Экстракция

 

Для экстракции необходимо наличие двух жидких фаз. При выделении антибиотиков применяют в основном экстракцию органическими растворителями из водной фазы, а для выделения белков недавно были предложены новые двухфазные водно-водные системы.

11.2.1.1. Экстракция органическими растворителями. Многие антибиотики хорошо растворяются в органических растворителях, практически не смешивающихся с водой. Многостадийная экстракция — сначала из водной фазы в органическую, затем из органической фазы и т. д. — обеспечивает как концентрирование, так и очистку выделяемых веществ.

В 1 л обычного пенициллинового бульона содержится 20—35 г антибиотика. После отделения биомассы мицелия фильтрованием фильтрат охлаждают до температуры не выше 4°C и затем иногда повторно фильтруют через полимерный фильтрующий слой. Величина pK_a пенициллинов лежит в диапазоне 2,5—3,1. Поэтому подкисление бульона до рН 2,0—3,0 приводит к протонированию (нейтрализации) пенициллинов, после чего их можно экстрагировать органическими растворителями. Противоточное распределение в системе бульон—амилацетат (или бутилацетат) (10 : 1) позволяет перевести в органическую фазу практически весь пенициллин. Для того чтобы повысить концентрацию пенициллина, проводят еще одну экстракцию водным раствором фосфатного буфера (рН 5—7,5). Антибиотик выделяют в виде натриевой соли осаждением из водно-бутанольной смеси.

Непрерывную экстракцию осуществляют в противоточном аппарате непрерывного действия — центробежном экстракторе Подбильняка (рис. 11.9). Органическая (легкая) и водная (тяжелая) фазы поступают в аппарат и выводятся из него через вращающийся вал.

 

РИС. 11.9. В центробежном экстракторе Подбильняка две жидкие фазы поступают через вращающийся вал вблизи средней линии вала. Более легкая (органическая) фаза выводится первой. Быстрое вращение обеспечивает движение двух фаз в противоположных направлениях при постоянном межфазном контакте. [Из работы: Todd W. J., Podbielniak D. В., Centrifugal Extraction, Chem. Eng. Progress, 61 (5), 69 (1965).]

Быстрое вращение создает центробежное ускорение, благодаря которому две жидкие фазы движутся в противоположных направлениях.

РИС. 11.10. Распределение пенициллинов и других содержащихся в культуральной жидкости веществ между органической и водной фазами. [Из работы: Queener S., Swartz R., Secondary Products of Metabolism, in Economic Microbiology, vol. 3, Rose A. H. (ed.), Academic Press, London, 1979.]

 

Аналогично экстракцией из водной фазы органическим растворителем и повторным переведением в водную фазу выделяют и очищают другие практически важные антибиотики. Так, эритромицин выделяют экстракцией амилацетатом, а полипептидный антибиотик бацитрацин непосредственно из бульона экстрагируют бутанолом, затем переводят в водный буферный раствор, концентрируют упариванием и высушивают. Еще раз отметим, что необходимость конкретных операций разделения определяется сферой применения продукта; так, бацитрацин, выпускаемый в качестве добавки к кормам для домашних животных, получают простым упариванием культурального бульона (без отделения биомассы) и последующей сушкой полученного осадка.

Не все антибиотики выделяют и очищают экстракцией. Так, например, стрептомицин выделяют из культуральной жидкости методом ионного обмена (см. разд. 11.2.2, 11.4 и 11.7.2).

На стадии первой экстракции культуральную жидкость обычно подкисляют, чтобы перевести антибиотик в неионизированную форму, в которой он легко переходит в органическую фазу. В то же время выбор соответствующего диапазона рН может обеспечить не только экстракцию данного антибиотика, но и его отделение от других экстрагируемых (при других значениях рН) веществ. Как показано на рис. 11.10 при рН ниже 2,0 обеспечивается максимальная селективность экстракции пенициллина по сравнению с другими (менее кислыми) веществами с более высокими pK_a. С другой стороны, увеличение скорости гидролиза пенициллинов, сопровождающее повышение кислотности среды, является причиной того, что на практике выгоднее применять экстракцию при рН>2,0. Другое решение этой дилеммы — проводить экстракцию в экстракторе Подбильняка, что позволяет свести к минимуму продолжительность экстракции, а следовательно, и степень гидролиза антибиотика.

Предлагалось проводить экстракцию непосредственно из культур ал ьной жидкости и при выделении других сложных органических соединений. Соответствующие примеры мы рассмотрим позднее в разделе, посвященном изучению методов переработки цельного бульона (разд. 11.7.2).

11.2.1.2. Экстракция в двухфазных водных системах. Потребность в экстрагентах и методах экстракции, которые не повреждают лабильных ферментов и других белков, легко переносятся на крупномасштабные операции и позволяют выделять целые органоиды и другие надмолекулярные структуры, вызвала необходимость в изучении и разработке систем жидкостной экстракции, где каждая фаза является в основном водной. Две водные фазы образуются при растворении двух несовместимых полимеров, например полиэтиленгликоля (ПЭГ) и декстрана (рис. 11.11,а). Образующиеся фазы содержат более 75% воды, а также большие количества декстрана или ПЭГ; на рис. 11.11, а показано, что ПЭГ-содержащая фаза может быть практически свободной от декстрана. Предлагались и другие аналогичные системы, в том числе ПЭГ — фосфат калия (рис. 11.11,6), декстран — фикол — ПЭГ, поливиниловый спирт — декстран, декстран — метил целлюлоза; к настоящему времени лучше других изучены системы, изображенные на рис. 11.11.

В системе ПЭГ — декстран коэффициенты распределения [К=е (ПЭГ-фаза)/е (декстрановая фаза)] восьми ферментов лежат в диапазоне от 1,0 до 3,7. Для увеличения коэффициента распределения предлагалось применять производные полимеров (чтобы вызвать ионный обмен в растворе), растворимые низкоспецифичные аффинные адсорбенты (см. следующий раздел) или добавлять соли. В системе ПЭГ — сульфат аммония добавление сульфата аммония или фосфата калия до концентрации 12% или 0,3 М соответственно приводит к повышению коэффициента распределения пуллуланазы в 10 раз (см. работу [16]).

Полимерсодержащие фазы можно разделять декантацией (умеренная продолжительность отстаивания; рис. 11.12, а) или кратковременным центрифугированием (рис. 11.12,6). Затем выделяют (напрймер, ультрафильтрацией) необходимый продукт, одновременно регенерируя полимер (ПЭГ). Поскольку все операции смешения и разделения легко и быстро выполняются при комнатной температуре, то дополнительные затраты, связанные со стоимостью полимера (расходуемого как в первоначальной загрузке, так и на возмещение частичных потерь в ходе экстракции), невелики по сравнению с затратами на охлаждение в более продолжительных методах выделения белков обычной экстракцией или осаждением. Стоимость декстрана, даже неочищенного, вносит основной вклад в стоимость всей системы, поэтому регенерация декстрана с экономической точки зрения обязательна. В табл. 11.4 перечислены ферменты, выделенные из культур микроорганизмов методом экстракции в двухфазных водных системах.

 

РИС. 11.11. а — фазовая диаграмма системы декстран — полиэтиленгликоль (D48 — ПЭГ 6000) при 20°C (кружочки) и при 0°C (крестики), б — фазовая диаграмма и фазовый состав системы фосфат калия — ПЭГ 6000 при 0°С. (Воспроизведено с разрешения из работы: Albertsson Р.-А., Partition of Cell Particles and Macromolecules, 2d ed., p. 41, Wiley-Interscience, New York, 1971.)

РИС. 11.12. a — зависимость относительного объема осаждающейся (под действием силы тяжести) фазы от времени при разделении фаз в двух системах полиэтиленгликоль - солевой раствор, применявшихся для очистки FDH. Разделение фаз осуществляли в стеклянном резервуаре емкостью 150 л. Крестиками обозначены данные, относящиеся к системе, содержащей 6% ПЭГ 1550, 9% ПЭГ 400, 15% фосфата калия в 2,5 М KCl, рН 7,8; диспергирована верхняя фаза, коэффициент распределения 2,67. Кружочками обозначены данные в системе, содержащей 12% ПЭГ 4000, 7% фосфата калия, рН 7,8; диспергирована нижняя фаза, коэффициент распределения 2,5.

б — пропускная способность центробежного экстрактора типа Лаваль LAPX-202, Изображены кривые зависимости логарифма отношения концентраций в диспергированной фазе после разделения (с) и в исходной смеси (c₀) от логарифма производительности аппарата Q, л/мин. Исходная система содержит 14% ПЭГ 4000, 11% фосфата калия, 0,1% голубого декстранового (индикатор). Скорость вращения центробежного экстрактора 700 (крестики) и 9300 (кружочки) оборотов в минуту. [Воспроизведено с разрешения из работы; Киіа М. R., Kroner К. Н., Hustedt Я., Purification of Enzymes by Liquid-Liquid Extraction, in Adv. Biochem. Eng., Fiechter A. (ed.), voi. 24, p. 105, Springer-Verlag, Berlin, 1982.]