Осаждение
Растворимость органических веществ зависит от температуры, рН, состава, иоииой силы и диэлектрической проницаемости растворителя. Осаждение можно индуцировать различными способами;
1. Добавлением осадителя, реагирующего с растворенным веществом и образующего с ним нерастворимое соединение, чаще всего соль. В качестве примера можно привести следующие операции выделения антибиотиков:
Биополимеры также можно выделить в виде солей. Так, например, ксантан представляет собой полианион и при добавлении ионов двухвалентных металлов (например, кальция) осаждается в виде геля. Альгинаты можно выделять из биомассы водорослей путем отделения (фильтрованием) биомассы с последующим осаждением биополимера хлоридом кальция. Вспомните, что именно такой способ создания альгинатных гелей применяется обычно для иммобилизации клеток (гл. 9).
2. Индуцированное растворителем осаждение применяется
в операциях выделения микробных полисахаридов, в том числе декстрана и ксантана. Эти биополимеры обычно образуются в аэробных процессах, и получающаяся культуральная жидкость, как правило, имеет очень высокую вязкость. При производстве ксантана клетки Xanthamonas погибают в процессе стерилизации бульона. После добавления хлорида калия (для уменьшения количества используемого затем растворителя) полисахарид осаждают путем разведения бульона метанолом или изопропанолом. Осадок, содержащий биополимер и отмершие клетки, обезвоживают, промывают и сушат.
Таблица 11.5. Изоэлектрические точки ряда ферментов и других белкова
Декстран выделяют из бульона осаждением спиртом или ацетоном. В производстве сравнительно недорогих неочищенных полисахаридов после осаждения растворитель должен быть регенерирован и использован повторно; при производстве полисахаридов для нужд пищевой или фармацевтической промышленности необходимо обеспечить достаточно полное удаление растворителя.
3. Методы осаждения белков сводятся к таким изменениям условий, которые нарушают устойчивость исходной термодинамически стабильной однофазной системы (раствора белка) и тем самым приводят к осаждению белка. К числу методов снижения растворимости белков относятся;
а) добавление концентрированных растворов солей (так называемое «высаливание»);
б) изменение рН до величины, соответствующей изоэлектрической точке (т. е. результирующему нулевому заряду белковой молекулы; см. табл. 11.5), в которой белок имеет наименьшую растворимость;
в) снижение диэлектрической проницаемости среды, например, путем добавления смешивающегося с водой органического растворителя; таким путем достигается усиление электростатических взаимодействий;
г) добавление неионных полимеров, снижающих степень сольватации белка;
д) добавление полиэлектролитов, действующих, по-видимому, как флокулирующие агенты;
е) добавление солей многозарядных ионов металлов, обратимо осаждающих белки.
При выборе конкретного метода осаждения необходимо учитывать не только требуемую степень обогащения и затраты на осаждение, но и требуемую степень чистоты белка.
Понятно, что растворимость белков зависит от рН раствора и обычно минимальна в изоэлектрической точке. Поскольку при pI результирующий заряд молекулы белка равен нулю, а при иных значениях рН молекулы белка имеют тот или иной заряд, то силы электростатического отталкивания между молекулами растворенного вещества минимальны при pI. Такой механизм предполагает возможность разделения белков с различными изоэлектрическими точками путем фракционированного осаждения-, при данном рН будут осаждаться белки, pI которых наиболее близко этому рН (если другие характеристики белков, например молекулярная масса, близки). Путем изменения рН сложную смесь белков разделяют на фракции, содержащие различные белки.
В то же время при слишком высоких или слишком низких значениях рН многие белки могут денатурироваться. По этой причине чаще применяют другой метод осаждения, называемый высаливанием. На растворимость белков заметно влияет концентрация солей в растворе. Еще в 1889 г. Гофмейстер отметил, что наиболее эффективно белки осаждаются в присутствии солей с многозарядными анионами или катионами. Ряды ионов Гофмейстера (или лиотропные ряды), в которых ионы расположены примерно в порядке уменьшения высаливающей способности, выглядят следующим образом:
Анионы: цитрат3-, тартрат2-, F-, IO2-, H2PO4-, ацетат-, BrO3-, Cl-, ClO3-, Br-, NO3-, ClO4-, I-, CNS-
Катионы: Th4+, Al3+, Н+, Ba2+, Sr2+, Ca2+, Mg2+, Cs+, Rb+, NH4+, К+, Na+, Li+
Для осаждения белков чаще всего применяют хорошо растворимый в водных средах сульфат аммония, хотя ряды Гофмейстера показывают, что для этих же целей можно использовать и многие другие соли.
Важнейшей переменной, определяющей эффективность высаливания белков, является ионная сила раствора μis:
(11.6)
где ci и Zi—концентрация и заряд соответственно i-го иона, а n — общее число имеющихся в растворе ионов. Считается, что добавление солей снижает концентрацию воды, которая может гидратировать ионизированные или поляризуемые группировки белка, тем самым уменьшая его растворимость. Как показывают данные, представленные на рис. 11.13, растворимость белка при высокой ионной силе раствора часто можно выразить уравнением
(11.7)
где xs — так называемая постоянная высаливания.
Белки, денатурирующие при нагревании быстрее других присутствующих в смеси белков, можно выделять из раствора тепловой обработкой.
РИС. 11.13. Зависимость растворимости белка от ионной силы растворов сульфата аммония. (Из работы: Cohn Е., Edsall J. Т., Proteins, Amino Acids, and Peptides, p. 602, Academic Press, New York, 1943.)
После денатурации растворимость белка
снижается и он осаждается (вспомните модель масляной капли; разворачивание молекулы глобулярного белка приводит к контакту его гидрофобных групп с водной фазой). Этот метод с успехом применяли, например, для очистки термостабильного белка, полученного экспрессией соответствующего гена в мезофильной клетке-хозяине; термостабильный белок остается в растворе, а сопутствующие белки клетки-хозяина селективно осаждаются. При другом методе осаждения в качестве осадителя применяют казеин, диатомовую землю (состоящую из пористых скелетов диатомовых водорослей) или желатин; белки осаждаются из раствора, адсорбируясь на сравнительно крупных частицах этих агентов.
Как показано в примере 11.1, при выделении белков часто сочетают несколько методов осаждения. Выделение дегидрогеназы начинают с экстракции фермента буферным раствором. За этим следует умеренное нагревание для осаждения белков и других компонентов смеси, легче подвергающихся денатурации, чем выделяемая дегидрогеназа. Большую часть фермента (а также другие вещества с близкой растворимостью) осаждают ацетоном; при этом отделяются многие низкомолекулярные соединения, экстрагирующиеся вместе с белком. Последующее растворение и повторное осаждение сульфатом аммония приводят к получению препарата с большей удельной ферментативной активностью. Такой способ очистки, однако, сопровождается потерей некоторого количества фермента на каждой операции (см. таблицу в примере 11.1).
Дальнейшую очистку для отделения дегидрогеназы от других белков с близкой растворимостью выполняют путем последовательного суспендирования осадка, полученного на стадии 8 (пример 11.1), во все менее и менее концентрированных растворах сульфата аммония. Поскольку растворимость белков возрастает при снижении концентрации соли до величин, значительно уступающих концентрации насыщенного раствора, то таким путем удается очистить фермент от все более и более близких белков. Полученная в результате ряда таких операций супернатантная жидкость имеет удельную активность (ферментативную активность отнесенную к общему количеству растворенных белков), которая примерно в 100 раз превышает удельную активность исходного продукта экстракции буферным раствором. Кроме того, в этих операциях отделяется большая часть примесей небелковой природы.
Пример 11.1. Последовательность операций при выделении ферментов из биомассы (алкогольдегидрогеназы из сухих пекарских дрожжей)*.
* Из работы: Chaykin S., Biochemistry Laboratory Techniques, pp. 22—32, John Wiley and Sons. Inc., New York, 1966.
1. Измельчить дрожжи в шаровой мельнице.
2. Смешать 100 г мелкоизмельченных сухих дрожжей со 100 мл 0,066 М динатрийфосфатного буфера, содержащего 0,001 М этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA).
3. Добавить 200 мл буферного раствора, перемешивать 2 ч при 37 °C и оставить на 3 ч при комнатной температуре.
4. Отделить дрожжевую биомассу центрифугированием (28000 g, 20 мин) (определить ферментативную активность).
5. Отделить термически неустойчивые белки нагреванием при —55°C в течение 15 мин (алкогольдегидрогеназа относительно устойчива) (определить ферментативную активность).
6. К прошедшему тепловую обработку раствору добавить ацетон из расчета 50 мл ацетона на 100 мл раствора (смешивание производить при температуре от —2 до —4°C), осадок отбросить. Добавить еще 55 мл ацетона, центрифугировать при 28000 g и супернатант отбросить (определить ферментативную активность).
7. Осадок суспендировать повторно в 50 мл 10-3 М фосфатного буфера (рН 7,5), содержащего 10-3 М EDTA, дважды диализовать против 3 л свежего фосфатного буфера в течение 1 ч.
8. При 0 °C постепенно добавить сульфат аммония (36 г на 100 мл диализованного раствора) и центрифугировать при этой же температуре (определить ферментативную активность).
9. Полученный на предыдущей стадии осадок суспендировать в 30 мл разбавленного вдвое насыщенного раствора (NH4)2SO4. Осадок отделить от супернатанта и провести повторное осаждение последовательно растворами сульфата аммония, концентрация которых составляет 45, 40, 35 и 25% от насыщенного раствора (определить ферментативную активность).
10. Объединить высокоактивные супернатанты и добавить насыщенный раствор сульфата аммония до помутнения. Оставить на несколько суток при 0 °C для кристаллизации. Растворить осадок и перекристаллизовать из 10 мл 10-3 М EDTA (определить ферментативную активность).
Получены следующие результаты выделения:
