Программированное управление процессами в биореакторах периодического действия
Обеспечить максимальный выход продукта в периодическом процессе с участием определенного штамма микроорганизмов можно только в том случае, если заранее известны те среда и условия, в которых этот организм проявляет наибольшую активность или, говоря иными словами, в которых генетический потенциал организмов используется в максимальной степени. В зависимости от имеющихся контрольно-измерительной аппаратуры и систем управления, проблему оптимизации условий биопроцесса можно решить различными путями. В простейшем варианте, например в случае колбы, установленной на качалке, в ходе процесса обычно не измеряют и не регулируют ни одного параметра, кроме температуры, а управление процессом сводится к нахождению оптимального начального состава среды и наилучшего температурного режима. Если непосредственно регулируются только параметры окружения, то оптимизации процесса в биореакторе может способствовать контроль рН, интенсивности перемешивания или других параметров окружения. В таких случаях регулируемый параметр обычно поддерживают на постоянном уровне в ходе всего периодического процесса, если только необходимое для данной системы значение параметра вообще достижимо. (Если, например, потребность культуры в кислороде не обеспечивается даже при максимальной скорости переноса кислорода в биореакторе, то регулировать концентрацию растворенного кислорода, очевидно, не имеет смысла.)
Как известно, однако, во многих случаях постоянство условий и состава среды не обеспечивает оптимального течения микробиологического процесса. Так, быстрый рост клеток не способствует образованию вторичных метаболитов, но в то же время на начальной стадии периодического процесса низкая скорость клеточного роста нежелательна, если плотность исходной культуры невелика. Поэтому сначала условия процесса должны обеспечивать максимальную скорость клеточного роста, а затем, когда будет достигнута достаточно высокая концентрация биомассы, их необходимо изменить так, чтобы они стимулировали образование максимального количества продукта метаболизма. На этой стадии важно учитывать не только скорость синтеза продукта метаболизма, но и скорость его инактивации или разложения.
Аналогично при производстве белков с помощью культур генетически видоизмененных клеток в начале периодического процесса обычно выгоднее затормозить биосинтез белка, поскольку последний часто ингибирует клеточный рост и может осложнить решение проблемы генетической нестабильности. По достижении необходимой плотности культуры генетический аппарат клеток можно переключить на образование белка путем введения индуктора (или посредством подавления ингибитора экспрессии соответствующего гена). Таким образом, режимы периодических процессов биосинтеза вторичных метаболитов и синтеза белков с помощью рекомбинантных ДНК могут быть сходными, несмотря на принципиальные различия в биохимии и механизмах регуляции этих процессов.
В любой данный момент активность периодической культуры зависит как от состава среды и условий окружения клеток, так и от предыстории культуры и среды. Для того чтобы культура к определенному моменту достигала наибольшей продуктивности, могут потребоваться определенные профили изменения рН, концентрации растворенного кислорода и других переменных во времени. Часто необходимые зависимости переменных от времени находят эмпирическим путем. В то же время достаточно глубоко структурированная математическая модель процесса в принципе позволяет обеспечить максимальную производительность путем моделирования и оптимизации с помощью ЭВМ. В последующих разделах мы рассмотрим ряд примеров, иллюстрирующих преимущества программированного регулирования периодических процессов, а также методы составления оптимальных программ для таких процессов.
Образование фермента β-галактозидазы в периодической культуре Aspergillus niger подчиняется тем же закономерностям, что и биосинтез вторичных метаболитов. Лунделл [41] предложил способ управления этим процессом с помощью ЭВМ, который базируется на следующих принципах:
Фаза клеточного роста
1. Для повышения концентрации клеточной массы и увеличения продолжительности фазы роста необходимо добавлять в систему питательное вещество — источник углерода.
2. Источник углерода необходимо добавлять периодически по мере его истощения, что определяют по снижению скорости выделения CO2 и дыхательного коэффициента до 20% от соответствующих максимальных величин.
3. Температуру и рН необходимо установить на уровне, обеспечивающем максимальную скорость клеточного роста.
4. Во избежание излишнего расхода энергии скорость вращения мешалки и скорость поступления воздуха должны быть минимальными, что определяется скоростью переноса кислорода в системе, скоростью выделения CO2 и дыхательным коэффициентом.
Таблица 10.4. Основные характеристики некоторых периодических процессов, изучавшихся в ходе работ по оптимизации биосинтеза β-галактозидазы штаммом Aspergillus niger. В каждом процессе общее давление составляло 130 кПа, а концентрация растворенного кислорода 20% от уровня насыщенияа
Фаза биосинтеза фермента
1. Когда скорость роста клеток упадет (снизятся скорость выделения CO2 и дыхательный коэффициент), режимы процесса следует переключить на условия, способствующие образованию фермента.
2. Температура и рН должны обеспечивать оптимальную скорость биосинтеза фермента.
3. Скорость вращения мешалки и подачи воздуха следует снизить до необходимых величин (фаза биосинтеза фермента характеризуется малой скоростью потребления кислорода и пониженной вязкостью бульоьона).
4. При снижении скорости биосинтеза фермента следует добавить соответствующий индуктор.
5. Для продолжения клеточного роста необходимо добавлять питательные вещества.
6. После добавления поверхностно-активного вещества при резком снижении скорости образования фермента процесс следует прекратить.
В табл. 10.4 суммированы основные характеристики изученных экспериментально режимов ведения процесса. В периодическом процессе с продолжительной фазой образования фермента (ПФОФ) питательное вещество добавляют в фазе биосинтеза фермента. В периодическом процессе с продолжительной фазой роста биомассы (ПФРБ) питательное вещество добавляют не только в начале процесса, но и в фазе роста. В процессе ПФОФ/ПФРБ объединены условия как первого, так и второго процессов. На рис. 10.24 представлены профили изменения количества образовавшегося фермента в обычном периодическом процессе и в ПФОФ. Эксплуатационные характеристики всех четырех процессов перечислены в табл. 10.5. Тщательный подбор оптимальных условий периодического процесса в сочетании с автоматическим анализом данных и регулированием позволил повысить выход фермента на 70% и одновременно снизить расход энергии на 50%. Обратите внимание на то, что в основном последовательные изменения рел<има программируются заранее, хотя конкретный момент переключения с одного режима на другой определяют по результатам непосредственных измерений и последующего расчета параметров процесса. Последнее обстоятельство очень существенно с практической точки зрения, особенно если принять во внимание, что состав как посевного материала, так и среды непостоянен и может меняться от одной загрузки к другой.
Известно, что повышение температуры (30 °С) способствует ускоренному росту плесневого гриба Репісіllіum, в то время как более низкие температуры (около 20°С) в большей степени благоприятствуют ускоренному синтезу пенициллина. Ранее промышленное получение пенициллина проводили преимущественно при температуре, лежащей между этими двумя предельными значениями (от 24 до 25 °С), однако программированное изменение температуры в ходе периодического процесса позволяет существенно повысить выход пенициллина по сравнению с процессом, проводимым при любой постоянной температуре. Для разработки оптимальной программы изменения температуры применяли стандартные математические методы [42, 43]; ниже суммированы наиболее интересные результаты этих работ.
Применение теории оптимального управления требует создания соответствующей математической модели. На рис. 10.25 крестиками отмечены экспериментальные данные, полученные при проведении ферментации в промышленных аппаратах при постоянной температуре (25 °С). Во избежание отображения характеристик, относящихся только к какому-либо конкретному процессу, эти данные приведены в безразмерной форме. На графиках не отражена лаг-фаза, так как первые данные относятся ко времени, когда после начала процесса прошло 50 ч. Характер изменения измеренных параметров во времени предполагает следующее общее математическое описание кинетики клеточного роста и образования продукта метаболизма;
(10.14)
(10.15)
РИС. 10.24. Образование β-галактозидазы в культуре Aspergillus niger в периодическом процессе (а) и в периодических процессах с добавлением субстрата (б и в). Цифрами на двух нижних рисунках обозначены управляемые ЭВМ изменения режима периодического процесса; 1 — повышение скорости вращения мешалки; 2 — снижение скорости вращения мешалки; 3 — постоянная скорость вращения мешалки; 4, 5, 6 — добавление органического питательного вещества; 7 — добавление поверхностно-активного вещества. (Воспроизведено с разрешения из работы: Lundell R., Practical Implementation of Basic Computer Control Strategies for Enzyme Production, in Computer Applications in Fermentation Technology, p. 181, Society of Chemical Industry London, 1982.)
a —температура, °C; 5— β -галактозидазная активность; е — концентрация CO2 в отходящих газах, об.%; г — масса ферментера, кг; д —скорость вращения мешалки, с-1; е — дыхательный коэффициент, кг/кг.
Таблица 10.5. Основные результаты некоторых экспериментальных периодических процессов, изученных с целью оптимизации образования β-галактозидазы в культуре Aspergillus nigerа
где x1 и x2 — безразмерные концентрации биомассы и пенициллнна соответственно. Выражение (10.14) представляет собой логистическое уравнение, с которым мы познакомились в гл. 7, а уравнение (10.15) является вариантом рассмотренного ранее уравнения Льюдикина — Пайрета, к которому добавлено слагаемое, отражающее процесс деградации пенициллина. О необходимости введения этого дополнительного члена свидетельствует уплощение кривой накопления пенициллина при больших t (рис. 10.25). Другие данные также свидетельствуют о гидролизе пенициллина в водных растворах н о возможности разрушения пенициллин-сннтезирующей системы во времени.
Сравнение вычисленных зависимостей x1 и x2 от времени при различных значениях параметров b1—b5 с экспериментальными данными показывает, что сумма квадратов отклонений для всех экспериментальных данных минимальна при T = 25°C, если b5=0, и тогда
(10.16)
Для того чтобы установить зависимость этих параметров от температуры,
нужно учесть указанные значения при 25 °C, а также 1) известные оптимальные температуры для скорости роста клеток (30°С) и скорости синтеза пенициллина (20 °С) и 2) экспериментальные данные, показывающие, что константа скорости деградации пенициллина описывается уравнением Аррениуса с энергией активации 12—15 ккал/моль.
РИС. 10.25. Результаты экспериментального изучения промышленного периодического процесса производства пенициллина при 25 °С. [Воспроизведено с разрешения из статьи: Constantinides А., Spencer J. L., Gaden E. L.. Jr., Optimization of Batch Fermentation Processes. I. Development of Mathematical Models for Batch Penicillin Fermentations; Biotech. Bioeng., 12, 803 (1970).]
Перечисленные выше факты позволяют предложить следующие уравнения;
(10.17)
где θ — температура в градусах Цельсия.
Теперь, объединив все указанные уравнения, можно записать математическую модель процесса в общем виде
(10.18)
с начальными значениями
(10.19)
После этого нашу основную цель — максимальный выход пенициллина — можно выразить в строгой математической форме. Для этого необходимо найти θ как функцию t в диапазоне от t=0 до окончания процесса (t=T) так, чтобы x2(Т) было максимальным. Согласно принципу максимума [5] для оптимальной программы изменения температуры, которую мы обозначим символом θ*, функция гамильтониана H
(10.20)
должна принимать максимальное значение при θ = θ*(t) для всех t от 0 до T. Надстрочный знак звездочка (*) в уравнении (10.20) указывает, что соответствующие параметры определены с помощью θ*, а входящие в то же уравнение переменные λi удовлетворяют дифференциальным уравнениям
(10.21)
и условиям
(10.22)
Эти необходимые условия и другие теоретические результаты предполагают следующий итерационный алгоритм для расчета оптимальной температурной программы:
1. Пусть θ(n)(t) обозначает n-е приближение программы.
2. Решить уравнения (10.14) и (10.15) относительно x1(n)(t), x2(n)(t), приняв,
что θ = θ(n).
3. Используя x1(n), x2(n), θ(n) определить зависящие от времени коэффициенты в правой части уравнения (10.21), проинтегрировать эти уравнения в обратном направлении в численной форме от t=T до t=0 и таким образом определить λ1(n)(t), λ2(n)(t) (обратное интегрирование необходимо, чтобы избежать численной нестабильности, встречающейся в тех случаях, когда ин¬
тегрирование начинают при t = 0).
4. Вычислить
(10.23)
Определить (n+l)-e приближение оптимальной программы при помощи
(10.24)
где ε — небольшое положительное число.
Константинидес, Спенсер и Гэйден [42, 43] применили эту методику (в несколько модифицированном виде), чтобы предотвратить снижение концентрации биомассы. Результаты этих исследований приведены на рис. 10.26. Обратите внимание на то, что вначале устанавливали более высокую температуру (чтобы обеспечить максимальную скорость клеточного роста), а затем ее снижали (чтобы добиться оптимальной скорости образования пенициллина). В конечном итоге программированное изменение температуры позволило повысить выход пенициллина на 76,6% по сравнению с наиболее эффективным процессом при постоянной температуре (25 °С).
РИС. 10.26. Оптимальная программа изменения температуры и соответствующие профили клеточного роста и образования пенициллина, вычисленные с помощью математической модели. [Воспроизведено с разрешения из статьи: Constantinides А., Spencer J. L., Gaden E. L., Jr., Optimization of Batch Fermentation Processes. II. Optimum Temperature Profiles for Batch Penicillin Fermentations; Biotech. Bioeng., 12, 1081 (1970).]
В цитированных выше работах осуществлена оптимизация и других моделей, основанных на различных базах данных. Таким путем программирование температурного режима ферментации позволило повысить выход пенициллина примерно на 15%- Найденные расчетными методами программы изменения температуры могут быть внедрены в крупномасштабное производство с очень малыми затратами. Очевидно, что сочетание методов математического моделирования и теории оптимизации окажется плодотворным и при разработке других процессов биохимической технологии.