Применение биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток

 

Рассматривая примеры, иллюстрирующие степень сложности процессов катализа с участием иммобилизованных клеток, мы начнем с самого простого случая и постепенно будем переходить ко все более и более сложным случаям. Путем иммобилизации целых клеток, предварительно обработанных с целью повышения их проницаемости литическими ферментами, спиртами или диметилсульфоксидом (ДМСО), мы, по сути дела, иммобилизуем входящие в их состав индивидуальные ферменты, в той или иной мере сохраняя их естественное окружение; такие катализаторы в принципе пригодны для использования в непрерывных процессах. К настоящему времени получено большое число катализаторов типа «иммобилизованные ферменты в

РИС. 9.28. Инактивация аспартазы и фумаразы в суспендированных и иммобилизованных клетках. (Воспроизведено с разрешения из работы: Immobilized Enzymes, Chibata I. (ed.), p. 140, Kodansha Ltd., Tokyo, 1978.)

 

иммобилизованных клетках»; некоторые из этих катализаторов нашли применение в промышленности. Такой подход к иммобилизации ферментов проще, чем выделение ферментов из клеток с последующей иммобилизацией. С точки зрения практического использования, по-видимому, важнее другое преимущество иммобилизованных клеток, заключающееся в возможном повышении стабильности ферментов.

На рис. 9.28 представлены результаты экспериментов по изучению инактивации аспартазы и фумаразы в иммобилизованных клетках Е. coli и в суспендированных интактных клетках того же организма. В иммобилизованных клетках инактивация как первого, так и второго ферментов происходит значительно медленнее. Возможно, что отчасти эта стабильность является кажущейся и обусловлена ограничениями ферментативных процессов за счет сопротивления массопереносу (см. разд. 4.4). Действительно, если катализатор на основе иммобилизованных клеток (или ферментов) функционирует в режиме, строго лимитируемом диффузией, то наблюдаемая скорость инактивации будет значительно ниже действительной скорости этого процесса. Однако в дальнейших экспериментах Шибата и др. показали, что в данном конкретном случае имеет место истинная стабилизация фермента вследствие его включения в нативное клеточное окружение. Интактные клетки Е. coli были обработаны ультразвуком, затем растворимая и нерастворимая фракции продуктов обработки были разделены и иммобилизованы. В иммобилизованной растворимой фракции аспартазная активность снижалась значительно быстрее, чем в иммобилизованной нерастворимой фракции. Кроме того, обработкой интактных клеток агентами, солюбилизирующими связанные с мембранами белки (дезоксихолатом или тритоном Х-100), также были получены растворимая и нерастворимая фракции, которые после иммобилизации быстро теряли активность. Эти результаты свидетельствуют о возможности стабилизации аспартазы путем связывания или ассоциации с клеточными мембранами или с их компонентами. Следует отметить, однако, что в других случаях иммобилизация ферментов в интактных клетках сопровождается и обратным эффектом. Так, в проницаемых иммобилизованных клетках некоторых организмов глюкозоизомераза теряет активность быстрее, чем тот же самый фермент, выделенный из этих клеток. Этот эффект объясняли протеолизом фермента под действием внутриклеточных ферментов.

Проблема внутриклеточной протеолитической активности очень важна при любом применении иммобилизованных клеток. Как мы упоминали в гл. 6, для нормальной жизнедеятельности клеткам необходимы внутриклеточные гидролазы. Очевидно, что потеря ферментативной активности в результате внутриклеточного гидролиза, а также разрушение клеточной мембраны или утрата клеткой способности транспортировать вещества за счет какого-либо другого процесса играют основную роль в определении полезного времени жизни катализатора на основе иммобилизованных клеток. Для оптимизации генетической природы клеток и разработки более совершенных катализаторов на основе иммобилизованных клеток, соответствующих конструкций реакторов и оптимальных режимов их эксплуатации, очевидно, необходимо лучше понимать механизмы процессов внутриклеточного гидролиза, а также других процессов инактивации, связанных с изменением конформаций белковых молекул или с повреждением мембран вследствие химического взаимодействия с компонентами среды. Действительно, на разработку штаммов микроорганизмов, успешно применяюш.ихся в настоящее время в культурах суспензий клеток, были затрачены десятилетия; в этой связи представляется вполне вероятным, что для получения генетически модифицированных штаммов, специально предназначенных для их использования в иммобилизованной форме, потребуются еще очень большие усилия.

Следующий по степени сложности уровень каталитической активности включает многостадийные превращения, связанные с использованием и регенерацией кофакторов. Из процессов такого типа наиболее широко изучалось превращение глюкозы в анаэробных условиях. Много работ посвящено изучению превращения глюкозы в этанол иммобилизованными дрожжами (Saccharomyces cerevisiae) или бактериями (в первую очередь Zymomonas mobilis); по меньшей мере один процесс с участием биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток реализован на пилотной установке [34].

Изучению превращения глюкозы в этанол при участии иммобилизованных клеток предшествовали работы по исследованию непрерывных процессов пивоварения в присутствии склонных к флокуляции штаммов дрожжей; по сути дела, флокуляция обеспечивает достаточно эффективное удерживание (иммобилизацию) клеток в реакторе с псевдоожиженным слоем катализатора (разд. 9.6.4). Позднее дрожжи иммобилизовали путем адсорбции на желатиновой пленке и включения в n-каррагинан, альгинат или полиакриламид. Показано, что для реактора колонного типа с клетками Saccharomyces carlsbergensis, иммобилизованными в х-каррагинане, характерен стартовый период с неустановившимся режимом, продолжающийся около 7 сут, после чего колонна функционирует в стационарном режиме с постоянными концентрациями жизнеспособных клеток в геле, а также глюкозы и этанола в продуктах процесса. После ряда конструкционных доработок концентрацию этанола в продуктах процесса удалось довести до 100 г/л и более.

Японская компания Kyowa Накко Kogyo Company сообщила о создании пилотной установки для производства этанола с помощью иммобилизованных дрожжей в реакторе с псевдоожиженным слоем катализатора (разд. 9.6.4). Схема этой установки представлена на рис. 9.29. После трехмесячных испытаний удалось найти режим, при котором разбавленная меласса сахарного тростника (содержащая 14% глюкозы) при 30 °C превращалась в 8,5%-ный (по объему) водный этанол с объемнойскоростью [(объем раствора исходных веществ) · (объем геля)^-1·ч^-1] от 0,4 до 0,5 ч^-1. Степень превращения сахара в этанол составляла 95%, а производительность установки в расчете на единицу объема колонны 20 г/ (л·ч).

Более сложен процесс превращения глюкозы в ацетон, бутанол и этанол с помощью бактерии Clostridium acetobutylicum и родственных организмов. Пути катаболизма в этой бактерии

контролируются сложной регуляторной системой, которая до настоящего времени детально не изучена, несмотря на большой практический опыт по применению этого организма в традиционных ферментациях с участием суспендированных культур.

РИС. 9.29. Схема установки для производства этанола с помощью иммобилизованных дрожжей [34].

 

В зависимости от состава и условий среды и состояния клеток в одних случаях основными конечными продуктами метаболизма глюкозы могут быть органические кислоты, а в других образуются необходимые органические растворители. По сравнению с катализируемым дрожжами превращением глюкозы в этанол эта система значительно сложнее, поскольку здесь мы должны уметь регулировать селективность процесса, направляя его в сторону образования ценных веществ.

Возможность практической реализации непрерывного длительного процесса биопревращения глюкозы в органические растворители была продемонстрирована Фёрбергом и др. [35]. В разработанном ими процессе катализатором служил организм Cl. acetobutylicum, включенный в гель на основе альгината кальция, а глюкозная среда была лишена факторов, необходимых для клеточного роста. Время от времени, сначала с интервалом 2—4 ч, а затем через каждые 8 ч в культуру вводили полную питательную среду, что позволяло регенерировать частично инактивированный катализатор. Сообщалось, что в таком режиме, сочетающем не связанное с клеточным ростом многостадийное биологическое превращение с короткими периодами

 

Таблица 9.9. Выход бутанола в расчете на единицу клеточной массы, массы субстрата или объема культуры с участием иммобилизованных^а и суспендированных^а клеток

полного клеточного роста, система устойчиво функционировала в течение 8 недель. В этом процессе существенно подавлялось образование биомассы, а выход бутанола в расчете на единицу массы утилизированной глюкозы был значительно выше, чем в процессе, в котором иммобилизованные клетки контактировали с полной средой. В табл. 9.9 сравниваются важнейшие параметры процессов с использованием иммобилизованных клеток в полной среде, иммобилизованных клеток с чередованием сред (обеспечивающих только клеточный рост или только превращение субстрата), а также обычного периодического процесса с суспензией бактерий.

Очевидно, что для дальнейшего совершенствования катализаторов на основе иммобилизованных клеток необходимы фундаментальные исследования и проектные разработки. Вместе с тем приведенный пример достаточно наглядно свидетельствует о возможности изменения кинетики и стехиометрии процесса путем подбора типа катализатора и соответствующего режима; этот путь создает дополнительные возможности для управления биокаталитическими процессами и их оптимизации.

В связи с рассмотренными примерами целесообразно изучить и интересную проблему переноса газов в иммобилизованных клеточных катализаторах и реакторах с такими катализаторами. Здесь мы рассмотрим только частную проблему массопереноса в самом биокатализаторе. Допустим, что стехиометрию данного биопревращения можно описать уравнением простой химической реакции и что перенос субстрата S и продукта процесса Р в частицы катализатора и из них характеризуется коэффициентами эффективной диффузии D_s и D_p соответственно. С помощью основных уравнений материальных балансов и граничных условий на частице катализатора нетрудно показать, что концентрации продукта процесса c_р и субстрата c_s внутри катализатора связаны уравнением

(9.113)

в котором α обозначает число молей продукта, образующегося из 1 моля утилизированного субстрата, а подстрочный индекс 0 указывает на условия на наружной границе (поверхности) частицы катализатора. Подставив в уравнение (9.113) c_s = 0 и решив полученное уравнение, можно оценить максимальную для данного катализатора концентрацию продукта, основываясь только на данных о стехиометрии и массопереносе. Если в системе происходит поглощение и образование газов, это простое уравнение позволяет сделать важные выводы. Предположим сначала, что субстрат представляет собой ограниченно растворимый газ, например кислород. Тогда из уравнения (9.113) следует, что в результате реакции с одной частицей катализатора произойдет лищь незначительное повыщение концентрации продукта. Если мы далее рассмотрим другой вариант, когда в биокаталитическом процессе образуется умеренно растворимый газ, например СО₂, и когда используется хорошо растворимый субстрат, например глюкоза, то, очевидно, может наступить такой момент, когда концентрация СО₂ в катализаторе превысит уровень насыщения, что приведет к зарождению и росту газовых пузырьков внутри частицы катализатора. Сообщалось, что такое явление вызывает серьезные затруднения в работе реакторов с иммобилизованными клетками, так как газовые пузырьки механически разрывают частицы носителей с включенными клетками, продуцирующими СО₂, или патроны с дрожжевыми клетками, иммобилизованные в полых волокнах.

Итак, мы сталкиваемся с определенными трудностями как при получении продукта из малорастворимых субстратов, так и при выведении из катализатора малорастворимых продуктов.Очевидно, эти трудности можно преодолеть путем снижения толщины частиц катализатора. Тогда отпадет необходимость в использовании неэффективной внутренней зоны частиц в случае ограниченно растворимого газа-субстрата, а ограниченно растворимые продукты не будут в избытке образовываться внутри частицы катализатора. В свою очередь для снижения толщины катализатора нужно или уменьшить размер частиц, или использовать катализаторы с тонким слоем клеток, иммобилизованных путем включения или связывания на наружной поверхности большей частицы или иного объекта, которые бы удерживали клетки в реакторе. Выполнение требований, предъявляемых к вводу и выводу ограниченно растворимых соединений, является одним из основных условий при проектировании всего процесса и соответствующего реактора.

Интересно отметить, что, как было обнаружено экспериментально, процессы получения этанола из глюкозы с помощью иммобилизованных или суспендированных дрожжей в сходных условиях имеют различные общие скорости. В некоторых из этих экспериментов, возможно, существенный вклад в общую скорость процесса вносили диффузионные ограничения и связанные с ними эффекты; вместе с тем в тщательно контролируемых идентичных условиях и в отсутствие ограничений массопереносу наблюдалось обусловленное иммобилизацией клеток повышение удельной скорости образования этанола на 30—50%. Высказывалось предположение, что причиной этого явления может быть или локальное изменение активности воды, вызванное матрицейносителем или ее поверхностью, или изменение химического микроокружения носителя, рассмотренное ранее.

В общем случае нас не должно удивлять существенное изменение метаболической активности клеток, обусловленное их необычным окружением в иммобилизованном состоянии. Связывание или сцепление клетки с твердой поверхностью может узнаваться специфическими клеточными рецепторами, влияющими на метаболические функции клетки. Точно так же нарушение нормального морфологического развития клетки вследствие ее связывания в нескольких точках с твердой поверхностью, влияния полых волокон, в которые включены клетки, или межклеточных контактов может обусловливать заметное изменение картины метаболизма клетки, которое не наблюдается в относительно неконцентрированных суспензиях. Кроме того, в плотных скоплениях иммобилизованных клеток некоторые секретируемые клетками продукты жизнедеятельности могут накапливаться в значительно более высоких по сравнению с суспензиями концентрациях. Наконец, можно достаточно обоснованно ожидать, что каталитические свойства относительно независимо развивающихся клеток и катализатора на основе иммобилизованных клеток, который по клеточной плотности ближе к тканевым препаратам, будут заметно различаться. Следовательно, применению катализаторов на основе иммобилизованных клеток должно предшествовать изучение их собственных кинетических характеристик, которые могут отличаться от кинетики аналогичных превращений в суспензии клеток, а поэтому результаты изучения последних даже в идентичных условиях могут оказаться неприменимыми к иммобилизованным клеткам. При рассмотрении более сложных биокаталитических функций мы вправе ожидать еще более сложных зависимостей биохимической активности клеток от морфологии.