Производство белков с помощью рекомбинантных ДНК

 

Технология рекомбинантных ДНК в организмах Е. coli позволила разработать методы промышленного производства инсулина (1979 г.), гормона роста (1981 г.) и лейкоцитарного интерферона (1981 г.) человека в количествах, достаточных для их широкого применения в медицинской практике. В 1984 г. В продажу поступили инсулин человека и вакцина против вызываемого Е. coli поноса у новорожденных поросят; технология получения многих других продуктов находится на различных стадиях разработки и промышленного внедрения. Экономическая оценка этих разнообразных продуктов должна учитывать:

1. Стоимость исследовательских и проектных работ, предшествовавших внедрению промышленного процесса. Получение веществ с помощью рекомбинантных ДНК является принципиально новым методом биохимической технологии, и стоимость таких продуктов должна окупать значительные расходы на предшествующие промышленному производству исследования, в том числе на лабораторное оборудование, содержание персонала и создание опытных установок.

2. Стоимость обычных операций биореакции и выделения продукта в крупномасштабном производственном процессе.

3. Расходы на клинические и другие испытания, требуемые Управлением по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств. Министерством сельского хозяйства США и другими правительственными организациями.

 

Биореакция при использовании рекомбинантных ДНК представляет собой обычный микробиологический процесс, хотя здесь может возникнуть ряд специфических проблем, связанных с предотвращением заражения культуры и стабильностью рекомбинантных плазмид (гл. 6). В основу технологии рекомбинантных ДНК положен принцип вектор—организм-хозяин. В настоящее время в промышленном производстве применяется (или считается перспективным) очень ограниченное число организмов-хозяев ( Е. coli, Saccharomyces cerevisiae, несколько линий животных клеток, возможно также Bacillus subtilis и некоторые штаммы Pseudomonas). Конструкцию применяемого биореактора и схему процесса выделения определяет в основном природа организма-хозяина. Для бактерии Е. coli, например, характерна простая генетика, отсутствие проблем при идентификации и высокая скорость роста. В то же время в тех случаях, когда организмом-хозяином является Е. coli, при проведении биореакций и операций выделения возникают следующие затруднения:

1. Е. coli содержит, по меньшей мере, восемь растворимых протеаз, которые, возможно, принимают участие в гидролизе экспрессированных белков соматостатина и гормона роста человека. Частично протеазы можно блокировать в ходе выделения продукта с помощью соответствующего ингибитора фенилметилсульфонилфторида, эффективного в отношении сериновых протеаз, но не действующего на металлоферменты. Снижение концентрации ионов железа понижает протеолитическую активность металлоферментов, но одновременно индуцирует связывающие металл агенты, которые могут затруднять очистку продукта.

2. Содержащиеся в оболочке клетки липополисахариды являются очень мощными пирогенами, вызывающими лихорадку даже в дозах 0,5 нг/кг (0,5 трлн^-1). В более старом процессе получения L-аспарагиназы с помощью Е. coli продукт, как оказалось, был загрязнен такими пирогенами.

 

Последовательность операций выделения первых промышленных продуктов, полученных методами технологии рекомбинантных ДНК, была приведена на рис. 11.39. Поскольку большие количества экспрессируемых в Е. coli белков накапливаются в виде особых изолированных образований, в которых белки находятся в частично денатурированном состоянии, то при их выделении приходится вводить дополнительные операции солюбилизации и обработки, способствующей созданию нативных вторичной и третичной структур.