Партатаминотрансферазы) в сыворотке крови по Райтману и Френкелю

 

Принцип метода. В результате переаминирования, происходящего под действием АСТ, образуется щавелевоуксусная кислота. Щавелевоуксусная кислота спонтанно декарбоксилируется в пировиноградную. При добавлении 2,4-динитрофенилгидразина в щелочной среде образуется гидразон пирови-ноградной кислоты красно-коричневого цвета, интенсивность окраски кото-рого определяется колориметрически (см. уравнения).

a-кетоглутарат глутамат    
NH2 O АсАТ O O  
HO        
HO          
     
  C OH  
C OH  
     
O   O    
  Оксалоацетат  
Аспартат    
       

 

 


      O O   CO2   O    
                   
                               
    HO                     HO   C    
                     
    C     OH      
          C CH3    
    O                  
                  O      
    Оксалоацетат                
            Пируват    
                     
                      H NO2  
                         
        H NO2     N    
HO O           N          
                     
    N                        
C C + H2N         HO C            
                       
            NO2  
                     
                           
                  C   CH3  
O CH3                      
                             
      NO2 O        
                   
                  2,4-ДНФ-гидразон  
Пируват   2,4-динитрофенилгидразин пировиноградной кислоты  
       

 

Ход работы. Пробирку с 0,25 мл субстратно-буферной смеси нагревают в термостате при 37°C в течение 5 мин, добавляют 0,05 мл сыворотки крови и инкубируют 60 мин в термостате при этой же температуре.

 

Добавляют 0,25 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина и выдерживают в течение 20 мин при комнатной температуре. Затем добавляют еще 2,5 мл NaOH, перемешивают и оставляют еще на 10 мин при комнатной температуре.

 

Измеряют на фотометре экстинкцию опытной пробы при длине волны 500–560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10 мм. В каче-стве контрольной пробы используется дистиллированная вода.

 

Расчет. Производят по калибровочному графику.

 

Норма. АСТ – 0,1–0,45 ммоль/ч.л (пирувата на 1 л сыворотки крови за 1 час инкубации при 37°С).

 

Клинико-диагностическое значение. Определение активности АЛТ и АСТ широко используется в ранней дифференциальной диагностике различных заболеваний. Оба фермента высокоактивны в различных тканях. Однако наи-большая активность АЛТ приходится на печень, а АСТ – на миокард. В связи с высокой информативностью определение активности АЛТ используется для ранней диагностики болезни Боткина (до появления желтухи и первых симптомов болезни – недомогания, слабости и т. д.), а также ее безжелтуш-ных форм. Высокая активность фермента в крови поддерживается первые 10–15 дней, а затем постепенно снижается. Степень увеличения активности АЛТ коррелирует с тяжестью болезни.

 

АСТ более специфична для миокарда, поэтому используется для ранней дифференциальной диагностики инфаркта миокарда. Причем увеличение ак-тивности отмечается через 24–36 часов и снижается на 3–7-е сутки.

 

Выводы. Записать полученный результат и дать его клинико-диагностическую оценку.

 

_________________________________________________________________

 

_________________________________________________________________

 


_________________________________________________________________

 

Л а б о р а т о р н а я р а б о т а № 2 . Определение активности АЛТ (ала-