Принцип метода. Основан на сопряжении двух ферментативных реакций (АЛТ и ЛДГ) – трансаминирования и последующего NADH-зависимого вос-становлении пирувата, образующегося в процессе трансаминирования.
I этап:
АЛТ
L-ала + a-кетоглутарат ¬¾® пируват + L-глу;
II этап:
ЛДГ
пируват + NADH+H+ ¬¾¾¾¾® L-лактат + NAD+.
Ход реакции регистрируют по убыли восстановленной формы кофермента – NADH+Н+, имеющего максимум поглощения при 340 нм.
Ход работы. Активность АЛТ в сыворотке крови определяют в 2 этапа.
I этап. В пробирку вносят 1 мл раствора № 1 (смесь ЛДГ, NADH+Н+ бу-фер-субстрата, пиридоксаль-фосфата) и 0,1 мл сыворотки крови, перемеши-вают и термостатируют 5 мин при 37 °C.
II этап. Содержимое пробирки переливают в кювету, предварительно на-гретую до 37 °C, и добавляют 0,1 мл раствора № 2 (a-кетоглутарат).
Измеряют оптическую плотность при длине волны 340 нм, ширине кюветы 10 мм, в интервале 3 мин.
Расчет. Вычисляют изменение экстинкции за 1 мин (DА/Dt) в мккат/л, а также каталитическую концентрацию (активность АЛТ) по формуле
С = DA/Dt ´ 31,75.
Норма. Активность АЛТ сыворотки крови равна 0,15–0,96 мккат/л. Выводы. Записать полученный результат и дать его клинико-диагности-
ческую оценку.
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________