зависят от концентрации глюкозы в растворе. Основной недостаток этого метода обусловлен возможностью взаимодействия связывающего агента с другими сахарами (например, с мальтозой, сахарозой и фруктозой в случае Con-А), но принцип этого интересного подхода в силу его общности, безусловно, заслуживает дальнейшего изучения. При использовании любых сенсоров на основе клеток, ферментов или других объектов биологического происхождения необходимо принимать во внимание также возможность инактивации биосенсора в ходе стерилизации реактора. Для решения этой проблемы были сконструированы механические устройства, позволяющие вводить биосенсор в реактор и выводить из него в асептических условиях. Как и в случае других датчиков, сигнал которых зависит от транспорта определяемого соединения через мембрану, загрязнение мембраны биосенсоров клетками или иными компонентами среды и увеличение сопротивления внешнему массопереносу может вызвать дрейф сигнала или изменение калибровки биосенсора.

 

Газовый анализ

Концентрация СО2 в отходящих газах биореактора, содержащего культуру клеток, связана с дыхательной или иной ферментативной активностью клеток.… Парциальное давление кислорода в газовом потоке обычно измеряют с помощью… С помощью газовой хроматографии можно определять несколько компонентов отходящих газов: О2, СО2, СН4 (образующегося,…

Детекторы для непрерывного контроля характеристик популяции клеток

К сожалению, в настоящее время имеется очень ограниченное число приборов, предназначенных для непрерывного контроля за поведением популяции клеток в… Широко изучались оптические методы, основанные на измерении поглощения света…

Автономные методы анализа

 

В этом разделе мы рассмотрим принципы работы некоторых аналитических методов определения свойств культуральных жидкостей, биокатализаторов и биосорбентов. Вообще говоря, для этой цели можно использовать любые методы аналитической химии, спектроскопии и биохимии; очевидно, что в настоящем пособии не представляется возможным дать сколько-нибудь полное описание этой темы. Поэтому мы сосредоточим внимание на некоторых новых методах определения тех свойств клеток, которые наиболее важны для контроля микробиологических процессов и управления ими, а также рассмотрим другие наиболее часто применяемые методы анализа.

 

Определение свойств среды

Первая стадия обработки пробы, отобранной из биореактора или аппарата, где происходит разделение продуктов, обычно заключается в отделении твердой… Из параметров находящейся в биореакторе системы обычно наибольший интерес… Для количественного определения компонентов жидкой фазы обычно применяют методы, основанные на измерении показателя…

Анализ состава популяции клеток

Методы анализа популяций клеток можно классифицировать примерно таким же образом, как и математические модели, описывающие кинетику роста культур… Прежде всего, мы обсудим методы, дающие информацию несегрегированного типа. К… Усредненное содержание конкретных белков в популяции клеток можно определять несколькими методами. Что касается…

РИС. 10.11. Схема проточного цитометра. На схеме показаны пути потока суспензии клеток и лазерных лучей, оптические фильтры, детекторы для определения параметров индивидуальных клеток, а также способы генерации, анализа и хранения информации. Размещенными по диагонали квадратами изображены дихроичные светофильтры (отражающие излучение определенных длин волн и пропускающие излучение другой длины волны); расположенными под прямым углом квадратами обозначены задерживающие или поляризационные светофильтры. В таких приборах часто устанавливают несколько детекторов типа фотоумножителей н соответствующих электронных устройств, что позволяет одновременно определять несколько параметров каждой клетки. (За основу взят прибор Ortho Instruments Cytofluorograph System 50H.)

 

РИС. 10.12. Изучение популяции рекомбинантных клеток Saccharomyces cerevisiae путем определения двух параметров методом цитометрии в потоке. На осях координат базисной плоскости отложены интенсивность рассеяния света индивидуальными клетками (связанная с размером клеток) и интенсивность флуоресценции индивидуальных клеток (в данном случае связанная с числом плазмид в одной клетке). Флуорометрия позволяет легко различать клетки с плазмидами и клетки, не содержащие плазмид.

 

ЭВМ и интерфейсы

Сочетание контрольно-измерительной аппаратуры с цифровыми ЭВМ выгодно в нескольких отношениях. Во-первых, ЭВМ может разносторонне усовершенствовать… ЭВМ позволяют существенно улучшить качество анализа и интерпретации данных. С… ЭВМ в очень большой степени расширяют возможности оптимизации процессов и управления ими. Одна ЭВМ, заменяя множество…

Основные элементы цифровых ЭВМ

Основные блоки цифровой ЭВМ представлены на рис. 10.13. Центральный процессор принимает команды, передаваемые блоком управления в соответствии с… Для хранения команд и данных используется несколько типов памяти. В постоянном… Блок управления вводом данных позволяет соединять ЭВМ с внешними периферийными устройствами. В самой ЭВМ шина передачи…

Интерфейсы и периферийные устройства ЭВМ

Запоминающие, вычислительные и логические возможности ЭВМ останутся бесполезными, если она не соединена с каким-либо другим устройством или… 1. ЭВМ→ЭВМ; межмашинная связь 2. Оператор→ЭВМ; передача команд

Системы программного обеспечения

Под программным обеспечением подразумевается набор программ и команд, с помощью которых осуществляется управление работой ЭВМ, соответствующих… РИС. 10.16. Схема ЭВМ, управляющей пилотным биореактором (УПП — устройство построчной печати, ФС — фиксированные…

Анализ данных

Хотя в настоящее время удается измерить лишь ограниченное число параметров системы в биореакторе, все же на основании этих параметров в сочетании с… РИС. 10.17. Результаты непосредственных первичных измерений (показанных в верхней части рисунка) могут служить основой…

Сглаживание и интерполяция данных

Часто на результаты измерений накладывается шум. Кроме того, существенные флуктуации результатов измерений приводят к тому, что непосредственные… В простейшем способе сглаживания данных применяют фильтр первого порядка… (10.4)

Оценка параметров и состояния системы

Если накоплением кислорода в реакторе пренебречь, то уравнение материального баланса по кислороду для периодического процесса принимает форму (10.7) где индексами f и e обозначены параметры на входе в реактор и на выходе из него соответственно. В этом уравнении учтен…

Управление процессами биохимической технологии

 

Для успешного осуществления биотехнологического процесса необходимо условия и параметры процесса поддерживать на уровне проектных величин. Для этого в свою очередь необходимо регулировать указанные в проекте условия и параметры, поскольку они могут непредсказуемым образом меняться в силу неизбежных флуктуаций скоростей подачи исходных веществ, скорости перемешивания и других эксплуатационных параметров, а также в силу изменения химического состава системы в ходе процесса. Иногда ход периодического процесса можно оптимизировать путем изменения значений ряда параметров системы, например рН или температуры, в соответствии с заданной программой. Для программированного изменения параметров процесса также необходимы соответствующие методы управления. В этом разделе мы сначала рассмотрим способы поддержания на заданном уровне непосредственно измеряемых параметров, а затем перейдем к изучению способов управления процессом на базе расчетных параметров.

 

Непосредственное управление процессами

Если процесс осуществляется, например, в биореакторе, то часто возникает необходимость в регулировании рН, температуры, скорости аэрации и… Регулирование может выполнять и оператор, наблюдающий за показаниями прибора и…

РИС. 10.20. Основные элементы системы управления с обратной связью,

 

Такой тип регулирования применяют тогда, когда блок управления или регулирующее устройство, непосредственно воздействующее на процесс с целью корректирования того или иного параметра, также являются двухпозиционными, как, например, в случае односкоростных насосов. При регулировании рН по принципу двухпозиционного управления насос, подающий основание в биореактор, включается при снижении рН ниже заданного значения на определенную величину (обычно 0,25 единицы рН). Если же рН становится выше заданного значения на 0,25 единицы, то насос выключается. (В последнем случае можно подключить насос, подающий в систему кислоту, но обычно в этом нет необходимости, поскольку в ходе большинства микробиологических процессов рН среды понижается.) Таким же способом обычно регулируют температуру (по крайней мере, в небольших реакторах).

Если параметры регулирующего устройства, например установленного на валу мешалки электродвигателя с переменной скоростью вращения или регулирующего клапана на линии подачи воздуха, можно изменять непрерывно, то в таких случаях обычно применяют пропорционально-интегрально-дифференциальное регулирование или один из вариантов регулирования этого типа. В данном случае выходной сигнал регулирующего устройства описывается уравнением

(10.10)

Здесь o_s — номинальный выходной сигнал регулирующего устройства в невозмущенном состоянии (в проектных условиях), а e(t) —погрешность:

(10.11)

Из уравнения (10.10) следует, что регулирующее действие пропорционально сумме трех слагаемых; погрешности, интеграла погрешности и производной погрешности. Относительная важность этих трех типов регулирования определяется параметрами τ₁ и τ_D, называемыми интегральным и дифференциальным временем соответственно. Общая «сила» регулирующего действия определяется величиной коэффициента усиления К_с. Если дифференциальное время равно нулю (τ_D = 0), то регулятор называют пропорционально-интегральным. Возможны и другие варианты.

РИС. 10,21. Автоматическая система управления концентрацией растворенного кислорода, базирующаяся на определении состава отходящих газов н концентрации растворенного кислорода. (САРС — система автоматического регулирования скорости). [Воспроизведено с разрешения из работы: Таппеп L. Р., Nyiri L. К-, Instrumentation of Fermentation Systems, in Microbial Technology, Peppier H. J., Perlman D. (eds.), 2d ed., vol. II, p. 331, Academic Press, Inc., New York, 1979.]

 

Хорошо настроенный регулятор этого типа часто обеспечивает очень хорошее управление измеряемой переменной. Напротив, плохо настроенный регулятор может дестабилизировать систему, вызывая нежелательные сильные флуктуации. Настройке пропорционально-дифференциально-интегральных регуляторов посвящено множество учебных пособий и руководств по регулированию процессов (см., например, работы [1—3]).

Обычно в управлении процессом участвует несколько регуляторов этого типа, один из которых по данным измерения температуры регулирует скорость охлаждения, другой регулирует рН и т. д. В связи с постоянным удешевлением цифровых ЭВМ В последние годы управление несколькими регулирующими один параметр цепями обратной связи успешно осуществляется с помощью одной микро-ЭВМ. Если выходной сигнал ЭВМ (обычно после цифро-аналогового преобразователя или реле) используется непосредственно для включения исполнительного механизма, то такую систему называют системой с прямым цифровым управлением.

Преимуществом регулирующих устройств на основе ЭВМ является возможность сочетания способности компьютера к анализу данных с управлением процессом на базе определения нескольких параметров. В качестве примера на рис. 10.21 изображена схема одной из таких систем, в которой измерение концентрации растворенного кислорода и концентрации кислорода в отходящих газах позволяет определять в реальном масштабе времени величину k_la; полученную таким путем информацию вместе с результатами определения концентрации растворенного кислорода можно использовать для соответствующего регулирования скорости вращения мешалки и (или) скорости поступающего в реактор потока газа с тем, чтобы концентрация О₂ в растворе поддерживалась на необходимом уровне. Эта система относится к типу систем с прямым цифровым управлением. Обратите внимание на то, что здесь аналогоцифровой преобразователь принимает сигнал в виде изменяющейся силы тока, что вызывает необходимость преобразовывать сигнал напряжения в сигнал силы тока. Чтобы избежать существенных потерь в линии передачи сигнала, если только они не слишком короткие (как это бывает, например, в лабораторных установках), электрические аналоговые сигналы лучше передавать в виде силы тока.

К проблеме использования найденных расчетным путем параметров состояния системы для управления процессом мы еще вернемся в следующем разделе.

 

Каскадное управление метаболизмом

Конечной задачей системы управления любым биореактором с культурой клеток является обеспечение таких условий, которые в конце концов способствуют… Выходной сигнал регулятора метаболизма может использоваться для…  

Прогрессивные методы управления биопроцессами

 

В завершение нашего краткого обзора методов управления процессами биохимической технологии и соответствующей контрольно-измерительной аппаратуры рассмотрим некоторые пути обеспечения максимального выхода продукта в реакторах периодического действия и регулирования и стабилизации режимов в реакторах непрерывного действия. Кроме того, вкратце рассмотрим некоторые интересные проблемы, возникающие при расчете и проектировании биопроцессов, которые состоят из нескольких последовательных операций. Во всех указанных случаях регулирование процесса и расчеты, связанные с разработкой соответствующей схемы управления процессом, существенно упрощаются при использовании ЭВМ.

 

Программированное управление процессами в биореакторах периодического действия

Обеспечить максимальный выход продукта в периодическом процессе с участием определенного штамма микроорганизмов можно только в том случае, если… Как известно, однако, во многих случаях постоянство условий и состава среды не… Аналогично при производстве белков с помощью культур генетически видоизмененных клеток в начале периодического…

Расчет и стратегия эксплуатации промышленных периодических процессов

Промышленный процесс состоит из ряда периодических операций (предварительной обработки субстрата, стерилизации, ферментации, выделения продукта,… 1. Изучение и оптимизация отдельных операций и аппаратов. 2. Оптимизация процесса, состоящего из ряда последовательных периодических операций, целью которых является получение…

Управление непрерывными процессами

При проведении непрерывных процессов возникают специфические проблемы регулирования и особые возможности применения прогрессивных методов… Рис. 10.27. Кривые рабочих функций и определение оптимального времени цикла периодических операции (а, б) и процесса,…

Заключение

 

Для управления биотехнологическим процессом независимо от того, осуществляется ли это управление оператором или ЭВМ, необходима информация о состоянии процесса. В свою очередь такую информацию можно получить только при наличии соответствующей аналитической аппаратуры и при тщательном систематическом анализе и интерпретации полученных данных. В ближайшие годы здесь должны произойти большие сдвиги благодаря внедрению в промышленные процессы новых мощных методов анализа, заимствованных из химии, биохимии и биологии клетки. В основанных на моделях методах анализа данных найдут применение не только принципы элементарной стехиометрии, но и дополнительные данные, базирующиеся на оценке параметров в реальном масштабе времени, и более детальные оценки метаболического состояния, в основу которых положены достаточно универсальные структурированные модели.

Прежде чем перейти к теме следующей главы — к процессам разделения, следует упомянуть несколько важных понятий и тем, связанных с управлением процессами, но не рассматривавшихся в этой главе. На низшем уровне задача технолога сводится к проведению процесса в соответствии с некоторым проектом или технологической инструкцией. Эти проект или технологическая инструкция в свою очередь отвечают решению проблемы оптимизации или регулирования на более высоком уровне, на котором цель данного процесса сводится к достижению того или иного максимального вклада (например, максимальной прибыли) в результате деятельности всего предприятия, затем соответствующей корпорации и, наконец, всего общества. Рассматриваемые инженером-технологом целевые функции и ограничения представляют собой, таким образом, естественное продолжение целей и требований на более высоких уровнях управления.

Часто важными составными частями целевых функций или эксплуатационных ограничений являются надежность и безопасность. При управлении процессами часто намного важнее обеспечить максимальную однородность продукта, свести к минимуму возможные потери и вероятность работы во вредных условиях, чем повысить выход продукта на несколько процентов или допустить небольшое отклонение от установленных значений параметров. Изучение этих вопросов в целом еще только начинается, и мы вправе ожидать здесь новых достижений, которые окажут влияние и на развитие проблемы управления процессами биохимической технологии.

 

Упражнения

10.1. Аналитическая аппаратура. Дайте определение и кратко объясните принцип действия следующих аналитических приборов: а) терморезистора, термопары, мембранного манометра, ваттметра Холла,… б) рН-электрода, гальванического и полярографического зондов для определения концентрации растворенного кислорода,…

РИС. 10У5.1.

 

(Данные о принятых способах изображения схем управления можно найти в любом руководстве по управлению процессами, например в книге: Coughanowr D. R., Корреі L. В., Process Systems Analysis and Control, McGraw-Hill, New York, 1965.)

10.6. Время запаздывания в переходном состоянии. В случае нестационарного состояния предлагалось вводить константу времени запаздывания (l/γ), учитывающую запаздывание отклика мгновенной удельной скорости клеточного роста (х(0 на изменение концентрации субстрата [Young Т. В., Вгиіеу D. F., Bungay Н. R., А Dynamic Mathematical Model of the Chemostat; Biotech. Bioeng., 12, 747, (1970)]. Постепенное приближение μ(t) к соответствующему значению для стационарного состояния цо описывается уравнениями

а) Покажите, что если s является функцией времени s(t), то решение указанных уравнений приводит к выражению

б) Предположим, что s(t) =s₀(l+αcoswt), причем α<1 и K_s>>s(t'). Найдите явное решение приведенного выше уравнения для μ(t) пои этих условиях, постройте график зависимости μ(t)/ μ_max от t при α = 0,5, γ = 1 и w = 0,1γ, 1,0γ и 10γ. Объясните различие между полученными кривыми. Для каких переходных состояний учет временной константы γ обязателен?

в) Найдите уравнения, описывающие поведение системы в ПРПП, если s_f=s_f0(1+coswt) и если клеточный рост подчиняется уравнению r_x=μxs.

10.7. Контроль хемостата с аэрацией. При росте аэробных организмов в хемостате через систему пропускают сжатый воздух со скоростью, обычно равной одному объему воздуха на объем жидкости в минуту. Поступающий в реактор воздух практически не содержит влаги, а выходящий из реактора воздух насыщен парами воды. Следовательно, скорости потоков жидкостей, поступающих в реактор и вытекающих из него, должны быть различными.

Как описанное выше явление скажется на интерпретации аналитических данных, полученных при изучении вытекающего из реактора потока? Чему будет равна истинная концентрация продукта на выходе из реактора (с учетом испарения), если объем реактора равен 10 л, скорость разведения составляет

0,1 ч^-1, а другие параметры системы равны: s₀=50 г/л (глюкоза): K_s=10 мг глюкозы/л; μ_max=0,7 ч^-1; Y_X/S=0.5 г клеток/(глюкозы): m=0,02 г глюкозы/[(г клеток)·ч]; Y_P/S = 0,5; q_p = 0,2 г продукта/[(г клеток)·ч]; 7=60 °С. Давление паров воды при 60 °С равно 150 мм рт. ст. Примите, что скорость клеточного роста описывается уравнением Моно. Можно также принять, что концентрация CO₂ в воздухе пренебрежимо мала, а дыхательный коэффициент изучаемого процесса равен единице.

10.8. Автоматическое управление с прямой связью. Рост микроорганизмов в периодическом процессе описывается уравнением dx/dt=yix до тех пор, пока при (x—x₀)=Y_S0 не истощится лимитирующее рост питательное вещество S. В соответствии со стехиометрией аэробного процесса потребность в кислороде на рост биомассы и образование продуктов метаболизма учитываются коэффициентами Y_X/O2 и Y_P/O2.

а) Найдите выражения, описывающие мгновенную потребность в кислороде Q_O2 и удельную потребность в кислороде (отнесенную к концентрации клеток) Q_O2/X, если образование продукта не сопряжено с клеточным ростом, так что dp/dt=βx. При каких условиях эти выражения максимальны?

б) Выведите уравнение, позволяющее рассчитать величину K_la, при которой обеспечивается удовлетворение максимальной потребности системы в кислороде.

в) По какой программе следует изменять F_g (вход), чтобы необходимая скорость аэрации достигалась при минимальной общей утилизации газа, если K_t приблизительно постоянно, а значение a изменяется пропорционально скорости поступающего в реактор потока газа в степени 3/4. Найдите выражение, описывающее отношение всего объема воздуха, введенного в систему в процессе роста биомассы от x₀ до x_max, к объему воздуха, который был бы введен в систему, если бы F_g поддерживали на максимальном уровне в течение всего периода клеточного роста.

г) Управление с прямой связью часто легче осуществимо, чем управление с обратной связью, но поскольку при первом способе управления отсутствует непрерывный контроль процесса, то фактически управление проводится «вслепую». Обсудите, какие последствия будет иметь неправильная калибровка расходомера для воздуха в ситуации, описанной в задаче 10.8, в, если показания расходомера на 10% ниже или на 50% выше запрограммированной скорости подачи газа. Как бы вы модифицировали систему управления, чтобы решить эту проблему?

10.9. Оценка состояния системы в реальном масштабе времени с помощью уравнений материального баланса. а) Рассмотрим процесс быстрого роста клеток, в ходе которого скорость образования CO₂ (COO) пропорциональна скорости роста биомассы. Найдите выражения для определения x и μ, а) если COO измеряют непрерывно и б) если COO измеряют периодически с интервалами Δt.

б) При низких скоростях клеточного роста, благоприятных для образования пенициллина, пропорциональная зависимость между COO и скоростью роста биомассы нарушается и возникает необходимость в определении более полного баланса по углероду. Превращения в периодическом процессе с добавлением субстрата описываются общим уравнением

 

Субстрат + предшественники пенициллина + посевной материал → непрореагировавший субстрат + непрореагировавший предшественник + образовавшаяся биомасса + растворимые неидентифицированные продукты+ пенициллин + CO₂

 

Выразите концентрацию биомассы с помощью уравнения материального баланса по углероду через найденные концентрации субстрата, предшественника, пенициллина и CO₂, если γ_i — доля углерода в і-м компоненте и если углерод в заметных количествах входит только в состав биомассы, субстрата, предшественника, CO₂ и пенициллина. Изменением объема реакционной смеси во времени можно пренебречь.

в) Предположим, что концентрацию пенициллина нельзя определить непосредственно, но в то же время пенициллин вносит существенный вклад в общий баланс по углероду. Найдите выражение, с помощью которого можно определить концентрацию пенициллина р, если известны концентрации субстрата, предшественника и CO₂ и если кинетика накопления пенициллина описывается указанным выше уравнением:

[Пример использования уравнений материального баланса для управления процессом производства пенициллина детально описан в работе: Мои D.-G., Соопеу С. L., Biotech. Bioeng., 25, 225, 257 (1983).]

10.10. Автоматическое управление добавлением неорганических веществ в периодическом процессе с добавлением субстрата. Определение in situ концентраций NH₃ или летучего углеродсодержащего субстрата (например, этанола) позволяет осуществить управление с обратной связью скоростью добавления питательных веществ, содержащих азот и углерод. К сожалению, концентрации многих неорганических веществ, необходимых для роста и жизнедеятельности клеток, нельзя определять непрерывно в ходе процесса. С другой стороны, добавление всех неорганических компонентов при t = 0 часто ингибирует рост инокулята. В таких случаях выгодно добавлять неорганические компоненты в ходе процесса по определенной программе, в основу которой положены стехиометрические соотношения между теми компонентами, концентрации которых можно определить in situ, и другими компонентами системы.

Рассмотрим простое уравнение типа

а) Какое соотношение объемных скоростей растворов исходных веществ будет соответствовать указанной стехиометрии образования биомассы, если концентрации питательных веществ в исходных растворах равны n₀ (источник азота), c₀ (источник углерода), m₀ (источник неорганических веществ)? Сколько детекторов потребуется для управления потоками всех питательных веществ?

б) Выведите уравнение, описывающее адекватную скорость добавления раствора неорганических веществ F_m(t) через регулируемые по принципу обратной связи скорости добавления растворов источников азота и углерода F_n(t) и F_c(t), если в результате процесса образуются как биомасса, так и продукт (C₇NO₃H₁₀). Сколько детекторов потребуется теперь? [См. статью: Suzuki Т. et аі, Automatic Supplementation of Minerals in Fed-Batch Culture te High Biomass Concentrations; Biotech. Bioeng., 27, 192 (1985).]

10.11. Ферментативный метод контроля клеточного роста. Изучение процесса утилизации целлюлозы микроорганизмами затруднено из-за нерастворимости субстрата в воде. Проконтролируйте процесс накопления фермента глюкозооксидазы в культуре целлюлолитической бактерии, растущей на целлюлозе. Глюкозооксидаза катализирует реакцию

Кинетику этой реакции можно изучать колориметрическим или манометрическим (например, с помощью респирометра Варбурга) методами. Вам известно, что изучаемый организм содержит глюкозооксидазу в количестве около 1 единицы активности на 1 грамм клеточного белка (1 единица активности равна такому количеству фермента, которое трансформирует 1 мкмоль глюкозы в минуту). В этой бактерии целлюлазная активность сконцентрирована в клеточной стенке, поэтому для роста необходим непосредственный контакт клетки с субстратом.

а) Составьте план эксперимента для изучения кинетики клеточного роста и образования глюкозооксидазы бактериями, растущими на целлюлозном порошке (частицы диаметром 100 мкм). Этот эксперимент должен охватывать как экспоненциальную, так и стационарную фазы. В частности, вы должны описать необходимую для эксперимента аппаратуру, методы анализа, количество целлюлозы и источника азота (сульфат аммония), которое нужно добавить к среде.

б) Как вы думаете, сколько времени займет этот эксперимент, и как будут выглядеть кривые клеточного роста и удельной ферментативной активности? Можно принять следующие значения параметров; Y_X/S = 0,5; Y_X/N = 10; Y_X/O = 1; площадь поверхности одной бактерии около 5-10^-8 см², масса бактерии около 10^{-12 г; желательная конечная концентрация клеток 10 г/л; μ}_max≈0,2 ч^-1; клетки на 60% состоят из белков.

 

Литература

 

Полезные обзоры по управлению процессами химической технологии даны в следующих монографиях:

1. Stephanopoulos G., Chemical Process Control. An Introduction to Theory and Practice, Prentice-Hall, Inc., Englewood Cliffs, N. J., 1984.

2. Luyben W. L., Process Modeling, Simulation, and Control for Chemical Engineers, McGraw-Hill, N. Y., 1973.

3, Coughanowr D. R., Koppel L. В., Process Systems Analysis and Control, McGraw-Hill, N. Y., 1965.

 

Фильтры Калмана и теория оптимального управления рассматриваются во многих сборниках и монографиях, в том числе в следующих:

4. Jazwinski А. Я., Stochastic Processes and Filtering Theory, Academic Press, New York, 1970.

5. Атанс M., Фалб П. Л., Оптимальное управление. — М.; Машиностроение, 1968.

 

Проблемы контрольно-измерительной аппаратуры и управления биопроцессами изложены во многих опубликованных недавно обзорных статьях и монографиях:

6. Wang N. S., Stephanopoulos G., Computer Application in Fermentation Processes; CRC Critical Reviews in Biotechnology, 2, 1, (1984).

7. Computer Applications in Fermentation Technology, 3rd Int. Conf. on Computer Applications in Fermentation Technology, Manchester, England, 1981; Society of Chemical Industry, London, 1982.

8. Computer Applications to Fermentation Processes (Biotechnology and Bioengineering Symposium Series, No. 9), John Wiley, N. Y., 1979.

9. Tannen L. P., Nyiri L. K., Instrumentation of Fermentation Systems, in Microbial Technology, 2d ed., vol. 2, Peppier H. J., Perlman D. (eds.), p. 331, Academic Press, Inc., New York, N. Y., 1979.

10. Armiger W. В., Humphrey A. E., Computer Application to Fermentation Technology, in Microbial Technology, 2d ed., vol. 2. Peppier H. J,, Perlman D. (eds.). Academic Press, Inc., New York, N. Y., 1979.

 

Ниже приведена литература к отдельным темам, рассмотренным в этой главе: Детекторы:

11. Wernan W. С., Wilke С. R., New Method for Evaluation of Dissolved Oxygen Response for k_La Determination; Biotech. Bioeng., 15, 571 (1973).

12. Karube 1., Suzuki S., Application of Biosensor in Fermentation Processes, in Annual Reports on Fermentation Processes, vol. 6, Tsao G. T. (ed,), p. 203, Academic Press, N. Y., 1983.

13, Schultz J. S., Sims G., Affinity Sensors for Individual Metabolites, in Biotech. Bioeng. Symposium 9, Armiger W, B. (ed.), p. 65, Wiley, N. Y., 1979.

 

Автономные методы анализа:

14. Методы общей микробиологии, под ред. Герхарда Ф., т. 1—3. — М.: Мир, 1983.

15. Methods in Cell Biology, vol, XII, Yeast Cells, Prescott D, H. (ed,), Academic Press, N, Y, 1975.

16. Rodriguez R. L., Tail R. C., Recombinant DNA Techniques: An Introduction, Addison-Wesley Publishing Co., Reading, MA, 1983.

17. Pedersen S., Block P. L., Reeh S., Neidhardt F. C., Patterns of Protein Synthesis in E. coli: A Catalog of the Amount of 140 Individual Proteins at Different Growth Rates; Cell. 14, 179 (1978),

18 Methods in Immunodiagnosis, Rose N. R., Bijayzi P. E. (eds.), 2d ed., Wiley, N. Y., 1980.

19. Ugurbil K., Rottenberg H., Glynn P., Shulman R. G., ³¹P Nuclear Magnetic Resonance Studies of Bioenergetics and Glycolysis in Anaerobic Escherichia coli Cells; Proc. Natl, Acad. Sci. USA, 75. 2244 (1978).

20. Herrero A. A., Gomez R. F., Snedecor В., Tot man C. J., Roberts M. F., Growth Inhibition of Clostridium thermocellum by Carboxylic Acids: A Mechanism Based on Uncoupling by Week Acids; Appl. Microbiol, Biotechnol,, 22, 53 (1985).

21. den Hollander J. A., Ugurbil K., Brown T. R., Shulman R. G., Phosphorus-31 Nuclear Magnetic Resonance Studies of the Effect of Oxygen upon Glycolysis in Yeast; Biochemistry, 20, 5871 (1981).

22. Nicolay K., Sheffers W. A., Bruinenberg P. M., Kaptein R., Phosphorus-31 Nuclear Magnetic Resonance Studies of Intracellular pH, Phosphate Compartmentation, and Phosphate Transport in Yeasts; Arch. Microbiol., 133, 83 (1982).

23. Ugurbil K., Brown T.R; den Hollander J. A., Glynn P., Shulman R. G., High-Resolution ¹³C Nuclear Magnetic Resonance Studies of Glucose Metabolism in Escherichia coli; Proc, Natl, Acad. Sci. USA, 75, 3742 (1978).

24. Legerton T. L., Kanamori K., Weiss R. L., Roberts J. D., ¹⁵N NMR Studies of Nitrogen Metabolism in Intact Mycelia of Neurospora crassa\ Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 78, 1495 (1981).

25. Nestaas E., Wang D. 1. C., Suzuke H., Evans L. В., A New Sensor — the «Filtration Probe» — for Quantitative Characterization of the Penicillin Fermentation. II. The Monitor of Mycelial Growth; Biotech. Bioeng,, 23, 2815 (1981),

26. Nestaas E., Wang D. I. C., A New Sensor — the «Filtration Probe» —for Quantitative Characterization of the Penicillin Fermentation. III. An Automatically Operating Probe; Biotech. Bioeng., 25, 1981 (1983).

27. Thomas D. C., Chittur V. K-, Cagney J. W., Lim H. C., On-Line Estimation of Mycelial Cell Mass Concentrations with a Computer-Interfaced Filtration Probe: Biotech. Bioeng., 27, 729 (1985).

28. Srienc F., Arnold В., Bailey J. E., Characterization of Intracellular Accumulation of Poly-P-Hydroxybutyrate (PHB) in Individual Cells of Alcaligenes eutrophus H16 by Flow Cytometry; Biotech. Bioeng., 26, 982 (1984).

29. Flow Cytometry and Sorting, Melamed M. R., Mullaney P. F., Mendelsohn M. L. (eds.), John Wiley and Sons, N. Y., 1979.

30. Bailey J. E., Single-Cell Metabolic Model Determination by Analysis of Microbial Populations, in Foundations of Biochemical Engineering; Kinetics and Thermodynamics in Biological Systems, Blanch H. W., Papoutsakis E. Т., Stephanopoulos G. (eds.), American Chemical Society, Washington, D. C., 1983.

31. Srienc F., Campbell J. L., Bailey J. E., Detection of Bacterial P-Galactosidase Activity in Individual Saccharomyces cerevisiae Cells by Flow Cytometry; Biotech. Lett., 5, 43 (1983).

32. Hatch R. Т., Wilder C., Cadman T. W., Analysis and Control of Mixed Cultures, Biotech. Bioeng. Symp. No. 9, Armiger W. B. (ed.), p. 25, John Wiley and Sons, 1979.

33. Hutter K -J., Punessen U., Eipel H. E., Flow Cytometric Determination of Microbial Contaminants; Biotech. Lett., 1, 35 (1979).

 

Микро-ЭВМ:

34. Hampel W. A., Application of Microcomputers in the Study of Microbial Processes, in Advances in Biochemical Engineering, vol. 13, Ghose T. K., Fiechter A., Blakebrough N. (eds.), p. 1, Springer-Verlag, Berlin, 1979.

 

Фильтрация и рекурсивная оценка:

35. Jefferis R. P., Winter H., Vogelmann H., Digital Filtering for Automatic-Analysis of Cell Density and Productivity, in Workshop Computer Applications in Fermentation Technology, Jefferis III R. P. (ed.), Verlag Chemie. N.Y., 1977.

 

Методы оценки материальных балансов;

36. Zabriskie D. W., Humphrey A. E., Real-Time Estimation of Aerobic Batch Fermentation Biomass Concentration by Component Balancing; AIChE J, 24, 138 (1978).

 

Применение фильтра Калмана:

37. Stephanopoulos G., San K.-Y., Studies on On-Line Bioreactor Identification. Part I. Theory; Biotech. Bioeng., 26, 1176 (1984).

38. San К--У; Stephanopoulos G., Studies on On-Line Bioreactor Identification. Part II. Numerical and Experimental Results; Biotech. Bioeng. 26, 1189 (1984).

 

Управление биореакторами периодического действия с добавлением субстрата;

39. Соопеу С. L., WangH. Y., Wang D. I. С., Computer-Aided Material Balancing for Prediction of Fermentation Parameters; Biotech. Bioeng., 19, 55 (1977).

40. Wang H. ¥., Cooney C. L., Wang D. I. C., Computer-Aided Baker's Yeast Fermentations; Biotech. Bioeng., 19, 69 (1977).

 

Управление биореакторами периодического действия:

41. Lundell R., Practical Implementation of Basic Computer Control Strategies for Enzyme Production, in Computer Applications in Fermentation Technology. P- Society of Chemical Industry, London, 1982.

42. Constantinides A., Spencer J. L., Gaden E. L., Jr., Optimization of Batch Fermentation Processes. I. Development of Mathematical Models for Batch Penicillin Fermentations; Biotech. Bioeng., 12, 803 (1970).

43. Constantinides A., Spencer J. L., Gaden E. L., Jr., Optimization of Batch Fermentation Processes. II. Optimum Temperature Profiles for Batch Penicillin Fermentations; Biotech. Bioeng., 12, 1081 (1970).

 

Проектирование и эксплуатация периодических процессов:

44. Rippin D. W. Т., Simulation of Single- and Multiproduct Batch Chemical Plants for Optimal Design and Operation; Computers and Chem. Eng., 7, 137 0983).

45. Karimi I. A., Reklaitis G. V., Intermediate Storage in Non-continuous Processing, in Foundations of Computer Aided Process Design, Westerberg A. W.,Chien H. H. (eds.), p. 425, CACHE Publications, Ann Arbor, Michigan, 1984.

 

Линейно-квадратичное оптимальное управление:

46. Fawzy Л. S., Hinton 0. R., Microprocessors Control of Fermentation Process; J. Ferment. Technol., 58, 61 (1980).

47. Fan L. Т., Shah P. S., Pereira N. C., Erickson L. E., Dynamic Analysis and Optimal Feedback Control Synthesis Applied to Biological Waste Treatment; Water Research, 7, 1609 (1973).

 

Управление биореакторами при наличии нескольких стационарных состояний:

48. DiBiasio D., Lim Н. С., Weigand W. A., Tsao G. Т., Phase-Plane Analysis of Feedback Control of Unstable Steadv States in a Biological Reactor; AIChE J., 24, 686 (1978).

49. DiBiasio D., Lim H. C., Weigand W. A., An Experimental Investigation of Stability and Multiplicity of Steady States in a Biological Reactor; AIChE J., 27, 284 (1981).

 

Биореакторы вынужденно-периодического действия;

50. Bailey J. E., Periodic Phenomena, in Chemical Reactor Theory; A Review, Lapidus L., Amundson N. R. (eds.), p. 758, Prentice-Hall, Englewood Cliffs, N.J. 1977.

51. Pickett A. M., Bazin M. J., Topiwala H. H., Growth and Composition of Escherichia coli Subjected to Square-Wave Perturbation in Nutrient Supply: Effect of Varying Frequencies; Biotech, Bioeng., 21, 1043 (1979).

 

Управление ростом смешанных культур:

52. Wilder С. Т., Cadman Т. W., Hatch R. Т., Feedback Control of a Competitive

Mixed-Culture System; Biotech. Bioeng., 22, 89 (1980).

Глава 11

 

Операции выделения в процессах биохимической технологии

 

Культуральный бульон представляет собой сложную смесь клеток (биомассы), растворимых внеклеточных продуктов метаболизма, внутриклеточных продуктов жизнедеятельности организмов, а также не подвергшихся превращениям (или не способных к превращениям) компонентов субстрата. Как правило, биопроцесс состоит из двух основных этапов — биотрансформации (осуществляемой в биореакторе) и последующего выделения продукта. Применяемый в каждом конкретном биопроцессе метод выделения продукта определяется не только тем, где он находится (внутри клетки или вне ее), молекулярной массой, зарядом и растворимостью, но и масштабом процесса и даже стоимостью продукта. Например, в лабораторных условиях для выделения и очистки ценных фармацевтических препаратов или таких биологически активных веществ, как гормоны, антитела и ферменты, с успехом применяются различные хроматографические методы, которые обычно невыгодны в производственных масштабах из-за их высокой стоимости и ряда затруднений при масштабировании.

Эта глава, посвященная операциям разделения и очистки в биопроцессах, построена следующим образом. Сначала будут рассмотрены отдельные методы выделения продуктов, полученных с участием микроорганизмов, растительных или животных клеток. Затем мы покажем, как сочетать эти методы, чтобы в конце концов добиться необходимой для данного продукта степени чистоты, которая может варьировать в очень широких пределах. Понятно, что требования, предъявляемые к методам выделения, например, дрожжевых клеток (путем фильтрования), сырого экстракта фермента или свободного от пирогенов инсулина, продуцируемого рекомбинантными организмами Е. coli, будут существенно различаться. Мы также будем обращать внимание на высокую стоимость многих операций разделения и на необходимость учета этого фактора при проектировании процесса в целом. С этой точки зрения, например, удобнее работать со штаммами микроорганизмов, секретирующих продукт в среду, а не накапливающих его в клетках. С другой стороны, применение более дешевых неочищенных субстратов может быть экономически нецелесообразным из-за усложнения и удорожания операций выделения продукта. Принципы и основные операции выделения одинаковы для процессов с участием ферментов, культур клеток или микроорганизмов, хотя в процессах последнего типа операции выделения изучены наиболее тщательно.

В конечном итоге основная задача биотехнолога заключается в выборе наиболее выгодного для получения данного продукта сочетания субстрата, фермента или организма, биореактора и метода выделения. Основным критерием при выборе оптимального варианта является экономическая сторона проектируемого биотехнологического процесса; эту проблему мы рассмотрим в следующей главе.

Необходимость применения конкретного метода или операции разделения зависит от начальных свойств культурального бульона (вязкости, концентрации продукта, наличия примесей и нежелательных нерастворимых веществ и т. д.), а также от требуемой степени чистоты и конечной формы продукта (кристаллическое вещество, его концентрированный раствор, высушенный порошок и т. д.). Неочищенный продукт можно выделить, например, путем простого упаривания культуральной жидкости. Последовательность операций выделения и очистки при получении высокоочищенного продукта биопроцесса выглядит обычно следующим образом:

1. Отделение нерастворимых веществ. Для этой цели обычно используют фильтрование, центрифугирование и (или) отстаивание, седиментацию и декантацию.

2. Первичное выделение. Здесь чаще всего применяют экстракцию растворителями, сорбцию, осаждение и ультрафильтрацию. Последний метод позволяет разделять вещества в соответствии с их молекулярными массами. На стадии первичного выделения значительно возрастает концентрация продукта, причем продукт отделяется в первую очередь от веществ, существенно отличающихся от него по полярности.

3. Очистка. В ходе операции очистки обычно происходит отделение примесей, а также дальнейшее концентрирование продукта. Для этой цели используют фракционное осаждение, различные хроматографические методы и адсорбцию.

4. Окончательная очистка продукта. После этой операции (или нескольких операций) продукт готов к смешению с другими составными частями композиции или к непосредственной отправке потребителю. На этой стадии применяют центрифугирование и последующее высушивание кристаллического вещества, сушку распылением или в барабане, сушку лиофилизацией (вымораживанием) или отгонку органического растворителя.

Типичная последовательность операций выделения и очистки фармацевтического препарата (полученного методами биохимической технологии) приведена в табл. 11.1, где указаны как концентрация, так и относительная чистота продукта после каждой операции, в том числе после отделения нерастворимых веществ, первичного выделения, предварительной и окончательной очистки (кристаллизации).

На рис. 11.1 в качестве примера изображена схема всей системы выделения и очистки. Эта система, в которой применено 15 различных методов выделения и помимо этого предусмотрена предварительная обработка культуральной жидкости, предназначена для производства антибиотика в виде неочищенного препарата (твердого вещества, полученного путем распылительной или непрерывной сушки) или в виде высокоочищенного кристаллического вещества.

 

Таблица 11.1. Последовательность операций выделения и очистки^а

 

Отделение клеток и нерастворимых твердых материалов

Нерастворимые компоненты системы (от клеток до индивидуальных веществ) можно отделить от раствора, воспользовавшись особенностями их основных… Некоторые типичные для культуральных бульонов свойства могут затруднять как…  

Фильтрование

 

Небольшие количества бульона, полученные в мелкомасштабных периодических процессах, можно фильтровать на рамном фильтр-прессе, на котором постепенно накапливается биомасса; затем фильтр открывают и снимают осадок биомассы. В более крупномасштабном производстве применяют непрерывное фильтрование. Эту операцию выполняют, например, на ротационных (барабанных) вакуум-фильтрах; иногда такие фильтры лучше функционируют, если на фильтрующую поверхность нанесен еще один фильтрующий слой. На рис. 11.3 изображена схема ротационного вакуум-фильтра непрерывного действия, где для снятия накапливающегося на вращающемся барабане осадка (слоя твердых веществ) используются шнуры, которые удовлетворительно снимают осадок мицелия Репісіllіит.

РИС. 11.3. Ротационный вакуум-фильтр со шнуровым съемом осадка. (С любезного разрешения компании Ametek, Inc.)

 

При снятии мицелия Streptomyces фильтрующую ткань необходимо покрывать вспомогательным фильтрующим материалом, например диатомовой землей, а слой мицелия с вращающегося барабана снимают с помощью ножа.

Характеристики фильтрования взвеси твердых частиц в жидкости часто описывают с помощью элементарной теории фильтрования. Приняв, что фильтрат течет через слой отфильтрованного материала в ламинарном режиме, мы можем записать

(11.1)

где А — площадь фильтрующей поверхности; V_f — объем фильтрата; t — продолжительность фильтрования; Δp — перепад давлений на фильтре; μ_c — вязкость фильтрата; α — среднее удельное сопротивление осадка; W — масса накопленных твердых веществ в осадке; W=[pw/(1-тт)]V_f, где p — плотность фильтрата, w — массовая доля твердых веществ в суспензии; m — отношение массы влажного осадка к массе сухого осадка; r — коэффициент сопротивления фильтрующего материала. На ротационных фильтрах, обычно применяющихся в микробиологической промышленности, перепад давления на фильтре постоянен. Если допустить, что осадок несжимаем, то а постоянно, и тогда после интегрирования уравнения (11.1) получим

(11.2)

Отсюда следует, что в принятых условиях t/V_f линейно зависит от V_f. На рис. 11.4, а представлен график зависимости t/V_f от V_f для фильтрования суспензии культуры Streptomyces griseus при различных рН через хлопчатобумажную ткань и вспомогательный фильтрующий материал (диатомовую землю) при Δp = 2 кг/см².

РИС. 11.4. а — на скорость фильтрования бульона S. griseus большое влияние оказывает величина рН; б — предварительное нагревание бульона S. griseus изменяет удельное сопротивление образующегося осадка. [Из статьи: Shirato S., Esutni S., Filtration of a Culture Broth of Streptomyces griseus, J. Ferment. Tech. (Japan), 41, 87 (1963).]

 

Из этих данных следуют два важных вывода. Во-первых, осадок сжимаем, поскольку экспериментальные данные, определенные при одном значении рН, располагаются не на прямой. Вообще клетки и другие органические компоненты микробиологических процессов обычно образуют сжимаемые осадки. Во-вторых, экспериментальные данные свидетельствуют о том, что фильтрующие свойства сильно зависят от предварительной обработки бульона и условий фильтрования. Очень большое влияние на скорость фильтрования, очевидно, оказывает рН. Приведенные на рис. 11.4,6 данные показывают, что предварительная тепловая обработка бульона может значительно снизить удельное сопротивление осадка за счет коагуляции мицелиальных белков.

Для повышения объемной производительности биореакторов в последние годы все чаще применяют рециркуляцию культур клеток (вспомните гл. 9, разд. 9.1.3). В крупномасштабных установках по аэробной переработке бытовых отходов (гл. 14) флокулирующую биомассу (состоящую из различных организмов) отделяют отстаиванием и образовавшуюся концентрированную суспензию клеток подвергают рециркуляции. В мелкомасштабных процессах с участием нефлокулирующих организмов можно применять метод фильтрования, при котором параллельный поверхности фильтра непрерывный поток жидкости уносит накапливающуюся клеточную массу, тем самым создавая почти стационарный поток фильтрата [в отличие от изменяющегося во времени поведения системы при периодическом фильтровании; см. уравнение (11.2)]. Скорость потока фильтрата через фильтровальную перегородку зависит как от перепада давления на перегородке Δp, так и от установившегося сопротивления слоя биомассы α(W/A). Следовательно, уравнение (11.1) применимо и для фильтрования с параллельным фильтрующей поверхности потоком, однако теперь установившаяся масса осадка на фильтре W и удельное сопротивление α являются функциями скорости поперечного потока жидкости (или касательного потока).

Состав осадка при обычном фильтровании и фильтровании с параллельным фильтрующей поверхности потоком может быть различен, особенно если исходная смесь помимо клеток содержит другие нерастворимые компоненты. Последний способ фильтрования позволяет повысить концентрацию биомассы в 10 и более раз. Сообщалось, что при фильтровании с параллельным фильтрующей поверхности потоком через мембрану, задерживающую вещества с молекулярной массой более 100 000, наблюдается 15—20-кратное повышение концентрации Е.coli, микоплазмы (при производстве ветеринарных вакцин) и вируса гриппа (при производстве вакцин на основе интактных вирусов). Если фильтрованию с параллельным фильтрующей поверхности потоком подвергается периодическая культура клеток, то в непрерывно рециркулирующем потоке культуры концентрация клеток возрастает во времени; этот факт необходимо учитывать при анализе таких систем.

Как и в случае центрифугирования при больших скоростях вращения ротора, иногда перед фильтрованием с параллельным фильтрующей поверхности потоком необходимо предварительное фильтрование на грубых фильтрах. Так, в производстве антибиотиков неутилизированные соевую крупу и карбонат кальция удобнее всего отделять с помощью сетчатого или другого фильтра с большим диаметром пор, а затем отделять биомассу методом фильтрования с параллельным фильтрующей поверхности потоком.

Если внеклеточный продукт метаболизма можно выделить экстракцией несмешивающимся с водой растворителем непосредственно из культурального бульона, то операции отделения биомассы и выделения продукта можно объединить. Такие комбинированные операции мы рассмотрим в одном из следующих разделов.

 

Центрифугирование

Из культурального бульона биомассу можно выделить центрифугированием; таким методом иногда выделяют, например, дрожжи. На рис. 11.5 приведено… Выведены уравнения, связывающие скорость движения частицы в концентрированной… (11.3)

РИС. 11.5. В этой центрифуге непрерывного действия осадок твердых веществ отделяется в потоке между двумя коническими поверхностями. Осветленную жидкость (фугат) отбирают из верхней части аппарата.

 

По этой причине такие центрифуги целесообразно применять в сочетании с центрифугой для разделения суспензии мелких частиц, что позволяет использовать последнюю наиболее эффективно без перегрузки и засорения.

Примеры применения этих центрифуг приведены в табл. 11.3; обратите внимание на использование шнековых (осадительных) центрифуг для отделения крупных скоплений плесневых грибов, а также на большую производительность центрифуг с соплами.

 

Таблица 11.2. Типы центрифуг^а

РИС. 11.6. Конструкция центрифуги со шнековой выгрузкой осадка. (Из работы- Perry R. Н., Chilton С. Н., Chemical Engineers Handbook, 5th ed., pp 19—92, McGraw'-Hiil, New York, 1973. Имеется перевод 4-го издания. Перри Дж. Г., Справочник инженера-химика, т. 1, 2. — Л.; Химия, 1969.)

1 — привод шнека; 2 —канал для выгрузки осадка; 3 —шнек; 4 — регулируемые каналы для выгрузки фугата; 5 — приводной шкив; 6 — подлежащая разделению суспензия; 8 — выгрузка фильтрата; 9 — выгрузка осадка, 9 — байпасная линия для устранения перегрузок.

В продуктах биопроцессов часто встречаются внеклеточныеттвердые вещества. Так, при производстве ферментов из растительной биомассы последнюю обычно сначала измельчают иэкстрагируют раствором с высокой ионной силой при охлаждении, после чего большую часть твердых веществ необходимо отделить. Точно так же при частичной утилизации твердых субстратов (например, целлюлозы) в бульоне могут остаться макроскопические частицы субстрата.

 

Таблица 11.3. Примеры использования центрифугирования для выделения биомассы^а

Если плотность последних заметно отличается от плотности жидкой фазы, то для первичного отделения твердых веществ применяют шнековые центрифуги (рис. 11.6).

 

Седиментация

Если под влиянием многозарядных катионов или внеклеточных полимеров клетки легко образуют коагулирующие скопления или хлопья, то биомассу можно… РИС. 11.7. а — скорость осаждения активного ила (снижения границы раздела фаз), образующегося в аэробном процессе, б —…

Перспективные методы выделения биомассы

Твердую фазу можно удалить из водной суспензии с помощью восходящего потока пузырьков воздуха, к которым прилипают нерастворимые твердые частицы.… В методе электрокинетического осаждения образованию плотной биомассы,…  

Заключение

 

Необходимость в выделении биомассы может возникнуть по разным причинам. Во-первых, биомасса может представлять собой конечный продукт; во-вторых, она может являться исходным материалом в последующих операциях лизиса и выделения внутриклеточного продукта; в-третьих, отделение биомассы необходимо после экстракции дезинтегрированных лизисом или механическим способом клеток; в-четвертых, оно должно предшествовать выделению или регенерации следовых количеств непрореагировавшего растворимого субстрата, а также регенерации и повторному использованию клеток в биореакторе; наконец, может возникнуть потребность и в отделении биомассы от реакционной массы, из которой уже выделен (например, экстракцией) продукт. Выбор конкретного способа выделения биомассы — фильтрования (периодического, непрерывного в вакууме, с поперечным потоком и др.), центрифугирования (с вертикальным ротором или горизонтальным шнеком) или коагуляции и седиментации — зависит от состояния бульона (температуры, рН, ионной силы), состава реакционной массы (наличия или отсутствия биомассы, полимеров, многозарядных ионов, других нерастворимых частиц) и от состояния, в котором желательно получить продукт.

 

Первичное выделение

 

Экстракция

Для экстракции необходимо наличие двух жидких фаз. При выделении антибиотиков применяют в основном экстракцию органическими растворителями из водной… 11.2.1.1. Экстракция органическими растворителями. Многие антибиотики хорошо… В 1 л обычного пенициллинового бульона содержится 20—35 г антибиотика. После отделения биомассы мицелия фильтрованием…

Сорбция

Под сорбцией понимают распределение растворенного вещества между жидкой и твердой (обычно пористым или обладающим большой поверхностью материалом)… Катионообменник

Осаждение

Растворимость органических веществ зависит от температуры, рН, состава, иоииой силы и диэлектрической проницаемости растворителя. Осаждение можно… 1. Добавлением осадителя, реагирующего с растворенным веществом и образующего…

Кинетика образования осадка

Осаждение белка происходит в том случае, когда в результате изменения тех или иных условий его растворимость падает ниже существующей концентрации… (11.8) где m0 — молярная концентрация осаждающихся веществ.

Хроматография и адсорбция в неподвижном слое; периодические операции с селективной адсорбцией

 

При хроматографии сравнительно небольшую порцию раствора смеси веществ (или продуктов мелкомасштабного процесса) разделяют на хроматографической колонке на фракции, содержащие растворы практически чистых компонентов смеси (рис. 11.18). Вещества биологического происхождения, например белки, имеют различную тенденцию к связыванию с такими адсорбентами, как крахмал, диатомовая земля, полиакриламидный гель. Поэтому если содержащий смесь белков раствор пропустить через колонку, заполненную таким адсорбентом, то каждый белок будет двигаться по колонке с эффективной скоростью, зависящей от склонности этого белка к адсорбции. Для объяснения основного принципа хроматографическога разделения часто прибегают к следующей аналогии. Представим себе, что группа водителей едет по дороге, вдоль которой имеется множество баров. Очевидно, что самые большие любители пива закончат путешествие последними, а те из водителей, кто вообще не пьет пива, уйдут далеко вперед!

РИС. 11.18. Схематическое представление хроматографического разделения белков.

 

Если же водитель отличается особенно большим пристрастием к спиртным напиткам, то он застрянет в одном из баров до тех пор, пока его не выпроводят оттуда и пока его не подберет случайный проезжий. Последняя ситуация отвечает адсорбции в неподвижном слое и последующему элюированию (см., например, рис. 11.19); такой способ разделения в биохимической и биотехнологической литературе такжз часто называют хроматографией.

Для количественного математического описания хроматографического процесса допустим, что жидкая фаза, содержащая растворенные вещества S₁, S₂, ..., S_N, движется в режиме полного вытеснения (в поршневом потоке) по колонке с насадкой, доля ε общего объема которой занята жидкостью, находящейся в пустотах. Предполагается, что концентрация растворенных веществ в жидкой фазе s_i достаточно низка, поэтому обмен растворенным веществом с неподвижной фазой практически не изменяет общей концентрации жидкой фазы c_T (а следовательно, и поверхностной скорости движения жидкой фазы по колонке). Тогда дифференциальное уравнение материального баланса по растворенным веществам в нестационарном состоянии для двухфазной колонки (вспомните, например, рис. 9.5 и 9.30) можно записать в следующем виде:

(11.16)

 

где и — скорость движения жидкости в пустотах (равная частному от деления поверхностной скорости на е; в свою очередь поверхностная скорость равна общей объемной скорости, деленной на общую площадь поперечного сечения колонки).

РИС. 11.19. Ионообменная хроматография; принцип метода (а) и применение в аминокислотном анализе (б). Под хроматограммой указан состав элюирующего буферного раствора. [Рис. 11.19,6 воспроизведен с разрешения из статьи: Spackman D. Н., Stein W. Н., Moore S., Automatic Recording Apparatus for Use in the Chromatography of Amino Acids; Anal. Chem., 30, 1190 (1958). © American Chemical Society.]

 

Переменная w_i [ в уравнении (11.16) обозначает число молей компонента і в единице объема неподвижной фазы.

Скорость адсорбции растворенного вещества і неподвижной фазой dw_i/dt в общем случае является функцией режима течения, скорости диффузии растворенного вещества в неподвижную фазу, кинетики адсорбции, емкости адсорбента и других параметров. В простейшем случае адсорбированное неподвижной фазой вещество находится в локальном равновесии с растворенным веществом в жидкой фазе, находящейся в пустотах колонки, т. е.

(11.17)

В общем случае K_і зависит от концентраций всех веществ, находящихся в неподвижной фазе (w_i,..., w_n). При малых концентрациях, однако, можно принять, что K_і постоянно. Тогда подстановкой w_i из уравнения (11.17) в уравнение (11.16) и последующим преобразованием получим

(11.18а)

где

(11.186)

По форме уравнение (11.18а) идентично уравнению материального баланса по растворенному веществу і, движущемуся со скоростью u_i по трубе без насадки. Следовательно, уравнение (11.186) описывает эффективную скорость движения компонента і в хроматографической колонке с насадкой. Как и в аналогии с водителями, уравнение (11.186) указывает, что компоненты с большим сродством к неподвижной фазе (с большой величиной K_і) будут двигаться по колонке относительно медленно, а компоненты, обладающие малой тенденцией к связыванию с неподвижной фазой (с малой величиной K_і), будут двигаться со скоростями, близкими к скорости растворителя. В более общем виде эта теория учитывает также эффекты осевой дисперсии, неравновесное связывание и диффузионный перенос в неподвижную фазу (см. литературу). Анализ явлений необратимой адсорбции или десорбции необходим при изучении адсорбции в неподвижном слое с последующим селективным элюированием растворителем.

В другом методе разделения, называемом хроматографией на молекулярных ситах (гель-проникающей хроматографией или гель-фильтрацией), разделяют вещества с различными молекулярными массами. В этом случае насадка колонки состоит из частиц геля с определенным диаметром пор. Если размер молекул больше диаметра пор, то они не могут диффундировать в гель и быстро проходят через колонку, тогда как молекулы меньшего размера проникают в гель и поэтому движутся более медленно (рис. 11.20). Следует иметь в виду, что механизм разделения путем молекулярной эксклюзии в соответствии с диаметром пор (или диаметром волокон, если гель рассматривать как множество переплетенных твердых волокон) не является единственным.

РИС. 11.20. в хроматографии на молекулярных ситах молекулы большего размера быстрее проходят через колонку, а молекулы меньшего размера задерживаются, проникая в частицы геля.

 

На скорость движения растворенного вещества могут влиять также коэффициент эффективной диффузии растворенного вещества в геле, способность растворенного вещества адсорбироваться на внутренних поверхностях адсорбента, а также осмотическое давление. В настоящее время оценить с достаточной точностью вклад каждого из этих факторов не представляется возможным. Тем не менее молено считать, что в большинстве случаев преобладает процесс молекулярной эксклюзии. Тогда соответствующую константу равновесия K_av, отвечающую константе в уравнении (11.186), можно вычислить по уравнению

(11.19)

где K_{av, і} — доля общего внутреннего объема геля, доступная для сферических молекул радиусом r_i; L — концентрация волокон геля, выраженная в единицах длины на единицу объема, см/см³; r_g — радиус волокон геля; r_i — радиус сферических молекул растворенного вещества і. В табл. 11.6 приведен ряд величин r_g и r_i. Величину эффективного радиуса волокон геля можно изменять путем увеличения или уменьшения числа поперечных связей между цепями в геле. Новый гелевый носитель с неизвестными характеристиками можно охарактеризовать, построив график зависимости — (lnK_av)^0,5 от r_i;. Из уравнения (11.19) следует, что наклон этой кривой равен (πL)^0,5, а на оси координат она отсекает отрезок, равный (πL)^0,5r_g. На рис. 11.21 приведены величины K_av для ряда гелей типа сефадекс и сефароза (сефадекс-агароза). Если значение r_i неизвестно, то гель можно охарактеризовать по графику зависимости K_av от молекулярной массы.

 

Таблица 11.6. Определение радиусов молекул ряда белков с помощью коэффициентов диффузии^{а, б}

На рис. 11.22 приведены результаты разделения смеси белков методом хроматографии на молекулярных ситах. Обратите внимание на то, что различные белки появляются на хроматограмме в виде довольно широких пиков. Уширению пиков способствуют многие факторы, в том числе молекулярная диффузия, сопротивление массопереносу и непостоянство осевой скорости потока в поперечном сечении колонки. Изображенные на рис. 11.22 результаты разделения типичны для любых хроматографических .методов. Аналогично на неподвижной хроматографической фазе с различным сродством к разным компонентам смеси можно разделять белки с очень большой молекулярной массой, вирусы, компоненты клеток и даже смеси различных клеток.

В ионообменной хроматографии раствор смеси белков пропускают через колонку с неподвижным слоем ионообменной смолы (рис. 11.19). Одним из наиболее широко используемых для очистки белков ионообменников является карбоксиметилцеллюлоза — катионообменная смола, получаемая посредством введения карбоксиметильных групп (несущих отрицательный заряд) в целлюлозную матрицу. Белки в катионной форме (несущие положительный заряд) связываются с этой смолой электростатическими силами, причем прочность связей зависит от результирующего положительного заряда белка при рН элюента. Затем адсорбированный таким образом белок элюируют буферными растворами с возрастающим значением рН и (или) ионной силы.

РИС. 11.21. Зависимость K_av от молекулярной массы белка при хроматографии на сефадексе G-200, сефарозе 6В и сефарозе 4В (содержащих ~6 и ~4% агарозного геля соответственно; найдено экспериментально). (Из статьи: Joustra М. К., Gel Filtration on Agarose Gels, in Progress in Separation and Purification, vol. 2, p. 183, Wiley-Interscience, New York, 1969.)

 

Постепенное изменение свойств элюента приводит к тому, что слабо связанные с носителем белки десорбируются первыми, а затем вымываются все более и более прочно связанные с ионообменником белки. Следовательно, подвижная фаза, которая до ввода в колонку вообще не содержала белков, на выходе из колонки будет обогащена десорбированными белками. Полученный при промывании колонки элюат собирают в виде фракций небольшого объема. Аналогично осуществляют и хроматографию на анионообменных смолах— чаще всего на диэтиламиноэтилцеллюлозе.

Как и рассматриваемая ниже аффинная хроматография, ионообменная хроматография в одном отношении принципиально отличается от гель-проникающей и других типов жидкостной и газовой хроматографии, для которых характерны различные, но, тем не менее, вполне определенные конечные эффективные скорости движения растворенных веществ. В ионообменной хроматографии, напротив, в условиях ввода разделяемой смеси в колонку один или несколько компонентов смеси адсорбируются практически необратимо (K_і→∞). Таким образом, ионообменная хроматография, по сути дела, представляет собой селективную адсорбцию в неподвижном слое адсорбента.

РИС. 11.22. Хроматографическое разделение смеси веществ методом хроматографии на молекулярных ситах. (Неподвижная фаза — десульфированный агар, содержащий 6% поперечных связей; буферный раствор — 0,05 М трис Х НСІ, рН 7,5). [Воспроизведено с разрешения из работы: Porath J., Chromatographic Methods in Fractionation of Enzymes, in Enzyme Engineering, Wingard L. В., Jr. (ed.), p. 154, John Wiley and Sons, New York, 1972.]

 

Если адсорбируются несколько компонентов смеси, как это имеет место в примере, приведенном на рис. 11.22, то их разделяют на стадии элюирования. Для этой цели состав элюента ступенчато или непрерывно изменяют, добиваясь (в идеальном варианте) последовательной десорбции связанных с хроматографической неподвижной фазой компонентов смеси.

Интересным хроматографическим методом является аффинная хроматография, основанная на нативной специфичности некоторых биополимеров (рис. 11.23). Ряд белков и других биологических макромолекул (A) образуют комплексы с другими веществами (B) с чрезвычайно высокой степенью специфичности: если компонент B связывается с неподвижной фазой, находящейся в колонке, то коэффициент K по отношению к носителю A очень велик, тогда как величины K для других растворенных веществ практически равны нулю. В качестве примеров чрезвычайно специфично взаимодействующих веществ можно привести пары фермент—ингибитор, антиген — антитело, лектин — клетка:

Так, колонку для выделения ДНК-деполимеразы методом аффинной хроматографии готовят путем химического связывания ингибитора ДНК-деполимеразы с поверхностью какого-либо подходящего гранулированного материала, например агарозы или полиакриламида. Пропускание через такую колонку фугата клеток, подвергнутых лизису (см., например, стадию 4 в примере 11.1), приводит к практически количественному связыванию фермента ДНК-деполимеразы с неподвижной фазой, причем почти все другие вещества не задерживаются колонкой.

РИС. 11.23. Схематическое представление аффинной хроматографии. В этом методе хорошее разделение достигается за счет специфического взаимодействия между иммобилизованным агентом и растворенным веществом. Показаны три стадии: ввод смеси веществ (а); разделение (б); элюироваиие связанного с неподвижной фазой компонента смеси (е).

 

Из уравнения (11.186) следует, что u_i ≈ u для всех других растворенных веществ. Впоследствии связанный фермент можно десорбировать аіутем элюирования раствором ингибитора ДНК-деполимеразы или какого-либо другого подходящего агента.

Широкому распространению аффинной хроматографии спо собствовало создание методов получения моноклональных антител, обладающих чрезвычайно высокой константой связывания с соответствующим антигеном (определенным белком или другим веществом). Примером может служить рассматриваемый ниже метод очистки лейкоцитарного интерферона человека из лизата рекомбинантной бактерии Е. coli на колонке с иммобилизованными моноклональными антителами. Такая разновидность аффинной хроматографии, которая называется хроматографией на иммуносорбентах, существенно отличается от описанных выше традиционных типов хроматографии. Ниже перечислены основіные особенности хроматографии на иммуносорбентах:

 

1. Стоимость антител, используемых в качестве неподвижной фазы в хроматографии на иммуносорбентах, может во много раз превышать стоимость бульона, содержащего антигены.

2. Отсюда следует, что применение хроматографии на иммуносорбентах экономически выгодно только в случае небольших колонок многократного использования, обладающих большой емкостью.

3. Элюированию адсорбированного вещества должно предшествовать разрушение комплекса антиген—антитело, что часто сопровождается денатурацией белков. При этом антитела обычно частично теряют связывающую активность, что приводит к постепенному снижению емкости колонки.

4. Наиболее удачным носителем для иммуносорбентов оказалась агароза, применение которой позволило регулировать поверхностную плотность антител. Недостатком как этого, так и других полисахаридных носителей является отсутствие механической прочности (высокая сжимаемость), что ограничивает высоту колонки, которую можно использовать без чрезмерного перепада давления (вспомните пример 4.2).

5. Очистка смеси на предколонке не является обязательной; тем не менее в каждом конкретном случае следует предварительно проверить возможность непосредственного разделения смеси на иммуносорбенте (поскольку пока еще не накоплен достаточный опыт работы с иммуносорбентами).

6. Первое разделение на новой колонке обычно дает худшие результаты по сравнению с последующими разделениями, по-видимому, из-за частичного необратимого связывания антигена.

7. С экономической точки зрения основными задачами при хроматографии на иммуносорбентах является определение оптимальных объема и состава элюирующих буферных растворов.

 

Между аффинной хроматографией и другими более традиционными методами адсорбционной или ионообменной хроматографии существуют и другие различия. В традиционных хроматографических методах сначала адсорбируются все компоненты смеси, а их разделение осуществляется на стадии десорбции посредством, например, постепенного повышения рН или концентрации солей в элюенте (рис. 11.19). Напротив, специфичность аффинной хроматографии проявляется в основном на стадии адсорбции (рис. 11.23). Поэтому в аффинной хроматографии через колонку целесообразно пропускать раствор разделяемой смеси в течение достаточно длительного промежутка времени, пока почти не будет достигнуто насыщения неподвижной фазы, поскольку на ней адсорбируется практически только выделяемое соединение. Таким образом, проведение разделения в аффинной хроматографии приближается к обычной сорбции в неподвижном слое вплоть до насыщения слоя, адсорбента и резко отличается от обычного разделения многокомпонентной смеси, вводимой в колонку однократно в виде концентрированного раствора. Высокая стоимость сорбентов для аффинной хроматографии частично окупается их повышенной специфичностью, позволяющей перерабатывать значительно большие объемы смеси за один цикл.

Благодаря высокой специфичности связывания четкий фронт адсорбированного компонента движется через слой иммуносорбента практически без изменения профиля концентраций. По этой причине, как уже отмечалось выше, разделяемую смесь целесообразно пропускать через аффинную колонку до насыщения, которое обнаруживается по появлению выделяемого вещества в элюате. Чрезмерная загрузка колонки вызывает потерю вещества с растворителем, а недостаточная загрузка приводит к тому, что нижняя часть этой обычно очень дорогой колонки не используется (рис. 11.24).

Изучение сорбции при связывании антигена с антителом в зависимости от молекулярной массы антитела показывает, что пористые носители оказывают существенное сопротивление массопереносу. В таких случаях простая равновесная модель, например уравнение (11.18), неприменима. К тому же недавно было экспериментально показано, что скорость образования комплекса антиген—антитело также может заметно влиять на общую скорость сорбции антигена.

При описании явлений массопереноса вместо длины колонки удобно использовать другой параметр, который называется количеством переносимых единиц (Number of Transfer Units, NTU), необходимым для достижения заданной степени разделения. Рассмотрим в качестве примера ситуацию, когда массоперенос лимитируется внешним сопротивлением. Если k_la (Δc)—скорость переноса, отнесенная к единице объема, то необходимая скорость переноса (выраженная через число молей в единицу времени) составляет V_kla (Δc). Разделив это выражение на VΔc и умножив на L/u₀ (u₀ — поверхностная скорость), получим безразмерный параметр — необходимое число переносимых единиц:

В хроматографии на иммуносорбентах процессы внутреннего переноса замедлены. Если общую скорость переноса лимитируют внутренний перенос и прочное связывание, то [29, 39]

(11.20)

 

РИС. 11.24. Кривая отклика (зависимость концентрации адсорбированного вещества в элюате от продолжительности подачи раствора разделяемых веществ в свежую колонку) для аффинной хроматографии. Если подачу раствора прекратить при концентрации свт, то часть емкости колонки не используется. Небольшое количество выделяемого вещества теряется с растворителем. (Воспроизведено с разрешения из работы: Arnold F. Н., Blanch Н. Wilke С. R., in Purification of Fermentation Products, Le Roith D. et al. (eds.), p. 113, ACS Symposium Series, 271, 1985. © American Chemical Society.)

Зависимость между NTU, безразмерной концентрацией элюируемого вещества c_e(c_e≡c/c_f) и безразмерным временем т для случая необратимой адсорбции описывается уравнением [38, 39]

(11.21а)

где

(11.216)

и

(11.21в)

РИС. 11.25. Найденные экспериментально (---) и рассчитанные с помощью модели (——) кривые отклика для колонки размером 1,5x16,5 см, содержащей моноклональные антитела на носителе из пористого стекла, с определенным диаметром пор. Значения других параметров: u₀=0,011 см/с, ε=0,6, d_p=0,01 см, τ=1 при V_L—εV_C=211 мл. (Воспроизведено с разрешения из работы; Arnold F. Н., Blanch Н. W., Wilke С. R., Purification of Fermentation Products, LeRoith D. et a], (eds.), p. 113, ACS Symposium Series, 271, 1985. © American Chemical Society.)

 

В уравнении (11.21в) параметр q_f* обозначает концентрацию адсорбированного вещества в твердой фазе, находящегося в равновесии с растворенным веществом в концентрации c_f.

Для модели псевдогомогенной диффузии (например, в гелевой фазе, в которой диаметр пор не имеет большого значения) [38]

(11.22)

где ψ_PH — поправочный коэффициент, имеющий величину порядка единицы. Для необратимой адсорбции в такой системе зависимость концентрации элюируемого вещества от времени описывается уравнением

(11.23)

На рис. 11.25 приведены результаты экспериментов, выполненных на небольшой колонке, в которой в качестве носителя для моноклональных антител, специфичных в отношении арсаниловой кислоты (ARS), применяли стекло с определенным диаметром пор. На этой колонке выделяли комплекс ARS и альбумина сыворотки быка. Уравнение (11.21) удовлетворительно описывает профиль концентрации элюируемого в этой системе вещества и условия элюирования, если NTUnopa принять равным 8.

РИС. 11.26. Кривые отклика, предсказываемые моделью [уравнения (11.20) и (11.21)] для колонки размером 15X60 см, содержащей моноклональные антитела на носителе (пористом стекле с определенным диаметром пор). Емкость колонки по отношению к растворенному веществу в состоянии равновесия эквивалентна 77,1 л исходного раствора. Здесь V_L — объем жидкости, пропущенной через колонку, V_C — объем колонки, ε — доля пустот в объеме. Кривые 1, 2 и 3 отвечают u₀=0,020; 0,015 и 0,10 см/с соответственно. (Воспроизведено с разрешения из работы: Arnold F. Н., Blanch Н. W., Wilke С. R., іп Purification of Fermentation Products, LeRoith D. et al. (eds.), p. 113, ACS Symposium Series, 271, 1985. (6) American Chemical Society.)

 

Если скорость десорбции лимитируется диффузией в поры, то работу большей колонки можно рассчитать по уравнениям (11.21) и (11.20). Предсказываемые математической моделью кривые отклика для большой колонки при различных скоростях движения жидкой фазы представлены на рис. 11.26. В аффинной хроматографии существенную роль может играть и кинетическое сопротивление связыванию антигена; этот вопрос подробно освещен в работе [39].

 

Разделение с помощью мембран

 

Принципиальное преимущество методов разделения с помощью мембран заключается в возможности их осуществления без фазового перехода или межфазового переноса, и поэтому любое выделяемое вещество постоянно находится в водном окружении. Один из принципов разделения с помощью мембран основан на различной проницаемости мембран для молекул разных размеров. Существуют два основных метода разделения с помощью мембран — обратный осмос и ультрафильтрация; возможность их применения определяется диаметром молекул выделяемых веществ, который изменяется в следующих пределах:

 

Обратный осмос

Если раствор какого-либо вещества и чистый растворитель разделить мембраной, непроницаемой для растворенного вещества, но проницаемой для… (11.24) Здесь B2, B3—вириальные коэффициенты растворенных веществ.

РИС. 11.27. Концентрационная поляризация, вызванная повышением концентрации растворенного вещества (или веществ) (S) вблизи обращенной к потоку поверхности мембраны.

 

Это явление, называемое концентрационной поляризацией, устанавливает верхний предел скорости переноса растворителя через мембрану против градиента концентрации. Как показано на рис. 11.28, перемешивание слоя раствора, примыкающего к обращенной к раствору поверхности мембраны, может способствовать снижению сопротивления переносу. Механизм этого эффекта аналогичен снижению сопротивления осадка вблизи фильтрующей поверхности при фильтровании с параллельным фильтрующей поверхности потоком.

 

РИС, 11.28. Индуцированное концентрационной поляризацией отклонение от линейной зависимости скорости переноса растворителя через мембрану от давления; повышение давления в конце концов приводит к постоянной скорости переноса растворителя против градиента концентрации. [Воспроизведено с разрешения из работы: Porter М. С., in Enzyme Engineering, Wingard L. В., Jr. (ed.), p. 119, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1972,]

Общее осмотическое давление многокомпонентного раствора (если пренебречь всеми возможными взаимодействиями между растворенными веществами) равно сумме осмотических давлений отдельных компонентов:

(11.27)

В этом случае скорость переноса растворителя через мембрану против градиента концентрации опять-таки пропорциональна (Δp—π_t), так что перенос каждого растворенного вещества зависит как от общего осмотического давления, так и от проницаемости и коэффициента отражения данного вещества; следовательно, концентрационная поляризация любого растворенного вещества снижает скорость переноса всех растворенных веществ.

В отсутствие заметного переноса растворителя против градиента концентрации при циркуляции и постоянном обновлении растворителя происходит диализ — непрерывная диффузия небольших молекул в циркулирующий растворитель и удерживание больших молекул. На принципе диализа основана работа аппарата типа «искусственной почки», который удаляет соли и низкомолекулярные вещества, являющиеся отходами жизнедеятельности организма человека (например, мочевину; см. табл. 11.7), и в то же время эффективно удерживает высокомолекулярные вещества, например белки и полисахариды. Если удаление одного из низкомолекулярных веществ по каким-либо причинам нежелательно, то оно должно иметься в достаточной концентрации в циркулирующей жидкости; так, при очистке диализом фермента (пример 11.1, стадия 7) для отделения низкомолекулярных веществ применяют 10^{-3 М фосфатный буфер.}

 

Ультрафильтрация

Если средний диаметр пор мембраны превышает размер пор в процессе обратного осмоса, то через мембрану проникают все вещества с диаметром молекул 1… Если концентрационная поляризация обусловлена макромолекулами (т. е. значение… Для анализа процессов ультрафильтрации в зависимости от конкретной ситуации применялось несколько подходов:

Электрофорез

Электрофорезом называют разделение веществ благодаря различной скорости их перемещения в электрическом поле. Постоянная скорость uE, достигаемая… (11.29) Для глобулярных белков можно использовать закон Стокса в применении к сопротивлению сферы радиуса rp, движущейся в…

Сочетание нескольких операций разделения

 

Если в одном резервуаре проводить несколько операций, то таким путем можно сократить как время процесса (т. е. эксплуатационные расходы), так и число аппаратов (т. е. капиталовложения). Эти возможности, однако, редко удается реализовать, поскольку совмещение различных операций возможно только в случае одновременного выполнения требований, предъявляемых к каждой из операций. В этом разделе мы приведем несколько примеров, иллюстрирующих как преимущества, так и недостатки некоторых способов сочетания различных операций разделения.

 

РИС. 11.32. Локализация белковых компонентов в электрофоретической ячейке до (а) и после (б) электрофореза. (С любезного разрешения компании Beckman Instruments, Inc.)

 

Иммобилизованные клетки

 

Иммобилизованные клетки (гл. 9) одновременно выполняют операции биотрансформации (или биосинтеза) и отделения биокатализатора от культуральной жидкости. Они могут проявлять каталитическую активность в псевдоожиженном или в неподвижном слое. Преимуществом процессов с участием иммобилизованных клеток является отсутствие необходимости в отдельной операции отделения биомассы, а к числу их недостатков относится высокая стоимость носителя клеток и их иммобилизации. Кроме того, иммобилизованные клетки могут расти и в конце концов частично просачиваться в среду, что, естественно, сводит на нет только что отмеченные преимущества таких биокатализаторов. Этот недостаток можно устранить путем предотвращения клеточного роста в среде, практически лишив их того или иного незаменимого питательного вещества (например, источника азота); в таких случаях время от времени, когда каталитическая активность клеток ззхметно снижается, катализатор регенерируют.

 

Операции переработки цельного бульона

 

При переработке цельного бульона продукт выделяют без предварительного отделения биомассы или иных твердых веществ. В таких операциях применяют методы экстракции, ионного обмена, диализа, адсорбции (на активированном угле), разделения с помощью мембран и (или) фильтрования.

В качестве примера на рис. 11.33 представлены результаты изучения процесса биосинтеза антибиотика циклогексимида в присутствии гидрофобной ионообменной смолы и в ее отсутствие. На смоле адсорбируется более 98% циклогексимида; в промышленных процессах смолу необходимо регенерировать. Выход антибиотика после его десорбции со смолы бутилацетатом практически такой же, как и после прямой экстракции растворителем из культуральной жидкости, но в первом методе выделения чистота продукта значительно выше.

Летучий продукт метаболизма, обладающий ингибиторными свойствами (например, этанол), молено непрерывно удалять отгонкой в вакууме; при низкой температуре в вакууме дрожжевые клетки (вместе с культуральной жидкостью) могут без потери жизнеспособности рециркулировать с одновременной отгонкой этанола.

Непосредственную экстракцию растворителем применяют при выделении пенициллинов и стероидов. Как было показано, для этих целей можно использовать и экстракцию в системе из двух водных фаз с участием полиэтиленгликоля, хотя этот метод, по-видимому, намного дороже из-за высокой стоимости полиэтиленгликоля.

РИС. 11.33. Зависимость концентрации циклогексимида от времени в обычном процессе (а, б) и в присутствии 6% (по массе) смолы XAD-4 (в, г), добавленной через 48 ч после начала процесса. [Из статьи: Wang Н., Ann. N. Y. Acad. Sci., 413, 313 (1983).]

 

Непосредственное выделение продукта из бульона путем адсорбции на ионообменных смолах применялось в производстве антибиотиков стрептомицина и новобиоцина на пилотных и крупномасштабных промышленных установках [37]. В этом случае через ряд последовательно соединенных адсорберов с неподвижным слоем ионообменной смолы непрерывно пропускают поток цельного бульона (рис. 11.34). Такую систему можно описать с помощью простой модели переходного состояния типа

(11.32)

где V_c объем жидкой фазы в n-й колонне, л; c_n-1, c_n концентрация антибиотика на входе и выходе из n-й колонны соответственно; F — объемная скорость потока, л/ч; V_R — объем смолы в n-й колонне, л; w_n — концентрация антибиотика в смоле, г/(л смолы); t — время, ч. Смола очень прочно связывает антибиотик, поэтому в каждой частице ионообменника антибиотик распределяется неравномерно, а связывание антибиотика осуществляется не с постоянной скоростью, а таким образом, что сопротивление его переносу внутрь частицы возрастает во времени. Для описания такой ситуации удобно использовать зависимость кажущегося коэффициента массопереноса от степени адсорбции.

РИС. 11.34. Каскад адсорберов для выделения антибиотика. [Воспроизведено с разрешения из статьи; Belter Р. А., Cunningham F. С., Chen I. W., Development of а Recovery Process for Novobiocin, Biotech. Bioeng., 15, 533 (1973).]

 

Следовательно, скорость адсорбции антибиотика можно выразить уравнениехм

(11.33)

где кажущийся коэффициент массопереноса k, определяемый как k=f(w/w_max), равен

(11.34)

Наконец, c* описывается изотермой Фрейндлиха

(11.35)

Когда концентрация антибиотика на выходе из последнего адсорбера достигает заданной величины, первый адсорбер переключают на выделение антибиотика, а в конце системы устанавливают еще один адсорбер со свежей ионообменной смолой. Полуэмпирическая модель [уравнения (11.33) — (11.35)] полезна в том отношении, что она позволяет достаточно точно описать процесс выделения антибиотика из цельного бульона путем полупериодической адсорбции на ионообменной смоле. Такой процесс выделения был разработан, чтобы избежать дорогостоящей операции отделения мицелия фильтрованием, сопровождающейся потерей существенного количества антибиотика вместе с отфильтрованным мицелием.

При экстракции цельного бульона возникают проблемы, связанные с адсорбцией других растворенных веществ (сопутствующих белков, непрореагировавшего субстрата и т. д.), что может уменьщить емкость сорбента и привести к снижению степени чистоты элюируемого продукта; с загрязнением мембран, если их регулярно не очищать; с образованием в системе типа растворитель — бульон трудноразделяющихся эмульсий, способствующих осаждению твердых веществ в аппаратуре, а также потере растворителя с отбрасываемой водной фазой.

В общем случае удачная система выделения должна быть достаточно селективной, нетоксичной по отношению к растущей культуре, способной функционировать в асептических условиях, а в случае ее высокой стоимости должна регенерироваться и использоваться многократно.

 

Рециркуляция и операции выделения

 

В системах с рециркуляцией совмещены операции выделения каких-либо компонентов из содержимого биореактора или обрабатываемого бульона и повторного добавления последнего в биореактор как дополнительного исходного материала. При этом возможны три основных варианта, когда рециркуляции подвергается газовая фаза, водная фаза или биомасса (биомассу можно также удерживать в реакторе в процессе рециркуляции). В первом варианте, рассмотренном ранее в гл. 9, используют только такие биореакторы, конструкция которых позволяет вновь вводить в реактор отходящие газы после их разделения. Рециркуляция биомассы применяется в основном в процессах аэробной переработки отходов (гл. 14), а соответствующие теоретические проблемы были рассмотрены в гл. 9. Различные операции с применением мембран (фильтрование с параллельным фильтрующей поверхности потоком, ультрафильтрация) обеспечивают удерживание клеток в биореакторе и приблизительно такие же скорости процессов, что и рециркуляция клеток.

Перспективы эксплуатации крупномасштабных биореакторов, предназначенных, например, для производства белка одноклеточных организмов или этанола, требуют специальной аппаратуры для рециркуляции воды. Так, установка производительностью 50 000—70 000 т сухого белка одноклеточных организмов в год расходует за тот же период 2—2,8 млн. т воды. Сброс такого количества воды привел бы к потере неполностью утилизированных питательных веществ и полезных (не выделенных) органических побочных продуктов, а также к повышению стоимости процесса обработки сточных вод, если их предполагается использовать, например, в системах оборотного водоснабжения. В регионах с засушливым климатом рециркуляция воды может стать решающим фактором, определяющим целесообразность биопроцесса. Так, указанное выше количество воды, необходимое для крупномасштабного биопроцесса, составляет одну четверть годового потребления пресной и опресненной воды в основном промышленном районе Кувейта.

С рециркуляцией связано несколько факторов, которые могут существенно влиять на работу биореактора:

 

1. Накопление секретируемых в среду метаболитов или продуктов лизиса клеток, обладающих ингибиторными свойствами. (Эти вещества могут образовываться как в биореакторе, так и при выделении продукта.)

2. Накопление нежелательных или не используемых компонентов питательных веществ.

3. В случае смешанных культур селективная рециркуляция биомассы может привести к изменению состава культуры.

 

Аналитическое изучение работы реакторов с помощью математических моделей типа рассмотренных в гл. 9 показывает, что в системах с ингибированием

 

1. Рециркуляция воды всегда приводит к снижению степени превращения по сравнению с системой без рециркуляции при той же скорости разведения.

2. При постоянной скорости подачи питательных веществ (отнесенной к единице объема) рециркуляция также приводит к снижению степени превращения субстрата.

3. Для каждой системы с рециркуляцией существует определенное критическое отношение рециркуляции, ниже которого влияние рециркуляции на степень превращения относительно невелико, а выше которого степень превращения субстрата существенно снижается.

 

Выше мы отмечали, что рециркуляция в биологическом реакторе приводит к обратному смешению; как и в других областях химической технологии, на превращения положительного порядка (например, описываемые уравнением Моно, в котором скорость превращения субстрата пропорциональна его концентрации ів дробной степени) накладывается обратное смешение. Отсюда следует, что рециркуляция воды во всех случаях приводит к необходимости использовать больший (и более дорогой) реактор; связанные с этим дополнительные расходы должны перекрываться экономией, достигаемой за счет сокращения» количества необходимой воды.

 

Последовательность операций выделения продуктов процессов биохимической технологии

В этом разделе мы изучим последовательность операций выделения и очистки продуктов биопроцессов и приведем несколько примеров таких типичных для… Прежде чем перейти к изучению деталей технологии выделения и очистки, полезно… Судя по богатому опыту, накопленному в фармацевтической промышленности, при проведении биопроцессов необходимо…

Выделение ферментов в промышленных процессах

Ферменты выделяют в виде неочищенных сухих препаратов, разбавленных или концентрированных растворов или высокоочищенных (иногда даже…

РИС. 11.35. Выделение ферментов в промышленном масштабе.

 

В связи с тем, что по мере повышения степени чистоты фермента масштабы операций выделения (объемы обрабатываемых растворов) уменьшаются, на более поздних стадиях очистки, как показано на рис. 11.37 для протеазы, от непрерывной переработки переходят к работе в периодическом режиме.

РИС. 11.36, Непрерывный процесс выделения фермента пролил-тРНК-синтетазы из маша (фасоли золотистой). [Из работы: Lilly М. D., Dunnill Р., Science J., 5, 59 (1969),] 1 — охлаждаемый змеевиковый экстрактор; 2 — центрифуга со шнековой выгрузкой; 3 — центрифуга; 4 — рН-метр; 5 — секция выдержки при охлаждении; 6 — дисковая центрифуга.

 

Обратите внимание на следующие дополнительные операции, введенные с целью повышения выхода фермента: 1) многократная промывка биомассы; 2) двустадийная ультрафильтрация, позволяющая ступенчато уменьшить объем смеси в 5 раз; 3) переход от непрерывной к периодической ультрафильтрации, позволяющей уменьшить объем смеси еще в 40 раз.

Важной отраслью микробиологической промышленности является производство протеаз (и других гидролаз) в качестве добавок к синтетическим моющим средствам. В 1978—1979 годах во всем мире производилось около 500 т (в расчете на чистый фермент) бактериальных протеаз из Bacillus, стоимость которых составляла 40% стоимости всех выпущенных мировой промышленностью ферментов. Вначале их выпускали в виде сухого порошка, в состав которого входили частицы диаметром менее 10 мкм.

РИС.11.37. Выделение внеклеточного фермента (протеазы). Исходную смесь для выделения получали в периодическом биореакторе рабочим объемом 200 м³ в течение 10 ч с последующей чисткой реактора в течение 2 ч. (Воспроизведено с разрешения из работы: Atkinson В., Mavituna F., Biochemical Engineering and Bioteclinology Handbook, p. 918, Macmillan Publishers Ltd., Surrey, England, 1983.)

 

РИС. 11.38. Процесс производства бактериальной протеазы, в котором не образуются аэрозоли; на частицы фермента наносят парафиновое покрытие. [Воспроизведено с разрешения из работы: Austrup К., Andersen О., Falch Е. А., Nielsen Т. К-, in Microbial Techinology, Peppier Н. J., Perlman D. (eds.), 2d ed., vol. I, p. 281, Academic Press, Inc., N.Y., 1979.]

 

Образуемые протеазами аэрозоли вызывали у рабочих, занятых в их производстве, аллергическую реакцию, что явилось причиной временного запрета на продажу детергентов с добавками ферментов в США. Последующая разработка технологического процесса получения гранулированных, не образующих аэрозоли ферментов (рис. 11.38) позволила отменить этот запрет. В настоящее время содержащие протеазы гранулированные препараты выпускают в виде покрытых парафином сфер диаметром около 500 мкм (рис. 11.38) или в виде порошка в парафиновой матрице.

 

РИС. 11.39. Основные операции очистки грех белков человека, синтезированных в культуре рекомбинантных Е. coli. [Воспроизведено с разрешения из статьи: McGregor W. С., Large-Scale Isolation and Purification of Proteins from Recombinant E. coli, Ann. N. Y. Acad. Sci., 413, 231 (1983).]

 

11.8.2. Выделение внутриклеточных чужеродных белков из культур рекомбинантных Е. coli

 

Если белок синтезируется в генетически модифицированном организме и предназначается для инъекций животным, то его необходимо тщательнейшим образом очистить. Так, пирогены из E.coli, 0 том числе липополисахариды (LPS) внешней оболочки бактерии, необходимо отделить или инактивировать. (В организме человека LPS вызывают лихорадку в дозах, превышающих 0,5 нг/кг массы тела.) Кроме того, продукт должен быть защищен от действия протеаз E. coli. Для этой цели при выделении и очистке продукта к буферному раствору часто добавляют ингибитор сериновых протеаз—метилсульфанилфторид.

На рис. 11.39 приведены последовательности операций при очистке инсулина человека, гормона роста человека и лейкоцитарного интерферона человека, синтезированных в культурах рекомбинантных E. coli. В каждом процессе для достижения необходимой степени чистоты использовіали ряд операций осаждения и хроматографического разделения [22].

Если белок синтезируется в рекомбинантной E. coli в больших количествах, то он часто накапливается в виде внутриклеточных структур, обладающих специфической преломляющей способностью (см. рис. 6.27). Эти упорядоченные образования легко отделяются от дезинтегрированных путем лизиса клеток центрифугированием. В таких образованиях, однако, молекулы белков связаны множеством поперечных связей, поэтому для выделения белка в нативном виде осадок после центрифугирования необходимо растворить и ренатурировать. На рис. 11.40 приведена методика растворения этих структур методом окислительного сульфитолиза с последующей ренатурацией растворимого денатурированного белка за счет его складывания в соответствующую третичную структуру и образования дисульфидных связей. Эти методы были разработаны исследовательской группой компании Genencor, Inc. в связи с работами по клонированию и экспрессии гена реннина в E. coli.

 

Выделение полисахаридов

 

Основным методом выделения полисахаридов и их производных является осаждение спиртом. Декстраны представляют собой чрезвычайно ценные полисахариды, широко используемые, в частности, в пищевой промышленности и медицине, поэтому процесс выделения и очистки декстранов (рис. 11.41) включает несколько операций осаждения спиртом и промывки свободной от пирогенных веществ водой. Образующийся при первом осаждении осадок подвергают частичному гидролизу затем отделяют (негидролизующиеся) нерастворимые твердые вещества. Продукт очищают двукратной фракционной кристаллизацией, а оставшиеся примеси удаляют с помощью ионообменных смол. При получении ксантана бульон стерилизуют (в результате чего погибают все клетки), осаждают изопропанолом, затем высушивают распыливанием и измельчают; полученный таким путем ксантан можно использовать в пищевой промышленности.

РИС. 11.40. Превращение внутриклеточных образований в растворимый активный белок путем окислительного сульфитолиза и образования дисульфидных связей. (GSH и GSSG — восстановленная и окисленная форма глутатиона соответственно). (С любезного разрешения Б. Лоулиса и К. Хайенги, Genencor, Inc.)

 

Выделение антибиотиков

Антибиотики выделяют или в виде сравнительно неочищенных препаратов (примером может служить натриевая соль пенициллина; см. рис. 11.42) или в виде… РИС. 11.41. Выделение декстрана из бульона с низким содержанием нерастворимых веществ. Установка для производства…

Выделение органических кислот

 

Лимонную, глюконовую и итаконовую кислоты выделяют (в виде цитрата кальция, глюконата натрия или кальция, свободной итаконовой кислоты) путем осаждения после предварительного отделения биомассы фильтрованием. В производстве лимонной кислоты цитрат кальция обрабатывают серной кислотой (рис. 11.43), осадок сульфата кальция отбрасывают, а лимонную кислоту или ее натриевую соль осаждают в кристаллическом виде и выделяют центрифугированием. Последующая операция сушки зависит от требований, предъявляемых к продукту (безводная кислота, моногидрат, натриевая соль) При получении чистой итаконовой кислоты ее раствор обрабатывают активированным углем; эта операция не является обязательной в процессе производства технической кислоты.

 

Выделение этанола

РИС. 11.43. Выделение органических кислот. Приведена схема производства…  

Выделение белка одноклеточных организмов

При выделении биомассы, являющейся главным, а не побочным (как, например, при производстве глутаминовой кислоты или антибиотиков) продуктом… РИС. 11.44. Производство чистого этанола методом азеотропиой дистилляции (Э — этанол, В — вода, Б — бензол). (Из…

Заключение

 

Основной задачей процессов выделения (независимо от того, состоит ли этот процесс из одной операции или ряда последовательных операций) является получение продукта, обладающего заданной степенью чистоты, необходимой концентрацией и устойчивостью. Эта глава представляет собой введение в изучение принципов, лежащих в основе отдельных операций выделения; в ней также приведено несколько конкретных примеров выделения продуктов биохимической технологии.

Как показано на рис. 11.45, расходы на выделение продукта непосредственно зависят от его концентрации в бульоне, поступающем в систему выделения и очистки. Прослеживаемая на этом рисунке четкая зависимость стоимости вещества от его концентрации в исходной смеси напоминает о том, что в настоящее время совершенствование процессов биохимической технологии должно быть направлено в первую очередь на модернизацию начальных операций в биореакторе с тем, чтобы повысить концентрацию продукта в реакционной смеси и таким образом снизить расходы на последующие операции выделения, очистки и регенерации. В конечном итоге сравнивать все ресурсы, необходимые для каждой операции (хранения и обработки исходных материалов, биореакции, разделения и очистки), можно только тогда, когда все затраты на каждую операцию представлены в денежном выражении. Основам экономики процессов биохимической технологии посвящена первая часть следующей главы, а во второй ее части будет приведен ряд конкретных примеров.

 

РИС. 11.45. Зависимость продажной цены продуктов биопроцесса от их начальной концентрации в бульоне или среде, поступающих в систему выделения и очистки. [Воспроизведено с разрешения из статьи: Dwyer J. L., Scaling Up Bioproduct Separation with High Performance Liquid Chromatography, Bio/Technology, 2, 957 (1984).]

 

Упражнения

11.1. Осаждение биомассы. а) Вычислите кажущийся размер изолированных частиц, если известны их плотности (ρ) н скорости осаждения (us): первичный осадок в сточных водах (гл. 14) (ρ=1,001 г/см3, us=0,042… частицы активного ила (гл. 14) (ρ=1,005 г/см3 и,=0,2 см/с);

Литература

 

Последовательные операции выделения продуктов:

1. Atkinson В., Mavituna F., Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook, Macmillan Publishers Ltd., Surrey, England, 1983. (B главах 12—14 приведено множество интересных примеров.)

2. Belter P., General Procedures for Isolation of Fermentation Products, in Microbial Technology, Peppier H. J., Perlman D. (eds.), 2d ed., vol. 2, p. 403, Academic Press, New York, 1979.

3. Edwards V., Recovery and Purification of Biologicals; Adv. Appl. Microbiol 11, 159 (1969).

 

Выделение биомассы и нерастворимых материалов:

4. Aiba S., Nagatani М., Separation of Cells from Culture Media; Adv. Biochem. Eng., 1, 3 (1971).

5. Belter P., Recovery Processes: Past, Present, Future, 184th Amer. Chem. Soc. Mtg., September, 1982.

6. Fermentation and Biochemical Engineering Handbook, Vogel H. C. (ed.), Noyes Publications, Park Ridge, N. J., 1983. (Главы 5 и 10 посвящены фильтрованию и центрифугированию соответственно.)

7. Weissman U., Binder Н., Biomass Separation from Liquids by Sedimentation and Centrifugation, in Adv. Biochem. Eng., Fiechter A. (ed.), vol. 24, p. 119, Springer-Verlag, Berlin, 1982. (Седиментация.)

8. Weber W. J., Jr., Physicochemical Processes for Water Quality Control, Wiley-Interscience, N. Y., 1972. (Имеются главы, посвященные детальному анализу коагуляции, седиментации и фильтрования.)

9. Shirato S., Esumi S., Filtration of a Culture Broth of Streptomyces griseus; J. Ferment. Technol. (Japan), 41, 87 (1963).

10. Gabler R.. Ryan M., Processing Cell Lysate with Tangential Flow Filtration, in Purification of Fermentation Products, LeRoith D. et al. (eds.), Amer. Chem. Soc., Symposium Ser., 271, 1 (1985).

11. Zahka J., Leahy T. J., Practical Aspects of Tangential Flow Filtration in Cell Separations, Purification of Fermentation Products, LeRoith D. et al. (eds.), Amer. Chem. Soc. Symposium Ser., 271, 51 (1985).

12. Todd D. В., Podbielniak W. J., Centrifugal Extraction; Chem. Eng. Progress, 61, (5), 69 (1965).

13. Queener S., Swartz R., Secondary Products of Metabolism, in Economic Microbiology, Rose A. H., (ed.), vol. 3, p. 35, Academic Press, London, 1979. (Экстракция пенициллина растворителями.)

14. Shreve R. N., Brink J., The Chemical Process Industries, McGraw-Hill, New York, 1977. (Имеются главы, посвященные процессам фармацевтической промышленности, в том числе выделению антибиотиков адсорбцией и экстракцией.)

15. Альбертсон П.-О., Разделение клеточных частиц и макромолекул. — М.: Мир, 1974. (Здесь впервые подробно описан метод экстракции в двухфазных водных системах.)

 

Выделение и очистка;

16. Киіа М. R., Kroner К. Н., Hustedt Н., Purification of Enzymes by Liquid-Liquid Extraction; Adv. Biochem. Eng., 24, 103 (1982). (Выделение белков экстракцией в двухфазной водной системе.)

17. Menge U., Киіа М. R., Purification Techniques for Human Interferons; Enz. Microb. Technol., 6, 101 (1984). (Экстракция в двухфазной водной системе и высокоэффективная жидкостная хроматография.)

18. Darbushire J., Large Scale Enzyme Extraction and Recovery, Topics in Enzyme and Fermentation Biotechnology, Wiseman A. (ed.), vol. 5, p. 147, Halsted Press/J. Wiley, N. Y., 1981.

19. Grabender G. C., Glatz C. E., Protein Precipitation: Analysis of Particle Size Distribution and Kinetics; Chem. Eng. Commun., 12, 203 (1981).

20. Bell D. J., Hoare M., Dunnill P., Formation of Protein Precipitates and Their Centrifugal Recovery, in Adv. Biochem. Eng., Fiechter A. (ed.), vol. 26, p. 1, Springer-Verlag, Berlin/N. Y., 1983.

21. Flaschel E., Wandrey Ch., Kula M. R., Ultrafiltration for the Separation of Biocatalysts, in Adv. Biochem. Eng., Fiechter A. (ed.). vol. 26, p. 73, Springer-Verlag, Berlin/N. Y., 1983.

22 McGregor W. C., Large Scale Isolation and Purification of Proteins fromE. Coli; Ann, N. Y. Acad. Sci., 413, 231 (1983).

23. Schoner R. G. at al.. Isolation and Purification of Protein Granules from E. coli Cells Overproducing Bovine Growth Hormone; Bio/Technology. 3, 151 (1985).

24. Joustra M. K., Gel Filtration on Agarose Gels, in Prog, in Separation and Purification, vol. 2, p. 183, Wiley-Interscience, N. Y., 1969.

25. Dubin P. L., Aqueous Size Exclusion Chromatography, in Separation and Purification Methods, 10(2), 287 (1981).

26. Graves D. J., Wu Y. Т., The Rational Design of Affinity Chromatography Separation Processes, in Adv. Biochem. Eng., Fiechter A. (ed.), vol. 12, p. 219, Springer-Verlag, Berlin/N. Y., 1979.

27. Eveleigh J. \F., Practical Considerations in the Use of Immunosorbents and Associated Instrumentation, in Affinity Chromatography and Related Techniques, Gribneau T. C. J. et al. (eds.), Elsevier, Amsterdam, 1982.

28. Chase H. A., Affinity Separations Using Immobilized Monoclonal Antibodies; Chem. End. Sci., 39, 1099 (1984).

29. Arnold F. H., Chalmers J. J., Saunders M. S., Croughan M. S., Blanch H. Wilke C. R., A Rational Approach to Scale-Up of Affinity Chromatography, in Purification of Fermentation Products, LeRoith D. et al. (eds), Amer. Chem. Soc. Symp. Ser., 271, 113 (1985).

30. So/er G., Chromatographic Removal of Pyrogenic Material; Bio/Technology, 2, 1035 (1984).

31. Janson J. C., Large Scale Affinity Purification — State of the Art and Future Prospects; Trends in Biotechnology, 2(2), 31 (1984).

32. Maiorella В., Wilke C. R., Blanch H., Alcohol Production and Recovery, Adv. Biochem. Eng., vol. 20, p. 43, 1981. (Процессы и экономика выделения этанола.)

33. Whitesides G. М. et al.. Magnetic Separations in Biotechnology; Trends in Biotechnology, 1(5), 144 (1983).

34. Beaton N. C., Steadly H., Industrial Ultrafiltration, in Recent Developments in Separation Science, vol. VII, p. 1, 1982.

35. Smith I. H., Pace G. H., Recovery of Microbial Polysaccharides; J Chem Tech. Biotechnol., 32, 119 (1982).

36. Fish N. M., Lilly M. D., The Interactions between Fermentation and Protein Recovery; Bio/Technology, 2, 623 (1984).

37. Belter P. A., Cunningham F. C., Chen J. W., Development of a Recovery Process for Novobiocin; Biotech. Bioeng., 15, 533 (1973).

38. Vermeulen Т.. Adsorption and Ion Exchange, in Chemical Engineers' Handbook, Perry R. H., Chilton C. H. (eds.), 5th ed., Section 16, McGraw-Hill, New York, 1973. (Есть перевод 4-го издания: Перри Дж. Г., Справочник инженера-химика, т. I, гл. VIII. —Л.: Химия, 1969.)

39. Arnold F. Н., Blanch Н. W., Wilke С. /?., Analysis of Affinity Separations; The Chem. Eng. J., 30, 39, B25 (1985).
Глава 12

 

Экономика процессов биохимической технологии

В этой главе мы рассмотрим роль экономических факторов в изучении, внедрении и эксплуатации процессов биохимической технологии. В первом разделе… Мы отметим также особенности каждого типа продуктов процессов биохимической…  

Экономика технологических процессов

 

Таблица 12.1. Основные этапы разработки проекта предприятия и его создания

Экономические факторы играют важную роль практически на каждом этапе разработки проекта предприятия (табл. 12.1). Для того чтобы проект в конечном итоге был реализован в промышленном масштабе, этапы разработки проекта должны включать идею создания процесса или выпуска определенного продукта; предварительную оценку экономики и рынков сбыта; разработку всех дополнительных данных, необходимых для ·создания окончательного варианта детального проекта; окончательную экономическую оценку проектируемого предприятия в свете всех полученных данных; создание детального технического проекта; обеспечение предприятия территорией и оборудованием; строительство зданий и сооружений и монтаж оборудования; пусковые работы, пробный пуск и, наконец, планомерную эксплуатацию предприятия.

Идея создания процесса может возникнуть под воздействием любого фактора — предложений торговых организаций, появления конкурентоспособного продукта, требований покупателей, новых предложений исследовательских центров и групп. Мысль о создании нового процесса, родившаяся внутри существующей компании может быть запатентована компанией-изготовителем; в альтернативном варианте идея нового процесса может быть заимствована из других патентов и реализована в соответствии с лицензионными соглашениями.

Предполагается, что в конечном итоге каждый проект должен окупить все затраты и принести соответствующую прибыль. Следовательно, при возникновении идеи о разработке нового процесса или выпуске нового продукта необходимо провести предварительную оценку процесса (или продукта) с точки зрения экономики и потенциального рынка сбыта. При оценке рынка сбыта учитывают потенциальный спрос при различных предположительных ценах на продукт. Рентабельность (или ее отсутствие) определяют путем изучения экономики, сравнивая расходы, необходимые для производства продукта в количестве, удовлетворяющем запросы рынка, и соответствующую себестоимость.

Если предварительная оценка показала, что данный процесс будет рентабельным, то обычно приступают к разработке данных, необходимых для создания окончательного проекта. При этом уточняют потребность рынка и себестоимость продукта, проводят тщательное изучение рынка, причем потенциальным покупателям часто направляют образцы продукта, чтобы убедиться, что он отвечает их требованиям и что предварительные оценки объема спроса на этот продукт реальны. Для определения себестоимости продукта разрабатывают полную технологическую карту процесса, определяют соответствующий объем капитальных затрат и эксплуатационных расходов, а также ежегодную прибыль на предполагаемые период выпуска продукта или на период выплаты субсидий и займов. При оценке прибыли проводят также элементарный анализ чувствительности, для того чтобы найти предполагаемые основные составные части себестоимости и эксплуатационных расходов, оказывающие наибольшее влияние на расчетную рентабельность (поскольку до выпуска продукта цены могут значительно измениться).

Прежде чем приступить к разработке детального проекта, в обзоре для руководства дается окончательный экономический анализ, в котором рассматриваются основные сравнительные характеристики проекта в целом. Экономический анализ должен дать ответы на ряд вопросов, например, как выглядит рентабельность изучаемого проекта по сравнению с рентабельностью других возможных проектов, требующих примерно таких же капитальных затрат; можно ли осуществить планируемый проект силами имеющегося в компании технического персонала и персонала системы сбыта или же планируемый проект принципиально отличается от эксплуатируемых предприятий и поэтому потребует привлечения нового персонала; какова вероятность того, что на базе планируемого проекта можно будет реализовать несколько сходных процессов, или же сфера применения проекта ограничена одним процессом; обладает ли разрабатываемый процесс достаточной гибкостью, чтобы его можно было использовать в других близких проектах (изучаемых или проектируемых), или же его (и обслуживающий персонал) можно использовать только в применении к данному проекту; каковы ожидаемые направления развития компании в целом и способствует ли планируемый проект укреплению положения компании и использованию накопленного ею технического опыта в ожидаемых направлениях развития, или же новый проект приведет к чрезмерному распылению сил компании на не связанных друг с другом направлениях. Если выводы анализа положительны, то в этом случае отпускаются средства на реализацию нескольких следующих этапов.

В детальном техническом проекте содержится вся информация, необходимая для последующего строительства предприятия, в том числе спецификация и номенклатура основного оборудования, контрольно-измерительной аппаратуры, оборудования вспомогательных служб, схемы трубопроводов и последние курсы цен. В детальный проект должна быть включена вся строительная документация, планировка расположения оборудования, а также любая другая информация, необходимая при строительстве предприятия.

Материальное обеспечение включает приобретение необходимого земельного участка и недостающего оборудования, получение разрешений на все виды планируемых работ — строительные, эксплуатационные, сооружение и подключение систем водо-, тепло-, газо- и энергоснабжения, сброса отработанных воздуха и воды, сооружения системы сточных трубопроводов и т. д. Обратите внимание на то, что для выполнения этих задач потребуется немало времени, особенно для приобретения специального или выпускаемого по заказу оборудования.

На этапе строительно-монтажных работ полностью сооружается новое предприятие, после чего начинают пусковые работы и пробный пуск. На этом этапе осуществляют пробную эксплуатацию и опробование всего предприятия и отдельных его звеньев, обучают операторов, разрабатывают инструкции по пуску, эксплуатации, остановке процесса, а также необходимые мероприятия, обеспечивающие безопасность работы. После этого приступают к завершающему этапу — эксплуатации предприятия (выпуску продукта).

На всех этапах неоднократно проверяют и уточняют исходные данные для экономического анализа с целью учета любых изменений в потребности рынка, доступности сырья, намерениях компании, ходе оформления разрешений от Управления по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств или от министерства сельского хозяйства США или в других факторах, которые могут повлиять на прогнозируемую рентабельность проекта. Поскольку соответствующие полные расчеты трудоемки и сложны, то в таких случаях обычно используют стандартные методы объективного анализа, например критерий оценки прибыли на инвестированный капитал или другой близкий критерий. Такой метод позволяет получить наиболее объективную картину. Напротив, пессимистичная или чрезмерно предвзятая оценка может привести к отклонению проекта, который на самом деле может оказаться решающим для дальнейшего развития всей компании, а чрезмерно оптимистичный подход может привести к таким расходам, которые по завершении строительства нового предприятия вызовут финансовую катастрофу.

 

Контроль за качеством продукции биохимической технологии

Вмешательство правительственных организаций в контроль за качеством продукции биотехнологии обусловлено установленной законодательными актами… В США надзор за производством биотехнологической продукции в основном… Надзор за производством медикаментов, биологических препаратов, пищевых продуктов и добавок к ним, диагностических…

Общий экономический анализ процессов биохимической технологии

Несмотря на то, что между отдельными биотехнологическими процессами с участием культур микроорганизмов имеются существенные различия, любой проект… Разработка любого биопроцесса должна быть направлена на реализацию той или…

Экономический анализ биопроцесса

В качестве примера рассмотрим среднемасштабный микробиологический процесс производства гипотетического вещества (антимикробного агента,…   1. Согласно предварительному изучению рынка, продажная цена 2,5 долл. за килограмм продукта позволит завоевать 15—25%…

Химические продукты тонких биотехнологических процессов

К химическим продуктам тонкой биотехнологии относят довольно обширную группу ценных продуктов биохимической технологии (витаминов, гормонов,…  

Ферменты

 

Таблица 12.11. Мировое производство ферментов в 1977—1978 годах^а

Как мы уже указывали в гл. 4, промышленность выпускает множество ферментов для пищевых, медицинских, диагностических и фармацевтических целей. В 1977—1978 годах промышленность США производила ферменты на общую сумму 50—55 млн. долл. В табл. 12.11 отражены результаты одной из последних оценок объема продажи ферментов на мировом рынке. Обратите внимание на то, что в 1977—1978 годах 88% суммарной продажной стоимости ферментов приходилось на бактериальные протеазъГ (применяющиеся в качестве добавок к моющим средствам), две амилазы, пектиназу и глюкозоизомеразу.

 

Производство белков с помощью рекомбинантных ДНК

Технология рекомбинантных ДНК в организмах Е. coli позволила разработать методы промышленного производства инсулина (1979 г.), гормона роста (1981… 1. Стоимость исследовательских и проектных работ, предшествовавших внедрению… 2. Стоимость обычных операций биореакции и выделения продукта в крупномасштабном производственном процессе.

РИС. 12.5. Прогнозируемое развитие производства продуктов с помощью технологии рекомбинантных ДНК. (По данным В. Хустедтера, Genentech, Inc., 1985. Воспроизведено с разрешения.)

 

Последующую очистку производят с помощью хроматографических методов, хорошо разработанных, по меньшей мере, в лабораторных масштабах. Новшеством здесь является разделение на иммуносорбентах; этот метод, вкратце рассмотренный в гл. 11, применялся для очистки интерферона и других белков.

Метод рекомбинантных ДНК оказал большое влияние на экономику процессов производства многих продуктов, предназначенных для использования в фармакологии, сельском хозяйстве и т. п. Как показано на рис. 12.5, темпы развития в каждой отрасли связаны с продажной ценой продукта и технической сложностью процесса с участием рекомбинантных ДНК. Примером чрезвычайно ценного фармацевтического препарата может служить инсулин, рынок сбыта которого к 1985 г. (начиная с 1981 г.) может удвоиться, достигнув (в США и странах ЕЭС) двух третей миллиарда долларов. Компании Eli Lilly, имеющей большой опыт в производстве и продаже инсулина и в получении разрешений на производство фармацевтических препаратов, удалось добиться разрешения на выпуск инсулина человека, на базе разработанного компанией Genentech процесса с участием рекомбинантных ДНК в течение четырех лет. Преимущества инсулина человека перед инсулинами быка и свиньи пока еще только изучаются.

Технология рекомбинантных ДНК лежит в основе разрабатываемых или внедряемых в промышленное производство процессов получения других чрезвычайно ценных продуктов; регулятор ных белков (интерферонов, гормонов роста человека и животных, нейроактивных пептидов и лимфокинов), факторов крови (альбумина сыворотки человека, антигемофилического

фактора, тромболитического и фибринолитического ферментов), вакцин (вирусных и бактериальных) и антибиотиков. Следует подчеркнуть, что с экономической точки зрения будущее технологии рекомбинантных ДНК несколько неопределенно даже в применении к очень дорогим продуктам; так, в США объем рынка сбыта вакцины для животных в стоимостном выражении обычно составляет 5—10 млн. долл. в год, что может оказаться недостаточным для поддержания компании, поэтому может возникнуть необходимость в одновременном выпуске нескольких вакцин.

Общее потенциальное влияние технологии рекомбинантных ДНК, затрагивающей практически все сферы биотехнологии, очень велико. В начале 80-х годов эта отрасль биотехнологии развивалась чрезвычайно быстрыми темпами; достаточно полный обзор состояния технологии рекомбинантных ДНК в настоящее время и перспектив ее развития, а также оценка имеющихся и потенциальных рынков сбыта продукции, получаемой по этой технологии, приведены в докладе Бюро технической оценки США за 1984 г. — Commercial Biotechnology: An International Analysis [2].

 

Антибиотики

Продукты вторичного метаболизма микроорганизмов, ингибирующие рост других микроорганизмов даже в низких концентрациях, называются антибиотиками.… Антибиотики подразделяют на группы в соответствии с диапазоном антимикробного действия (антибиотики с широким пли узким спектром активности), механизмом проявления…

Витамины, алкалоиды, нуклеозиды, стероиды

Микроорганизмы продуцируют не только белки (ферменты) и антибиотики, но и многие другие сложные метаболиты. Промышленный интерес представляют… Из витаминов, синтезированных микробиологически [витамин B12, рибофлавин (B2),… При производстве витамина B12 в периодическом режиме используются главным образом организмы Propionibacteria…

Моноклональные антитела

Когда чужеродное вещество (антиген) попадает в организм животного, например мыши, то часто иммунная система узнает его и вырабатывает специфические… В 1980-х годах моноклональные антитела быстро нашли практическое применение в… Диагностика с применением моноклональных антител имеет несколько преимуществ. Во-первых, моноклональные антитела…

Кислородсодержащие химические продукты массового производства

Для крупномасштабного производства кислородсодержащих химических продуктов применяются как анаэробные, так и аэробные процессы. Сначала рассмотрим…   Таблица 12.16. Прогнозируемый объем производства моноклональных антител в США (в миллионах долларов в ценах 1981 …

Пивоварение и виноделие

Производство пива может служить хорошей иллюстрацией ряда рассмотренных выше общих технологических принципов ферментативных процессов. Сначала… Питательную среду для роста дрожжей, называемую пивным суслом, приготавливают…  

Производство спирта в качестве топлива

Производство этанола в качестве топлива привлекло широкое внимание в последние десятилетия; впрочем, в Европе в годы, предшествовавшие второй… Сырьем для биохимических методов производства этанола служат сахара (сок…  

Производство органических кислот и аминокислот

Производство органических кислот может служить показательным примером того влияния, которое оказывает выход процесса на его экономику. Капитальные… Более умеренный выход итаконовой кислоты в непрерывном процессе (40 г/л)…  

Белок одноклеточных организмов

Белок одноклеточных организмов (БОО) — это содержащие белок материалы, представляющие собой высушенные клетки микроорганизмов. В качестве добавок к…   Таблица 12.25. Основные характеристики некоторых процессов производства белка одноклеточных организмова

Анаэробные процессы производства метана

Широко изучались анаэробные процессы превращения субстратов углеводно-целлюлозной природы (особенно отходов сельскохозяйственных производств) в…   Таблица 12.28. Сравнение затрат при некоторых способах производства биомассыа

Заключение

 

Успех эпсплуатации микробиологического процесса зависит как от технических, так и экономических факторов. Приведенный в этой главе подробный анализ экономики одного из процессов может служить моделью для изучения экономических аспектов любого другого процесса. Экономика микробиологического процесса определяется его типом; так, например, существенные различия наблюдаются в экономике тонких биотехнологических процессов, процессов получения химических продуктов массового производства, спиртных напитков, белка одноклеточных организмов и анаэробных процессов производства метана. Другие примеры будут приведены в упражнениях.

 

Упражнения

12.1. Этапы реализации процесса. Дайте определение (по памяти) следующим этапам реализации процесса: идея его создания, предварительная оценка,… 12.2. Анализ чувствительности. Приведенные в табл. 12.10 данные убедительно… 12.3. Чувствительность экономического коэффициента. В графе Б табл. 12.10 приведены данные, отражающие результаты…

Литература

 

Общие вопросы

См. работу [5] в гл. 5, а также:

1. Bartholomew W. Н., Reisman Н. В., Economics of Fermentation Processes, Microbial Technology, 2d ed., Peppier H. J., Perlman D. (eds.), vol. 2. pp. 463—496, Academic Press, Inc., New York, N. Y., 1979. (Здесь приведен пример полного описания процесса, начиная с идеи создания и кончая расчетом прибыли на инвестированный капитал.)

2. Commercial Biotechnology. An International Analysis, Oftice of Technology Assessment, Washington, D. C., January, 1984.

3. Stowell J. D., Bateson J. В., Economic Aspects of Industrial Fermentation, in Bioactive Microbial Products 2; Development and Production, Nisbet L.J., Winstanley D. J. (eds.), p. 117, Academic Press, New York, 1983.

4. Rose A. H., Economic Microbiology, vols. 1—5, Academic Press, New York,

1977—1981.

5. Peters M. S., Timmerhaus K. D., Plant Design and Economics for Chemical Engineers, 3d ed., McGraw-Hill, N. Y., 1980. (Очень подробная монография, в которой рассмотрены вопросы изучения начального проекта, оценки стоимости, накладных расходов, налогов, прибыли на инвестированный капитал, рентабельности, оптимального проекта, выбора материалов, оборудования для обработки материалов, теплообмена, массообмена и реак¬

торов.)

6. Ulrich G., А Guide to Chemical Engineering Process Design and Economics, John Wiley and Sons, New York, 1984. [Эта монография, состоящая из двух разделов, построена аналогично работе [1]; в ней рассмотрены проблемы проектирования процесса (идея создания; подготовка операционной карты; спецификация и проектирование оборудования), экономического анализа (расчет затрат на сооружение предприятия и эксплуатацию, оптимизация процесса, анализ рентабельности), подготовки технической документации.]

7. Crueger W.. Crueger А., А Textbook of Industrial Microbiology (English ed.), Science Tech., Inc., Madison, WI, 1984. (Многие главы, посвященные различным типам биохимических трансформаций, содержат и полезную информацию об экономике биопроцессов.)

8. Impact of Applied Genetics: Microorganisms, Plants, and Animals, Office of Technology Assessment, Washington, D. C., 1981. (Обзор потенциальных последствий и экономических проблем «новых» биотехнологических процессов.)

9. Microbial Technology, 2d ed., vol. 1: Microbial Processes; vol. II: Fermentation Technology, Peppier H. J., Perlman D. (eds.). Academic Press, New York. 1979. (Книга содержит множество данных о технической стороне и экономике биопроцессов).

 

Частные проблемы:

10. Swartz R. W., The Use of Economic Analysis of Penicillin G Manufacturing Cost in Establishing Priorities for Fermentation Process Improvement, Ann. Reports on Fermentation Processes, 3, 75 (1979).

11. Avgerinos G. C., Wang D. I. C., Direct Microbiological Conversion of Cellulosics to Ethanol, Ann. Reports on Fermentation Processes, 4, 165 (1979). (На с. 180—188 рассмотрена экономика процессов производства этанола.)

12. Ratledge С., Fermentation Substrates, Annual Reports on Fermentation Processes, 1, 49 (1977). (Рассмотрены вопросы стоимости субстрата.)

13. Roberts R. S. et al.. Process Optimization for Saccharification of Cellulose by Acid Hydrolysis, Biotech. Bioeng. Symp., 10, 125 (1980). (Приведен пример получения гексоз из целлюлозы при минимальных затратах.)

14. Ackerson М. et al., Two Stage Acid Hydrolysis of Biomass, Biotech. Bioeng. Symp., 10, 103 (1980). (Приведен пример превращения кукурузной соломы в сбраживаемые сахара.)

15. Constantinides А., Application of Rigorous Optimization Methods to the Control and Operation of Fermentation Processes, Ann. N.Y. Acad. Sci., 326, 193 (1979).

16. Clausen E. C., Gaddy J. L., Production of Ethanol from Biomass, Ann. N.Y. Acad. Sci., 413, 435 (1983).

17. Litchfield /., Single Cell Protein, Science, 219, 740 (1983).

18. Aunstrup K., Andresen 0., Falch E. A., Nielsen T. K., Production of Microbial Enzymes, in Microbial Technology, 2d ed.. Peppier H. J., Perlman D., (eds.), vol. 1, p. 283, Academic Press, Inc., New York, N.Y., 1979.

19. Ng T. K., Busche R. M., McDonald C. C., Production of Feedstock Chemicals, Science, 219, 737 (1983). (Основное внимание уделено возобновляемым ресурсам).

20. Maiorella В. L., Wilke С. R., Blanch Н. W., Alcohol Production and Recovery, Adv. Biochem. Eng., 20, 72 (1981). (Сравнительный анализ различных процессов, включая их экономику.)

21. Maiorella В. L., Blanch Н. W., Wilke С. R., Economic Evaluation of Alternative Ethanol Fermentation Processes, Biotech. Bioeng., 26, 1003 (1984).

22. Lenz Т., Moreira A., Economic Evaluation of the Acetone-Butanol Fermentation, Ind. Eng. Chem. Proc. Des. Dev., 19, 478 (1980).

23. Moo-Young M., Economics of SCP Production, Process Biochemistry, 12, 6 (1977).

24. Klausner A., Building for Success in Phenylalanine, Biotechnology, 3 (Aoril), 301 (1985).

25. Cuslda L. E., Industrial Microbiology, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1968.

Глава 13

 

Изучение взаимодействий в смешанных популяциях микроорганизмов

Во всех предыдущих главах основное внимание мы уделили системам, в которых доминирует один тип микроорганизмов, и практически не касались… Здесь же мы сконцентрируем внимание на анализе различных взаимодействий…  

Нейтрализм, мутуализм, комменсализм и аменсализм

В случае смешанных культур, состоящих из двух штаммов микроорганизмов, нейтрализм и мутуализм представляют собой предельные варианты взаимодействий.… Известно лишь несколько примеров нейтрализма. Одним из них является рост… Говоря другими словами, нейтрализм — это такое состояние системы, когда поведение организмов как первого, так и…

Таблица 13.1. Примеры симбиотических взаимодействий с участием по меньшей мере одного вида микроорганизма

Другим вариантом мутуализма является поддержание оптимального значения рН в культуре организмов двух видов, один из которых повышает рН среды, а другой обеспечивает обратный эффект.

Два последних из рассматриваемых в этом разделе типов взаимодействий оказывают заметное влияние только на один вид микроорганизмов. При комменсализме определенные преимущества в смешанной культуре получает второй вид. Противоположный эффект наблюдается при аменсализме, когда в результате взаимодействия с первым видом второй вид оказывается в менее выгодной ситуации.

Иногда механизм комменсализма аналогичен последнему механизму только что рассмотренного мутуализма. В этом случае первый вид связывает вещество, являющееся токсичным для второго вида, но в отличие от мутуализма второй вид не создает никаких благоприятных условий для первого. Как показывают данные, приведенные в табл. 13.2, такой тип комменсализма довольно обычен.

Еще более широко распространен другой вариант комменсализма, когда один вид продуцирует соединения, ускоряющие рост организмов другого вида. Конечные продукты жизнедеятельности одного вида, обеспечивающие эффект комменсализма, довольно многочисленны (см. табл. 13.3). В зависимости от конкретной системы продуцируемое соединение может служить источником энергии и (или) углерода для другого вида. Подобные комменсальные взаимодействия часто объединяются в цепи, отдельные звенья которых образуют комменсальные пары. В периодической культуре, например, дрожжи могут превращать глюкозу в спирт, являющийся питательным веществом для Acetobacter. Этот организм продуцирует затем уксусную кислоту, которая поглощается другими микроорганизмами и т. д.

 

Таблица 13.2. Комменсализм; нейтрализация токсичных веществ^а

В табл. 13.3 приведены также несколько примеров передачи витамина или какого-либо другого фактора роста от одного вида к другому. Это происходит особенно легко, если одним из видов является ауксотрофный мутант. В таком случае комменсализм будет обеспечен, если второй вид продуцирует метаболит, являющийся незаменимым веществом для роста первого вида.

Большинство примеров комменсализма обнаружено при изучении периодических культур. Действительно, строго комменсальные взаимодействия в непрерывной культуре или в другой открытой системе затруднены; в этом случае проблема связана с возможностью появления конкурентных взаимодействий. Хотя один организм может помогать другому, оба этих организма могут конкурировать за одно питательное вещество, которое в конце концов становится лимитирующим рост питательным веществом. Следовательно, в открытых системах комменсализм можно ожидать только в тех случаях, когда взаимодействующие виды существенно различаются по своим потребностям в питательных веществах.

Аменсализм противоположен комменсализму; при аменсализме рост одного вида подавляется в присутствии другого вида. Ингибирующий эффект в таких случаях обычно обусловлен или синтезом токсичных веществ, или поглощением незаменимых питательных веществ.

 

Таблица 13.3. Комменсализм; обеспечение незаменимыми питательными веществами^а

В большей части известных примеров аменсализм обусловлен первым механизмом; в таких случаях второй организм создает окружение, в котором первый вид с трудом поддерживает жизнеспособность или вообще погибает.

Мы уже видели, что некоторые антибиотики продуцируются микроорганизмами. Один из обычных лабораторных тестов на биосинтез антибиотиков, по сути дела, представляет собой тест на аменсализм; в этом тесте синтезирующий антибиотик и чувствительный к антибиотику виды выращивают совместно на агаровой пластинке. Наличие чистых зон вокруг продуцирующих антибиотик колоний является свидетельством в пользу антибиотической активности (рис. 13.2). (В частности, именно таким методом был открыт пенициллин.) Чистые зоны образуются в результате диффузии антибиотика из синтезирующей его колонии, что приводит к ингибированию роста чувствительного штамма.

РИС. 13.2. Аменсализм: диффузия антибиотика из колоний грибов, продуцирующих антибиотик, ингибирует рост организмов другого вида на агаровой среде. (Фотография любезно предоставлена компанией Charles Pfizer and Co., Inc.)

 

О синтезе антибиотиков плесневыми грибами и актиномицетами упоминалось выше. Чтобы оценить возможную роль антибиотиков в экологии микроорганизмов, следует учесть, что водоросли и другие бактерии также могут продуцировать антибиотики. Большая часть таких антибиотиков по химической природе относится к полипептидам. Подобно пенициллину многие из них ингибируют синтез компонентов клеточной стенки, а другие разрушают барьер проницаемости, обеспечиваемый клеточной мембраной.

Близкий тип аменсализма обусловлен секрецией некоторыми микроорганизмами ферментов, разрушающих полимеры клеточной стенки. Деполимеризуя с помощью литических ферментов клеточные стенки организмов других видов, подобные организмы получают два преимущества. Во-первых, таким путем один вид уничтожает другой потенциально конкурентноспособный вид и, во-вторых, разрушенные клетки являются источником питательных веществ, которые могут утилизироваться микроорганизмами, продуцирующими ферменты. Действительно, если образующиеся таким путем питательные вещества вносят существенный вклад в питание продуцирующих ферменты видов, то последние, очевидно, выигрывают в таком окружении. Тогда аменсалитические взаимодействия трансформируются в паразитические (см. разд. 13.4).

Синтез микроорганизмами органических кислот также может быть причиной ингибироваыия, но не сголь эффективного, как в предыдущем случае. Кислоты часто снижают рН и замедляют рост других организмов. Возможны и более специфические ингибирующие эффекты органических кислот. Так, муравьиная и уксусная кислоты ингибируют рост Shigella flexneri, а пропионат и ацетат способны ингибировать рост бактерии Рrоріопіbacterium shermanii. К другому типу аменсализма относится ингибирование хемоаутотрофов небольшими количествами аммиака, продуцируемого другими видами, особенно использующими в качестве источника энергии аминокислоты.

 

Классификация взаимодействий между двумя видами

 

Рассматриваемая здесь классификация взаимодействий между двумя различными видами базируется на изучении динамических свойств смешанной культуры. Такие динамические свойства можно описать с помощью линеаризованной модели типа рассмотренной в разд. 9.2.1. Пусть n — вектор с элементами n_і, каждый из которых равен числу (или численной концентрации, т. е. числу клеток в единице объема) организмов вида і в системе, тогда уравнения балансов по численностям видов для системы с полным перемешиванием можно записать в виде

(13.1)

где m — вектор параметров, характеризующих окружение организмов. В контексте экологии смешанных культур матрица коэффициентов A соответствующей линеаризованной модели с элементами

(13.2)

называется матрицей сообщества. Как уже упоминалось в гл. 9, n_s в уравнении (13.2) обозначает постоянный во времени вектор n, соответствующий уравнению (13.1) в применении к стационарному состоянию.

Переменные, используемые для описания концентраций (плотностей) отдельных видов в системах на основе смешанных культур (и в ряде других), заслуживают особого внимания. Изучение роста чистых культур в переходном состоянии (например, периодической культуры) показывает, что средняя масса одной клеткн изменяется во времени (вспомните разд. 7.3.1); отсюда следует, что массовая и численная концентрации клеток изменяются во времени неодинаково. Говоря другими словами, отношение x_i/n_i не постоянно во времени (здесь x_i и n_i — массовая и численная концентрации вида і соответственно). Изучение моделей кинетики показывает, что описание кинетики роста суш,ественно упрош,ается и может быть сведено к сравнительно простым функциональным зависимостям, рассмотренным в гл. 7, если оно базируется на массовой, а не на численной концентрации организмов. Например, основанная на известных особенностях клеточного цикла Е. coli кинетика синтеза биомассы первого порядка подразумевает процесс повышения численной концентрации первого порядка с лаг-фазой, что обусловливает значительно более сложное динамическое поведение и существенно усложняет анализ переходных состояний (вспомните разд. 9.2.2). Следовательно, в общем случае предпочтительно опираться на общую концентрацию клеточной массы.

К сожалению, экспериментальные методы определения плотностей различных видов в смешанных культурах обычно сводятся к подсчету колоний, растущих на пластинках. Полученные таким путем данные учитывают число клеток, но не их массовую концентрацию. Одновременное измерение среднего размера клеток с помощью микроскопа или другим методом (по рассеянию света или с помощью счетчика Коултера) в принципе позволяет перевести полученные результаты в величины массовой концентрации, но для смешанных культур такие данные чрезвычайно скудны. Поскольку критерием справедливости любой теории служит сравнение с экспериментальными результатами, то рассматриваемые в этой главе данные будут выражены в основном в величинах численной концентрации клеток. Следует подчеркнуть, что некоторые затруднения, возникающие при описании с помощью кинетических моделей динамики численности клеток, могут быть обусловлены неудачными попытками использовать переменные, выраженные в единицах массы клеток, и одновременно учесть переходные состояния в размерах клеток.

Взаимодействия между двумя видами вблизи стационарного состояния характеризуются двумя элементами в матрице сообщества A. Если мы рассмотрим виды і и j, то нетрудно заметить, что небольшие увеличения популяции j по сравнению с соответствующим значением для стационарного состояния [χ_j(0)>0] приводят к увеличению начальной производной χ_і на выражение a_ijχ_j(0). (Во избежание путаницы с концентрациями клеточной массы отклонение [n_і(t)—n_is] мы будем обозначать χ_і(t).) Таким образом, если численность популяций всех других видов первоначально соответствует стационарному состоянию [т. е. χ_k(0)=0, k≠j] то знак dχ_k(0)/dt будет зависеть от знака a_ij. Можно сказать, что если величина a_ij положительна, то организмы вида j оказывают положительное влияние на рост организмов вида і, а если a_ij отрицательно, то налицо ингибирующий эффект. Отсутствию взаимодействия между видами отвечает a_ij = 0.

 

Таблица 13.4. Классификация парных взаимодействий, основанная на знаке элементов a_ji и a_ij матрицы сообщества A (i≠j)^a

Те же самые доводы приложимы и к изучению влияния вида і на вид j: соответствующий эффект носит стимулирующий характер при положительном a_ji, ингибирующий— при отрицательном a_ji, нейтральный — при нулевом a_ji.

Определяемые таким путем все возможные сочетания взаимодействий между видами представлены в табл. 13.4. Нетрудно видеть, что все четыре типа парных взаимодействий, рассмотренных в предыдущем разделе, учитываются этой схемой. Кроме того, в таблице появились два новых типа взаимодействий — конкуренция и хищничество. Прежде чем в деталях рассматривать эти типы взаимодействий, мы изучим некоторые стороны ·влияния типа взаимодействия на динамику смешанной популяции вблизи стационарного состояния. Пока что ограничимся изучением смешанных культур, состоящих из двух взаимодействующих видов.

 

Пример 13.1. Динамика системы, состоящей из двух видов, вблизи стационарного состояния. Если взаимодействуют только два вида, то, как следует из соответствующего варианта уравнения (9.30), в этом случае матрица сообщества имеет форму 2x2:

(13П1.1)

или

(13П1.2)

Характерное уравнение (9.34) можно легко преобразовать в уравнение второй степени

(13П1.3)

где trA и detA обозначают след и детерминант матрицы A соответственно. Применив к уравнению (13П1.3) критерий Гурвица—[уравнение (9.41)], нетрудно найти, что линеаризованная система асимптотически устойчива в том и только в том случае, если

(13П1.4)

(13П1.5)

Другие детали динамики системы можно найти, решив уравнение (13П1.3):

(13П1.6)

При trA = 0 (и detA>0) или при detA, равном нулю, по меньшей мере, одно собственное значение будет иметь нулевую действительную часть. Исключим этот критический вариант из нашего дальнейшего анализа и перейдем к анализу других возможностей. (Типичные для критических ситуаций бифуркации рассматриваются в разд. 13.5.5.)

(13П1.7)

Если то оба собственных значения действительны и имеют один и тот же знак; соответствующее стационарное состояние n_s называется узловой точкой. Если detA<0, то одно собственное значение положительно, а другое отрицательно; такое стационарное состояние называют седловой точкой. Комплексные собственные значения наблюдаются в том случае, если 4 det А больше, чем квадрат trA. В этом случае стационарное состояние называют фокальной точкой.

Причину появления таких специфических терминов, заимствованных из математического аппарата механики, легче понять, если обратиться к анализу траекторий численности популяций в фазовой плоскости. По определению координатами фазовой плоскости являются χ₁ и χ₂. Определенные начальные условия (χ₁(0), χ₂(0)) можно представить точкой на этой плоскости. Аналогично если мы нанесем на фазовую плоскость все точкн, относящиеся ко временам t (χ₁(t), χ₂(t). то получим непрерывную кривую, называемую траекторией. Следовательно, изображение траекторий в фазовой плоскости является удобным способом представления динамического поведения двух переменных на одном графике.

На рис. 13П1.1 представлены траектории для трех обычных ситуаций. Каждая из траекторий соответствует определенным начальным условиям, а стрелки указывают направление увеличения времени. Для того чтобы отразить поведение неустойчивых узловых и фокальных точек в фазовой плоскости, нужно изменить направление стрелок на траекториях, изображенных на рис. 13П1.1,а и б, на обратное. (Почему?)

Возвращаясь к классификации, представленной в табл. 13.4, нетрудно видеть, что она включает только недиагональные элементы матрицы А. Следовательно. без дополнительных данных мы ничего не можем сказать о trA и очень мало о det А.

 

РИС. 13П1.1. Некоторые характерные типы траекторий в фазовой плоскости, отображающие линеаризованную динамику экосистем, состоящих из двух видов: а — устойчивая узловая точка; б — устойчивая фокальная точка; в — седловая точка.

Теперь рассмотрим достаточно обоснованные допущения относительно автономных удельных скоростей роста a₁₁ и a₂₂ в случае некоторых из уже указанных типов взаимодействий. Мутуализм может привести к большей численности популяции в стационарном состоянии (по сравнению со стационарными состояниями без взаимного благоприятного влияния видов друг на друга),

так что a₁₁<0, a₂₂<0. Очевидно, что выполняется также условие (13П1.5), но условие (13П1.4) будет выполнено только в том случае, если

(13П1.8)

Если это неравенство не удовлетворяется, то такое мутуалистическое стационарное состояние неустойчиво.

В системе, состоящей из двух видов, как в случае комменсализма, так и в случае аменсализма характеристики устойчивости полностью зависят от автономных скоростей роста, поскольку detA= a₁₁ a₂₂ и trA= a₁₁+a₂₂. Отсюда следует, что асимптотическая устойчивость возможна только в том случае, если и a₁₁, и a₂₂ отрицательны.

Как мы увидим в разд. 13.5, некоторые из полученных в этом примере выводов можно распространить и на более сложные популяции.

 

13.3. Конкуренция: выживание наиболее приспособленного вида

 

В работах Дарвина о естественном отборе подчеркивалась важность конкуренции между различными видами. В том смысле, в каком бы будем употреблять его здесь, термин конкуренция означает зависимость двух видов от одного фактора, например от источника питательного вещества, света, наличия пространства или от какого-либо другого лимитирующего рост вида фактора. Утилизация этого общего ресурса одним видом уменьшает его доступность для другого вида, что оказывает отрицательное влияние на скорости роста обоих организмов.

При анализе конкуренции нас, прежде всего, должно интересовать, не имеет ли один из видов какого-либо естественного преимущества перед другим видом. Чисто умозрительно можно предположить, что вид с более высокой скоростью роста должен быть лучше приспособленным, поскольку именно благодаря быстрому росту он способен утилизировать больше общего лимитирующего рост ресурса, чем медленнее растущий организм. Как мы увидим ниже, экспериментальные данные и результаты математического анализа с помощью соответствующих моделей подтверждают это предположение.

Рассмотрим пример, представленный на рис. 13.3. Растущие в чистых культурах (незачерненные символы) E. coli и Staphylococcus aureus достигают примерно одинаковой максимальной численности популяции, хотя E. coli растут быстрее. Если же эти два вида бактерий культивировать в смешанной периодической культуре, то картина роста E. coli практически не будет отличаться от роста этого организма в чистой культуре. Напротив, максимальная численность популяции S. aureus в смешанной культуре намного ниже, чем в чистой культуре. Поскольку E. coli не продуцируют веществ, ингибирующих рост Staphylococcus aureus, то этот эффект можно объяснить преимущественным поглощением питательных веществ бактериями E. coli. (При каком допущении справедлив этот вывод?)

 

Анализ межвидовой конкуренции по Вольтерра

Известный итальянский математик Вито Вольтерра, выяснивший многие принципы математической экологии, изучал рост двух конкурирующих организмов в… РИС 13.3. Снижение скорости роста S. aureus в смешанной культуре вследствие конкуренции этого организма с Е. соИ. [Из…

Конкуренция и отбор в хемостате

Теперь рассмотрим роль конкуренции в открытых системах, например, в хемостате. Если допустить, что удельная скорость роста μi вида і постоянна,… (13.8) Отсюда следует, что относительные значения μi и D определяют, будет ли χі возрастать, уменьшаться или…

Хищничество и паразитизм

В случае хищничества и паразитизма один вид получает определенные преимущества за счет другого вида. Различия между этими двумя типами межвидовых… Хотя механизмы межвидовых взаимодействий при паразитизме и хищничестве… Часто при взаимодействии типа хищник — жертва численности популяций хищника и жертвы не достигают постоянных значений,…

Описание колебаний численности видов в системе хищник — жертва с помощью модели Лотки — Вольтерры

Математическую модель взаимодействия типа хищник — жертва, приводящего к таким циклическим изменениям, разработали Лотка и Вольтерра в конце 1920-х… (13.9) Произведение n1n2 можно рассматривать как частоту встреч между хищниками и жертвами, а стоящий перед этим…

Применение модели Лотки — Вольтерры к системам, состоящим из многих видовvb

Экологов интересует изучение взаимосвязей между степенью сложности системы и ее динамическим поведением. В частности, очень большой интерес… Для системы с N видами жертв и N видами хищников по аналогии с уравнениями…

Другие модели системы один вид хищников — один вид жертв

Работа Лотки и Вольтерры послужила стимулом для целого ряда исследований, в результате которых были предложены усовершенствованные варианты модели.… РИС. 13.12. Зависимость обратной скорости роста популяции хищника (простейшее Colpoda steinii) от обратной плотности…

Влияние количества видов и сети их взаимодействий

 

В этом разделе мы перейдем от конкретных систем к сравнительно абстрактному изучению поведения систем, состоящих из популяций более двух видов. Прежде чем приступить к этой, иногда довольно сложной, проблеме, необходимо познакомиться со специфической терминологией, применяемой в экологии и смежных областях.

 

Трофические уровни, пищевые цепи и пищевые сети; определения и пример

 

В естественных системах часто существует та или иная иерархия взаимосвязей между потребителями пищи. Рассматривавшиеся в предыдущем разделе бактерии, например, были потребителями глюкозы и одновременно сами являлись пищей для простейших; последние в свою очередь поглощались более сложными организмами. Подобные взаимосвязи называют пищевыми цепями, а отдельные последовательные звенья цепи — трофическими уровнями. Обычно пищевые цепи не изолированы одна от другой, а связываются и переплетаются, образуя пищевые сети. На рис. 13.15 представлен пример простой пищевой сети, изучавшейся в лабораторных условиях; в этом примере две пищевые цепи (субстрат→жертва 1→хищник и субстрат→жертва 2→хищник) совпадают на первом и третьем трофическом уровнях.

Прежде чем перейти к обсуждению результатов экспериментального изучения пищевой сети, изображенной на рис. 13.15, мы должны вспомнить обсуждавшиеся выше результаты анализа отдельных компонентов этой системы. Так, если рассматривать только первый и второй трофические уровни, нетрудно заметить, что они образуют систему, к которой применим принцип конкурентного исключения. Действительно, данные, приведенные на рис. 13.7, показывают, что в этой системе может действовать принцип конкурентного исключения, если иметь в виду только два первых трофических уровня. Экспериментально изучалась также система глюкоза→жертва 2→хищник (рис. 13.15); показано, что для нее в некоторых условиях характерны устойчивые колебания (см. рис. 13П3.2). Интересно проследить за динамическим поведением сложной системы, в которой указанная цепь переплетается с другой, образуя изображенную на рис. 13.15 пищевую сеть.

РИС. 13.15, Схема простой пищевой сети, состоящей из трех трофических уровней. На втором уровне находятся два вида бактерий, потребляющих питательное вещество (первый уровень); на высшем (третьем) уровне оба вида бактерий служат пищей для хищника (простейшего). [Из работы: lost J. L. et al., J. Bacteriol., 113, 834, (1973).]

 

На рис. 13.16 представлены результаты экспериментального изучения этой пищевой сети в хемостате при D=0,1 ч^-1. Наиболее интересен факт сосуществования двух конкурирующих видов бактерий при условии, что они имеют общего хищника. Таким образом, введение в систему популяции хищника оказывает стабилизирующее влияние на популяции конкурирующих видов жертв, а вымывание популяции одного из видов жертв предотвращается.

Хотя численность популяций всех трех видов подвержена колебаниям, они гораздо менее интенсивны и более сглажены по сравнению с колебаниями в изолированной пищевой цепи хищник — жертва. К сожалению, полученные экспериментальные данные охватывают только небольшой временной интервал (8 сут), поэтому нельзя исключить возможность последующего затухания колебаний. Эксперимент был прекращен в силу быстрого и интенсивного роста культур на стенках хемостата.

 

РИС. 13.16. Экспериментально обнаруженные колебания численности популяций видов, участвующих в пищевой сети, изображенной на рис. 13.15. [Из работы: iost J. L. et al., J. Bacteriol., 113, 834, (1973).]

 

Изучение динамики популяций с помощью моделей в форме закона действующих масс

В оставшейся части раздела 13.5 мы рассмотрим некоторые теоретические методы анализа и изучения сложных взаимодействующих популяций. Следует… Изложенный в этом разделе методический подход имеет в основном химическую… Предположим, что в изотермической гомогенной системе постоянного объема, к которой добавляют компонент B в таком…

Качественная устойчивость

В предыдущем разделе мы рассмотрели некоторые из самых эффективных теоретических методов анализа нелинейныхмоделей процессов. В конце изучения… Если независимо от величин ненулевых элементов все собственные значения A…  

РИС. 13П5.1. Трн простых пищевых сети, каждая из которых имеет три трофических уровня.

 

Устойчивость сложных неупорядоченных пищевых сетей

В этом разделе будут рассмотрены некоторые интереснейшие работы Гарднера и Эшби*, Мэя [5] и Макмертри**, посвященные изучению взаимосвязей между… * Gardner М. R., Ashby W. R., Connectance of Large Dynamical (Cvbernetic)… ** Работа, подготовленная к печати и цитируемая в монографин [5].

Бифуркации и усложненная динамика

Один из способов изучения стационарных состояний и динамики сложных систем с множеством взаимодействующих видов связан с анализом изменений,… Математический анализ этих качественных изменений в динамике систем,… В примере 13.1 мы рассматривали метод анализа локальной устойчивости для системы, состоящей из двух видов. Напомним…

Расположение популяций в пространстве

До сих пор мы принимали, что все популяции распределены в изучаемом объеме (пространстве) системы равномерно или такое распределение обеспечивается… Еще больший интерес представляют довольно многочисленные системы, в которых… Показательный пример такого эффекта представлен на рис. 13.18, на котором зафиксирован процесс спорообразования в…

Литература

 

Некоторые сведения о смешанных популяциях даны в руководствах по общей микробиологии, перечисленных в гл. 1. В работе [4] имеются три раздела, посвященных симбиозу. См. также:

 

1. Одум Ю., Основы экологии. — М.; Мир, 1975. Подробный учебник, написанный популярным языком; в нем анализируются все проблемы экологии.

2. Cause G. F., The Struggle for Existence, Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1934. Эта работа послужила исходной точкой для большинства последующих экспериментальных и теоретических исследований смешанных культур микроорганизмов. Основы многих из излолсенных в настоящей главе концепций, определений и представлений были заложены в этой классической монографии.

3. Microbial Ecology, Laskin А. I., Lechevalier Н. (eds.), CRC Press, Cleveland, 1974. Здесь в первых двух главах рассматривается влияние пестицидов на популяции микроорганизмов, а третья глава посвящена экологии почвенных микроорганизмов. Особенно рекомендуем ознакомиться с великолепной заключительной главой (Aleers J. L., Growth of Bacteria in Mixed Cultures).

4. Hattori Т., Microbial Life in the Soil: An Introduction, Marcel Dekker, Inc., New York, 1973. Хороший обзор почвенных экосистем, отличающихся очень большой сложностью; приведено множество интересных примеров межвидовых отношений в мире микроорганизмов.

5. May R. М., Stability and Complexity in Model Ecosystems, Princeton University Press, Princeton, N. J., 1973. Хорошая монография, посвященная математическому анализу взаимодействий между популяциями; эта книга послужила основой для большей части материала, изложенного в разд. 13.4 и 13.5. Здесь убедительно обсужден принцип нестабильности систем, обусловленной их сложностью.

6, Bungay Н. R., Bungay М. L., Microbial Interactions in Continuous Culture, Adv. Appl. Microbiol., 10, 269 (1968). Несмотря на то что эта работа несколько устарела, она по-прежнему является полезным дополнительным материалом и источником различных идей.

7. Rescigno А., Richardson I. W., The Deterministic Theory of Population Dynamics, in Foundations of Mathematical Biology, R. Rosen (ed.), vol. 3, Super-cellular Systems, p. 283, Academic Press, Inc., New York, 1973. В этой работе дан хороший обзор работ Вольтерры по межвидовой конкуренции и взаимодействиям типа хищник — жертва, а также некоторых более поздних работ по популяционной динамике, особенно работ Костицина.

8. Lotka А. Undamped Oscillations Derived from the Law of Mass Action, J. Am. Chem. Soc., 42. 1595 (1920). В этой работе заложены основы известной модели Лотки — Вольтерры для взаимосвязей типа хищник — жертва.

9. Feinberg М., Horn F. J. М., Dynamics of Open Chemical Systems and the Algebraic Structure of the Underlying Reaction Network, Chem. Eng. Sci., 29, 775 (1974). Обзорная статья по теории закона действующих масс, разработанной авторами и Р. Джексоном и рассмотренной в разд. 13.5.2. (Более поздний обзор опубликован М. Фейнбергом; см. работу [10], с. 1.)

10. Bailey J. е.. Periodic Phenomena, in The R. H. Wilhelm Memorial Volume on Chemical Reactor Theory, Lapidus L., Amundson N. R. (eds.), p. 758, Prentice-Hall, Inc., Englewood Cliffs, N. J., 1977. В этой работе дано введение в математическую теорию спонтанных и вынужденных колебаний в контексте химических реакций.

11. Gurtin М. е., Some Mathematical Models for Population Dynamics That Lead to Segregation, Q. Appl. Math., 32, 1 (1974). Здесь детально рассмотрен пример, приведенный в разд. 13.6, а также родственные проблемы.

 

Рост неустойчивых популяций рекомбинантных организмов и родствеииые системы:

12. Imanaka Т., АіЬа S., А Perspective on the Application of Genetic Engineering: Stability of Recombinant Plasmids, Ann. N.Y. Acad. Sci., 369, 1 (1961).

13. OUis D. F., Chang H.-T., Batch Fermentation Kinetics with (Unstable) Recombinant Cultures, Biotech. Bioeng., 24, 2583 (1982).

14. OUis D. F., Industrial Fermentations with (Unstable) Recombinant Cultures, Phil. Trans. Roy. Soc. London, B297, 617 (1982).

15. Hjortso M. A., Bailey J. E., Plasmid Stability in Budding Yeast Populations: Steady-State Growth with Selection Pressure, Biotech. Bioeng., 26, 528 (1984).

16. Seo J.-H., Bailey J. E., A Segregated Model for Plasmid Content and Product Synthesis in Unstable Binary Fission Recombinant Organisms, Biotech. Bioeng., 27, 156 (1985).

17. Kimura M., Ohta Т., Theoretical Aspects of Population Genetics, Princeton University Press, Princeton, N. J., I97I.

18. Stewart F. M., Levin B. R., The Population Biology of Bacterial Plasmids: A priori Conditions for the Existence of Conjugationally Transmitted Factors, Genetics, 87, 209 (1977).

 

Работы, посвященные изучению взаимодействий типа хищник — жертва:

19. Tsuchiya Н. М. et at., Predator-Prey Interactions of Dictyostelium discoideum and Escherichia coli in Continuous Culture, J. Bacteriol., 110, 1147 (1972).

20. Jost J. L. et at., Interactions of Tetrahymena pyriformis, Escherichia coli, and Azotobacter vinelandii and Glucose in a Minimal Medium, J. Bacteriol., 113, 834 (1973).

21. Jost J. L. et al.. Microbial Food Chains and Food Webs, J. Theoret. Biol.. 41, 461 (1973).

 

Другие сведения о расположении популяций в пространстве:

22. Turing А. М., The Chemical Basis of Morphogenesis, Trans. Roy. Soc. London. B237, 337 (1952).

23. Гленсдорф П., Пригожий И., Термодинамическая теория структуры, устойчивости и флуктуации. — М.: Мир, 1973.

24. Othmer Н. G., Scriven L. В., Instability and Dynamic Pattern in Cellular Networks, J. Theoret. Biol., 32, 507 (1971).

25 Peld R. /., А Reaction Periodic in Time and Space, J. Chem. Educ., 49, 308 (1972).

26. Winfree A. Т., Rotating Chemical Reactions, Sci. Am., Jjne, 1974, p. 82.

 

Явление бифуркации:

См. работу [10], а также;

27. Smith С. В., Kuszta В., Lyberatos G., Bailey J. Е., Period Doubling and Complex Dynamics in an Isothermal Reaction System, Chem. Eng. Sci., 38, 425 (1983).

28. Lyberatos G., Kuszta В., Bailey J. E., Versal Matrix Families, Normal Forms, and Higher Order Bifurcations in Dynamic Chemical Systems, Chem. Eng. Sci., 40, 1177 (1985).

 

Расположение популяций в пространстве:

29. Lauffenberger D. A., Effects of Cell Motility Properties on Cell Populations in Ecosystems. ACS Symp. Ser., 207, 265 (1983).

30. Pismen L. M., Kinetic Instabilities ii; Man-Made and Natural Reactors, Chem. Eng. Sci., 35, 1950 (1980).

 

Упражнения:

31. Tailing J. F., The Growth of Two Plankton Diatoms in Mixed Culture, Physiol. Plant., 10, 215 (1957).

32. Meyer J. M., Tsuchiya H. M., Frederickson A. G., Dynamics of Mixed Populations Having Complementary Metabolism, Biotech. Bioeng., 17, 1065 (1975).

33. Leslie P. H., Some Further Notes on the Use of Matrices in Population Mathematics, Biometrika, 35, 213 (1948).

34. Смит Дж. М., Модели в экологии. — М.: Мир, 1976.

35. Rapport D. J., Turner J., Predator-Prey Interactions in Natural Communities, J. Theoret. Biol., 51, 169 (1975).

36. Bonner J. Т., The Cellular Slime Molds, Princeton University Press, Princeton, N. J., 1967.

37. Keller E. F., Segel L. A., Initiation of Slime Mold Aggregation Viewed as an Instability, J. Theoret. Biol., 26, 399 (1970).

38. Lin C. C., Segel L. A., Mathematics Applied to Deterministic Problems in the Natural Sciences, pp. 22—31, The Macmillan Company, New York, 1974

Глава 14

 

Смешанные популяции микроорганизмов в естественных системах и промышленных процессах

Смешанные популяции микроорганизмов играли важную роль уже в период возникновения жизни на земле. Позднее различные виды микроорганизмов выполняли… Смешанные популяции микроорганизмов широко распространены в природе — они… В результате деятельности микроорганизмов в рубце происходит разложение растительных материалов, в том числе целлюлозы…

Применение смешанных культур определенного состава

Самым наглядным примером использования смешанных культур определенного видового состава является сыроделие. Гастрономическая сторона этих процессов… Ранее в сыроделии применяли местные дикие смешанные культуры; теперь же для… Начальные стадии производства многих других сортов натуральных сыров аналогичны описанным выше; консистенция и вкус…

Естественные смешанные популяции микроорганизмов и их роль в производстве и порче продуктов

Теперь перейдем к изучению процессов, в которых посевной материал поступает из естественных источников. При этом условии природа доминирующих видов… По этой же причине смешанные популяции микроорганизмов особенно эффективно… Порча продуктов или материалов обычно заключается в разложении органических веществ, в том числе полимеров, например…

РИС. 14.1. Последовательное проявление активности различными видами микроорганизмов в сыром молоке при комнатной температуре.

 

Известны и другие процессы пищевой промышленности, в которых используется естественная ферментация, инициируемая бактериями — продуцентами молочной кислоты. Так, маринованные огурцы приготовляют путем молочнокислого брожения с участием смешанных популяций микроорганизмов. В производстве сосисок и других подобных мясных продуктов Lactobacillus sp. и другие микроорганизмы не только продуцируют молочную кислоту, но и восстанавливают нитраты до нитритов; последний процесс обусловливает появление специфической окраски и придание острого вкуса. Опару для дрожжевого хлеба ферментируют в течение 1—2 сут; за это время образуются этанол и органические кислоты. Другим пищевым продуктом, получаемым брожением при участии смешанных культур, является квашеная капуста.

Хотя процессы виноделия, пивоварения и производства уксуса мы уже рассматривали ранее, в некоторых аспектах они затрагивают и тему настоящей главы. Во многих случаях микробиологическая активность, обусловливающая необходимые качества продукта, обеспечивается естественными смешанными культурами. В настоящее время, однако, наметилась тенденция К проектированию и эксплуатации более воспроизводимых процессов с участием микробиологических систем определенного состава. В связи с этим обычным становится использование посевного материала, состоящего из тщательно отобранных и сохраняемых видов.

 

Участие микроорганизмов в естественных кругооборотах веществ

Большая часть рассмотренных нами выше примеров применения микроорганизмов так или иначе была связана с процессами, осуществляемыми и контролируемыми… Адекватное функционирование глобальной экосистемы планеты невозможно без… Понятно, что для предотвращения накопления чрезмерных количеств любых органических отходов необходимо, чтобы реакции…

Кругооборот необходимых для жизни химических элементов

Кругооборот биологически важных химических элементов часто сопровождается циклическими изменениями степени их окисления. Это обстоятельство… Основные характеристики кругооборотов углерода и кислорода представлены на… Из описанного кругооборота углерод отбирается несколькими путями. Большая часть выделившегося в атмосферу СО2…

РИС. 14.2. Упрощенная схема кругооборота углерода. Здесь штриховыми линиями показан также один из основных участков кругооборота кислорода, тесно связанный с кругооборотом углерода.

Так, важной составной частью плодородной почвы является гумус — органический остаток, образующийся из устойчивых к действию микроорганизмов компонентов растений. Когда условия благоприятствуют накоплению большого количества гумуса, с течением времени образуются залежи торфа, которые в ходе целых геологических эпох могут постепенно превращаться в каменный уголь. Другими обычными формами связанного органического углерода являются нефть и природный газ. Содержащийся в угле, нефти и газе углерод в конечном счете возвращается в биосферу благодаря постоянно возрастающей потребности человека в топливе.

Теперь перейдем к изучению кругооборота азота в биосфере и, в частности, к изменению его химического состояния в ходе соответствующих превращений. При этом полезно не забывать несколько основных положений. Во-первых, находящийся в атмосфере молекулярный азот практически совершенно инертен, т. е. для подавляющего большинства организмов в таком виде он не может служить питательным веществом. Во-вторых, в живых организмах азот в основном содержится в белках в восстановленной форме.

Общая схема кругооборота азота приведена на рис. 14.3. Органический азот превращается в аммиак при действии микроорганизмов. Небольшая часть аммиака поступает в атмосферу и далее непосредственно утилизируется растениями и микроорганизмами; большая же часть аммиака окисляется до нитрата (NO₃^-). Соответствующий процесс, осуществляющийся в две стадии, называют нитрификацией. Каждая из стадий процесса нитрификации катализируется своей группой бактерий, в первую очередь Nitrosomonas и Niirobacter. И первые, и вторые являются хемоаутотрофами и облигатными аэробами.

Образующиеся таким путем нитраты являются одним из наилучших источников азота для растений, поэтому именно через нитраты большая часть азота возвращается в пул восстановленного органического азота. Водоросли и растения включают азот в органические соединения, и в этой форме азот может далее усваиваться и животными. В то же время микроорганизмы могут утилизировать нитрат и по другому пути. При недостатке кислорода, например в микроокружении бактерий, где в результате дыхания последних запасы кислорода истощились, многие бактерии способны перестроить свой метаболизм и использовать нитрат как акцептор водорода.

 

РИС. 14.3. Упрощенная схема кругооборота азота.

Результатом такой активности является денитрификация, т. е. образование молекулярного азота.

К счастью, некоторые микроорганизмы способны утилизировать молекулярный азот и таким образом возвращать его в биосферу в связанном виде. Известны два основных пути фиксации азота микроорганизмами. В первом из них азот связывается бактериями Rhizobium в симбиозе с бобовыми растениями. В другом пути азот связывается в несимбиотическом процессе сине-зелеными водорослями, а также некоторыми аэробнымн (Azotobacter) и анаэробными (Clostridium pasteurianum) бактериями.

В связи с описанными путями фиксации азота перед генетической инженерией микроорганизмов и (или) растений возникают две важные и интересные задачи:

а) введение генов Nif, ответственных за фиксацию азота, в геномы бактерий, населяющих корневые системы других (не бобовых) растений;

б) создание растений, содержащих гены Nif непосредственна в геноме растения.

Решение любой из этих задач привело бы к созданию сортов растений, не нуждающихся в азотных удобрениях (во всяком случае, в таком количестве, в каком их применяют в настоящее время).

 

РИС. 14.4. Основные стадии кругооборота серы.

В своем кругообороте сера также претерпевает стадии окисления, восстановления, включения в органические вещества и высвобождения из них (рис. 14.4), Сульфатредуцирующие и окисляющие серу бактерии играют важную роль в процессах микробиологической коррозии. Дополнительные сведения о кругообороте серы и участвующих в нем организмах читатель может найти в приведенной в конце главы литературе. В следующем разделе мы рассмотрим различные пути реализации полного или частичного кругооборота элементов в специфическом окружении.

 

Взаимосвязи микроорганизмов в почве и некоторых других естественных экосистемах

Почва представляет собой сложную систему переменного состава, являющуюся отличной сферой обитания для микроорганизмов. Она состоит из… Синтрофизмом называют тип межвидовых взаимосвязей, при котором один организм… Синтрофизм можно объяснить и с другой точки зрения, проследив за последовательностью событий, которые наступают вслед…

РИС. 14.5. Некоторые возможные синтрофическне связи между микроорганизмами, растениями и животными в почве. Конечные продукты метаболизма микроорганизмов A являются питательными веществами для организмов М, Н, G и Е, а секретируемые микроорганизмами А целлюлолнтические ферменты гидролизуют целлюлозу. Образующиеся простые сахара являются питательными веществами для микроорганизмов В, С и D.

 

Так, мы не указали, что в анаэробных условиях могут реализоваться и реализуются на самом деле полные кругообороты всех основных химических элементов. Необходимые трансформации могут осуществляться даже в очень небольшой обедненной кислородом экологической нише, поскольку все они осуществляются с участием микроорганизмов.

РИС. 14.6. Упрощенная схема кругооборота элементов в анаэробных условиях.

 

На рис. 14.6 отражены тесные связи, которые могут устанавливаться между фотосинтезирующими, сбраживающими, сульфатредуцирующими и другими бактериями в анаэробном окружении. Дополнительные сведения по микробиологии почвы можно найти в приведенной в конце главы литературе. В заключение обсуждения следует отметить, что подавляющее большинство промышленно важных микроорганизмов было выделено из почвы.

Микроорганизмы являются основными продуцентами органических веществ в пресноводных водоемах и океане. Как схематично показано на рис. 14.7, зеленые растения и крупные многоклеточные водоросли могут осуществлять фотосинтез только на небольшой глубине вблизи берегов. В открытом океане только свободно плавающие одноклеточные водоросли усваивают солнечную энергию в поверхностных слоях. По мере увеличения глубины фотосинтезирующая активность снижается и, в конце концов, вообще исчезает в силу поглощения света водой и суспендированными твердыми частицами.

РИС. 14.7; Звенья пищевой цепи в водной экосистеме, в которой основным источником энергии является солнечная радиация. Римскими цифрами I, II, III и ІV обозначены абиотические компоненты системы, организмы-продуценты, организмы-потребители и микроорганизмы, разлагающие органические вещества, соответственно.

 

Образующийся в поверхностных слоях океана фитопланктон является питательным веществом для большой цепи организмов-потребителей, роль первого звена в которой выполняет зоопланктон, а завершающими звеньями являются рыбы, киты и другие морские животные. Органические вещества, образующиеся в результате метаболической активности и гибели организмов, составляющих звенья этой цепи, в свою очередь разлагаются микроорганизмами. Возникающие при этом относительно несложные вещества могут утилизироваться фитопланктоном; этот этап замыкает пищевой цикл.

В опасном процессе, называемом эвтрофикацией, избыток питательных веществ вызывает чрезвычайно интенсивный рост водорослей. Некоторые из них продуцируют токсины; бурное размножение водорослей часто сопровождается появлением неприятного запаха. В конечном счете, большая часть водорослей отмирает, высвобождая питательные вещества для гетеротрофных организмов. На этом этапе общая скорость дыхания превышает скорость фотосинтеза, поэтому перенос растворенного кислорода в водную фазу резко уменьшается. Это в свою очередь вызывает массовую гибель рыб и многих других аэробных организмов и таким образом нарушает локальные равновесия, необходимые для существования экосистемы озера или пруда.

 

Биологическая очистка сточных вод

В сточных водах содержится сложная смесь твердых и растворенных веществ, причем последние обычно присутствуют в очень малых концентрациях. На… Теперь перейдем к изучению общих задач и целей каждой из основных операций… В процессе первичной обработки отделяют влажные концентрированные твердые вещества, называемые илом; при вторичной…

Основные характеристики сточных вод

Понятно, что природа и концентрация загрязняющих веществ в сточных водах зависят от их источника. Существуют два основных вида сточных… Бытовые сточные воды обычно содержат более 99% воды, около 300 млн-1 (мг/л)… Если учесть происхождение бытовых сточных вод, то не должен вызывать удивления тот факт, что в них содержатся…

Таблица 14.2. Некоторые параметры, характеризующие качество воды (содержание азота и фосфора в воде после очистки проверяется не всегда)

В стоках промышленных предприятий, связанных с переработкой материалов углеводородной природы, часто содержатся и ядовитые вещества, например формальдегид, аммиак или цианиды. Здесь возникают две взаимосвязанные проблемы: во-первых, эти стоки чрезвычайно опасны для живых организмов в водоемах, куда они сбрасываются, во-вторых, они могут убивать микроорганизмы, участвующие в аэробных и анаэробных процессах переработки отходов. Эффективные и достаточно экономичные методы обезвреживания подобных токсичных веществ пока еще не разработаны.

В остальных разделах этой главы основное внимание будет уделено процессам обработки бытовых сточных вод и их режимам. Такие же процессы часто применяются и для очистки промышленных стоков. Более того, часто промышленные стоки обрабатывают совместно с бытовыми сточными водами.

 

Процессы с участием активного ила

В процессах с участием активного ила основным типом оборудования является проточный аэрируемый биологический реактор. Как показано на рис. 14.10,…   Таблица 14.3. Сравнительная степень загрязненности стоков промышленных предприятийа

РИС. 14.10. Схема процесса очистки воды с участием активного ила.

Чтобы понять основные механизмы утилизации субстрата в этом биореакторе, необходимо сначала изучить природу и морфологию смешанной культуры микроорганизмов, живущих

в аэрируемом реакторе. Одним из наиболее типичных для активного ила организмов является бактерия Zoogloea ramigera. Возможно, наиболее важной характеристикой как этого организма, так и многих других видов, существующих в активном иле, является способность синтезировать и секретировать в среду полисахаридный гель. Именно наличие геля обусловливает агрегацию микроорганизмов и образование хлопьевидных скоплений (флокул), называемых активным илом (рис. 14.11). Активный ил характеризуется высоким сродством к суспендированным твердым веществам, включая коллоидальные частицы. Именно это обстоятельство служит причиной того, что первой стадией разрушения суспендированных твердых частиц в сточных водах является их присоединение к флокулам. Затем, как это показано на рис. 14.12, способные к биодеградации компоненты адсорбированных частиц претерпевают окисление организмами флокулы.

Для того чтобы выгоднее использовать высокую адсорбционную способность активного ила, разработан вариант обычного процесса, называемый контактной стабилизацией. Как показано на схеме (рис. 14.13), в этом процессе рециркулирующий осажденный ил подвергается повторной аэрации прежде, чем он вступит в контакт с отходами, поступающими в аэрируемый резервуар. В последнем органические вещества связываются с флокулами практически исключительно за счет физических сил. Биологическая утилизация связанных органических веществ происходит в основном в процессе повторной аэрации рециркулирующего ила; одновременно восстанавливается адсорбционная способность флокул ила.

Другие модификации процесса с участием активного ила отличаются от базового варианта главным образом способом осуществления контакта сточных вод, ила и воздуха в аэрируемом реакторе. Как показано на приведенной на рис. 14.13 схеме, в процессе со ступенчатой подачей стоков поступающий поток после разделения вводят в аэрируемый резервуар в различных точках. Эффект разделения потока можно оценить, воспользовавшись рассмотренными ранее методами анализа реакторов (гл. 9). Обычный аэротенк с активным илом представляет собой узкий длинный канал (коридор), который по своим характеристикам приближается к трубчатому реактору с незначительной дисперсией.

 

РИС. 14.11. Микрофотография некоторых микроорганизмов активного ила. [Из работы Vnz R. F., Dondero N. С., Water Research, 4, 575 (1970).]

Распределение поступающего потока по длине реактора изменяет характеристики системы таким образом, что коридорный реактор по своему поведению приближается к емкостному реактору с полным перемешиванием.

РИС. 14.12. Предполагается, что первой быстрой стадией разрушения органических веществ в аэрируемом реакторе периодического действия с активным илом является физический процесс—адсорбция органических веществ флокулами ила, затем следует более медленная стадия биологического окисления.

 

Еще ближе к реактору с полным перемешиванием бассейн круглой формы, содержимое которого интенсивно аэрируется с целью обеспечения массопереноса и перемешивания. В такой системе градиенты концентраций растворенного кислорода и питательных веществ минимальны, а развивающаяся популяция организмов активного ила часто лучше переносит флуктуации нагрузки или резкие повышения концентраций токсичных веществ.

Хотя в основе конструкций аэраторов, применяемых в процессах с участием активного ила, лежат принципы, уже рассмотренные нами в гл. 8, конкретные системы аэрации могут быть самыми разными. Помимо барботажа с перемешиванием, обычно используемого в микробиологических процессах, здесь возможно барботирование воздуха через диффузоры, расположенные на дне или в стенках резервуара. В другом варианте на поверхности бассейна вращается мешалка с лопастями, создающая турбулентные течения и способствующая поглощению газа. Третий вариант предусматривает перемешивание и аэрацию с помощью конуса, который забирает жидкость со дна бассейна и разбрызгивает ее на стенки резервуара. Во всех случаях основной задачей системы аэрации и перемешивания является снабжение кислородом микроорганизмов, суспендирование и перемешивание ила и других нерастворимых компонентов системы, а также удаление летучих продуктов метаболизма организмов ила, например СО₂.

РИС. 14.13. Схемы двух процессов биологического окисления. (Схема стандартного процесса с участием активного ила представлена на рис. 14.10.)

 

Помимо высокой адсорбционной и метаболической активности хороший ил должен также быстро оседать. Например,

в цилиндре через 30 мин объем осевшего активного ила должен быть примерно в 40 раз больше объема суспендированных твердых компонентов. Если этот показатель намного выше и объем осевшего ила превышает объем суспендированных твердых частиц, например, в 200 раз, то такой ил не удовлетворяет предъявляемым к нему требованиям, поскольку он будет вытекать из отстойника вместе с очищенными сточными водами. Такое состояние называют объемной перегрузкой; в этом случае обработанные сточные воды не будут отвечать соответствующим стандартам.

Хотя причины, вызывающие объемную перегрузку и механизм этого явления пока еще не выяснены, изучение неудовлетворительного ила часто показывает, что в нем содержатся филаментозные бактерии и жгутиковые простейшие. Напротив, хороший ил обычно не содержит сколько-нибудь многочисленные популяции филаментозных организмов, а из простейших в нем присутствуют главным образом стебельчатые ресничные виды. В процессе очистки воды эти простейшие выполняют полезную функцию, захватывая свободные, т. е. не включенные в флокулы, бактерии и таким образом осветляя обработанные сточные воды.

В нормальных условиях эксплуатации очистных станций филаментозные бактерии и грибы не могут конкурировать с гетеротрофными бактериями, присутствуюш;ими в хорошем иле. Резкие изменения концентраций загрязняющих веществ в поступающих сточных водах или грубое нарушение режима эксплуатации системы водоочистки могут, однако, привести к условиям, неблагоприятным для роста полезных популяций, что в свою очередь позволит другим видам микроорганизмов занять доминирующее положение в системе. Отсюда следует, что результаты как объемной перегрузки, так и нормального режима работы системы водоочистки представляют собой проявления принципов конкуренции видов в смешанных популяциях.

 

Проектирование и моделирование процессов с участием активного ила

Хотя стоимость водоочистных станций большого города превышает 100 млн. долл., входящие в состав этих станций биологические реакторы обычно… Приняв условные обозначения, приведенные на рис. 14.10 (они соответствуют… (14.1)

РИС. 14.15. Согласно структурированной модели Басби и Эндрюса, начальная концентрация биомассы оказывает большое влияние на скорость утилизации субстрата в периодическом процессе.

1—начальная концентрация x_s(0)=750 мг/л; перенос субстрата к начальной биомассе затруднен; 2—x_s(0)=300 мг/л; 3—x_s(0) = 100 мг/л.

 

Приведенные на этом рисунке кривые, конечно, можно интерпретировать и как зависимость концентрации организмов в аэрируемом реакторе с поршневым потоком от их положения в реакторе. Как особенно интересную деталь этих расчетов следует отметить предсказываемое моделью существенное повышение скорости поглощения субстрата при уменьшении начальной концентрации биомассы. Подобное поведение согласуется с повышенной эффективностью процесса с контактной стабилизацией, В котором начальная биомасса превращается в другие формы биомассы главным образом в аэротенке, куда вода поступает после осветления.

С помощью рассматриваемой кинетической модели Эндрюс и сотрудники успешно описали большинство вариантов процессов с участием активного ила в стационарном состоянии. В соответствующих расчетах перемешивание в аэротенке моделировали с помощью каскада из 4 ПРПП. Первичный и вторичный отстойники описывали моделями, которые подробно рассмотрены в указанной в конце главы литературе. В реальном диапазоне нагрузок и масштабов процесса вычисленные величины эффективности, скорости снижения ВПК и другие эксплуатационные характеристики хорошо согласовывались с экспериментальными данными для соответствующих процессов. Некоторые из полученных результатов приведены в табл. 14.6.

 

Таблица 14.6. Основные эксплуатационные характеристики некоторых процессов биологического окисления (во всех случаях скорость поступления сточных вод принята равной 1000 м³/ч)^а

Поскольку структурированная модель успешно описывала множество альтернативных процессов с участием активного ила в стационарном состоянии, она оказалась незаменимой при анализе динамики систем водоочистки с участием активного ила. Подтверждением могут служить данные, представленные на рис. 14.15, на котором показано, что динамика изменения концентрации субстрата чрезвычайно чувствительна к изменению общей концентрации биомассы в определенном диапазоне последней. Динамику и регулирование таких процессов мы рассмотрим позднее при изучении методов анаэробной переработки ила. Читатели, особенно интересующиеся управлением и регулированием систем с активным илом, могут ознакомиться с этой проблемой в обзорных статьях Эндрюса [5—7].

Начаты работы по созданию еще более детальных и глубоко структурированных моделей, исчерпывающе описывающих взаимодействия между популяциями бактерий и простейших в активном иле. В ряде работ, посвященных моделированию динамики активного ила, Курде изучал пищевую цепь, изображенную на рис. 14.16. Как показано на этом рисунке, в систему поступают только те субстраты и бактерии, которые находятся в потоке сточных вод. В то же время, еще раз обратившись к рис. 14.10, нетрудно заметить, что поступающий в аэротенк поток представляет собой смесь сточных вод и рециркулирующего ила, поэтому весьма важно учитывать и судьбу организмов, обитающих в фазе флокул и затем участвующих в рециркуляции ила.

РИС. 14.16. Пищевая цепь, положенная в основу изучения межвидовых взаимодействий микроорганизмов в активном иле в работах Курдса.

 

В модели Курдса к этим видам (на рис. 14.16 они подчеркнуты) относятся бактерии ила, связанные и свободно плавающие простейшие, питающиеся суспендированными, но не включенными во флокулы бактериями, и, наконец, связанные с флокулой хищные простейшие, питающиеся как свободными, так и связанными с флокулой простейшими.

Поскольку теперь мы уже знакомы с методикой вывода уравнений материального баланса по отдельным компонентам, то приведем только основные допущения, необходимые для вывода уравнений Курдса:

1. Аэротенк представляет собой идеальный ПРПП.

2. Зависимость удельной скорости роста каждого из представленных на рис. 14.16 видов от концентрации питательных веществ описывается уравнением Моно. Применявшиеся при моделировании кинетические константы перечислены в табл. 14.7; считается, что экономический коэффициент на всех стадиях равен 0,5.

3. Концентрация флокулирующнх организмов при реииркуляппн ила прямо пропорциональна их относительной концентрации в вытекающем из аэротенка потоке. Так, например,

(14.11)

где b_i — коэффициент концентрирования в отстойнике для вида і. Эти константы также перечислены в табл. 14.7. Принимается, что для субстрата b=1.

 

Таблица 14.7. Параметры популяций различных микроорганизмов в модели активного ила по Курдсу^а

Третье допущение позволяет учесть в модели процессы в отстойнике, а таким путем и влияние рециркуляции.

Наличие свободно плавающих и прикрепленных к флокулам форм хищных простейших и питающихся бактериями простейших приводит к образованию четырех пар хищник — жертва, указанных на рис. 14.16 символами а - г. Курде рассматривал каждую пару хищник — жертва изолированно, допуская при анализе, что на данном трофическом уровне три других взаимодействия хищник — жертва не реализуются. Во всех случаях обнаружен ряд тенденций общего характера; так, при анализе влияния хищных ресничных, которым пренебрегали во многих аналогичных работах, было показано, что их присутствие приводит к снижению численности популяции жертв ресничных (по сравнению с системой, в которой нет хищников).

 

РИС. 14.17. Моделирование межвидовых взаимодействий в активном иле, в котором свободно плавающие ресничные простейшие питаются связанными с флокулами ила ресничными простейшими. [Из статьи: Curds С. R., Water Res., 7, 1269 (1973).]

В свою очередь это обстоятельство приводит к повышению численности популяций бактерий, находящихся в сточных водах. Поскольку бактерии ила конкурируют с бактериями сточных вод за общее питательное вещество, то в результате снижается численность популяций бактерий ила.

Что касается пар хищник — жертва а и б, то они индуцируют вымывание популяции жертв ресничных из системы. Взаимодействие типа в обусловливает слегка затухающие колебания, изображенные графически на рис. 14.17. Только межвидовое взаимодействие типа г, относительно редкое в популяциях активного ила, приводит к устойчивым отличным от нуля популяциям всех видов в стационарном состоянии. Во всех соответствующих расчетах приняты следующие значения параметров: F=100 л/ч, α = 1, β = 0,05264, s₀ = 200 мг/л, b₀ (начальная концентрация бактерий в сточных водах) =30 мг/л.

Одним из недостатков как рассматриваемой, так и многих других моделей является допущение о постоянстве скорости потока сточных вод и их состава. На практике, однако, характер образа жизни населения города или поселка обусловливает флуктуации как объема, так и состава сточных вод, поступающих на очистные станции. В первом приближении эти флуктуации можно считать периодическими с периодом 24 ч, а их амплитуда зависит в первую очередь от конструкции системы трубопроводов, по которым сточные воды поступают на очистные станции. Так, если очистная станция обслуживает крупный город, то трубопроводы, соединяющие источники сточных вод со станцией, могут иметь самую разную длину, поэтому сама сеть трубопроводов обеспечивает существенное сглаживание флуктуаций. Большие флуктуации возможны на небольших очистных станциях. При флуктуациях отношение максимального значения какого-либо параметра к минимальному обычно равно примерно 3, хотя в отдельных случаях величина этого отношения может достигать более 10.

В одной из первых попыток изучения влияния периодических флуктуации количества и состава сточных вод Курдс рассматривал поведение описанной выше системы при следующих периодических изменениях параметров поступающего в систему водоочистки потока:

(14.12)

где t — время, сут; популяции хищников здесь не рассматриваются. Результаты моделирования, представленные на рис. 14.18, свидетельствуют о последовательной смене доминирующих популяций, в этом отношении изучаемая система напоминает процессы порчи пищевых продуктов и периодическую смену преобладающих видов в частицах почвы. Другим интересным результатом моделирования является вывод о выживании связанных с флокулами ресничных, в то время как свободно плавающие и передвигающиеся по поверхностям ресничные должны вымываться. На практике в хорошем иле свободно плавающие ресничные не обнаружены, однако передвигающиеся по поверхностям организмы присутствуют в нем. Следовательно, описываемая модель нуждается в дальнейшей доработке. В заключение следует отметить, что между колебаниями численности популяций, представленными на рис. 14.17 и 14.18, имеются принципиальные различия. В последнем случае колебания являются вынужденными, поскольку они обусловлены периодическими флуктуаииямн количества и состава поступающих в систему стоков. Напротив, колебания первого типа, наблюдающиеся при постоянстве количества и состава сточных вод, являются автономными и отражают специфические нелинейные характеристики системы. Дальнейшее обсуждение этой проблемы читатель может найти в обзоре Бейли (ссылка [10] в гл. 11).

Хотя разработанные в последние годы Эндрюсом, Курдсом и другими структурированные модели весьма перспективны в отношении как совершенствования методов проектирования процессов, так и создания систем управления этими процессами, они пока еще не нашли широкого применения. Можно надеяться, однако, что после дальнейшей аналитической и экспериментальной проверки модели этого типа будут использоваться значительно шире.

 

Аэробная обработка ила

Активный ил с большим содержанием бнопродуктов, образующийся в рассмотренных выше процессах, часто подвергают еще одной операции аэробной обработки;… РИС. 14.18. Моделирование динамики системы с активным илом, в которой скорость потока поступающих сточных вод,…

Нитрификация

В обычных процессах обработки отходов с аэрацией в числе подвергающихся биологическому окислению субстратов имеются и азотсодержащие органические…

Вторичная очистка сточных вод с помощью капельных биологических фильтров

В довольно распространенном варианте очистки сточных вод с участием активного ила применяют так называемые капельные, или перколяционные… Использование термина «фильтр» для описания этой системы водоочистки во многих… Подлежащие очистке сточные воды контактируют прежде всего с верхней частью неподвижного слоя, толщина которого…

Математическое моделирование динамики процесса анаэробной переработки ила

Несмотря на очевидные выгоды, связанные с образованием газообразного топлива и ценного удобрения (твердых отходов), метантенки заслужили плохую… Поскольку работа в более стабильных эксплуатационных режимах способствовала бы… Выше уже упоминалось, что в последовательности биологических реакций (14.13) стадией, определяющей скорость всей…

Таблица 14П3.1. Методы управления процессами анаэробной переработки ила

В каждом случае регулирование переменной осуществляли способом «включено — выключено»^а

Преимущества и недостатки этих и других методов управления биореакторами для анаэробной переработки ила суммированы в табл. 14П3.1. Из указанных здесь результатов моделирования следует, что для устойчивой работы биореактора для анаэробной переработки ила при наличии перегрузок всех трех типов необходима схема управления с несколькими измеряемыми переменнымн, например рН и скоростью образования метана. В соответствии с результатами этих измерений далее следует регулировать другие параметры системы (например, скорость рециркулирующего газа и время пребывашш газа и ила).

 

Анаэробная денитрификация

В анаэробных условиях многие бактерии, которые могут утилизировать органические вещества и использовать нитрат и нитрит в качестве акцепторов…   1. При ассимилирующем восстановлении нитрата часть азотсодержащих соединений превращается в аммиак, который включается…

Отделение фосфорсодержащих соединений

В необработанных сточных водах фосфор обычно содержится в концентрации около 10 мг/л в виде ортофосфата, дегидратированного ортофосфата…

Упражнения

14.1. Проектирование процессов нитрификации. а) Какова величина БПК очищенной воды, если возраст ила определяли по заданной концентрации аммиака… (Y'=Yнабл) (см, пример 14.2). 14.2. Сравнение промышленных биореакторов и биореакторов для очистки сточных вод. В табл. 14У2.1 суммированы…