Морфологические типы бактерий, в сравнении с высшими организмами, немногочисленны. Клетки большинства бактерий имеют сферическую, цилиндрическую или извитую форму, но существует небольшая группа мицелийобразующих форм, нитчатых бактерий и бактерий, образующих выросты. В соответствии с этим все бактерии по форме разделяются на следующие группы.
Кокки (сферические) клетки могут быть одиночными (микрококки), парными (диплококки, например, нейссерия); тетракокки, располагающиеся по 4 в форме квадратов; пакетообразные кокки, располагающиеся «этажами» (сарцины); располагающиеся цепочками (стрептококки); образующие бесформенные скопления в виде виноградных гроздьев (стафилококки). Диаметр клеток – 1 – 2 мкм.
Палочковидные бактерии – наиболее многочисленная группа, клетки представляют собой цилиндрические структуры. Размеры таких клеток сильно варьируют и могут быть от сотых долей до 5 – 10 мкм. Такие бактерии часто образуют пары или цепочки клеток (например, палочка сибирской язвы), но могут быть и одиночными (например, энтеробактерии).
Извитые бактерии могут быть трех типов: вибрионы, спириллы и спирохеты. Вибрионы – бактерии, изогнутые в виде запятой (холерный вибрион, кампилобактер); спириллы имеют несколько крупных завитков (возбудитель возвратного сыпного тифа); спирохеты имеют вид тонких спиралевидных клеток со множеством завитков и петель (возбудитель сифилиса).
Нитчатые бактерии – это цепочки (трихомы) из цилиндрических, овальных или дисковидных клеток. Типичными представителями данных бактерий являются бактерии, окисляющие серу (Beggiatoa, Thiotrix).
К мицелийобразующим бактериям относятся истинные актиномицеты, которые имеют сильно разветвленный мицелий. У нокардий и микобактерий мицелий является временным и возникает на определенных стадиях роста. У коринеподобных бактерий клетки имеют только тенденцию к ветвлению, но при росте культуры наблюдается плейоморфизм клеток.
К бактериям, образующим выросты, относятся почкующиеся и стебельковые бактерии. Выросты – это выпячивания клеточного содержимого, окруженного клеточной стенкой и цитоплазматической мембраной и не отделенные от клетки перегородкой. У некоторых бактерий выросты служат для размножения, у других – для прикрепления к субстрату или друг к другу.
Кроме выше перечисленных, известны бактерии, которые не имеют клеточной стенки – микоплазмы. В культуре одного вида можно одновременно обнаружить сферические, эллипсовидные, грушевидные, дисковидные и даже разветвленные и неразветвленные нитчатые формы.
Архебактерии представляют собой группу бактерий с клеточной стенкой уникальной структуры, содержащей специфические химические соединения. Морфологически могут быть неправильной формы, сферическими, палочковидными.
В микробиологической практике для изучения морфологии бактерий используют неокрашенные препараты (нативный материал) или окрашенные препараты (мазки), приготовленные из естественный образцов либо из колоний выросших микроорганизмов.
Нативные препараты готовят для исследования живых неокрашенных бактерий. Наиболее распространенными являются методы «висячей капли», «раздавленной капли», микрокамеры с плотными средами. Для прижизненного изучения бактерий часто используют фазово-контрастную и темнопольную микроскопию.
Препарат «раздавленная капля» готовят на предметном стекле, на которое наносят каплю воды. В нее стерильной бактериологической петлей вносят небольшое количество исследуемой культуры, эмульгируют и накрывают покровным стеклом. Избыток жидкости удаляют фильтровальной бумагой. Если исследуют бульонные культуры, то на предметное стекло наносят непосредственно ее каплю.
Препарат микроскопируют с использованием иммерсионной системы (увеличение х40 или х90).
Препарат «висячая капля» используют при продолжительном наблюдении за ростом и развитием микроорганизмов. Небольшая капля бульонной культуры микроорганизмов помещается с помощью бактериологической петли на стерильное покровное стекло. Стекло переворачивают каплей вниз и накладывают на лунку специального предметного стекла. Капля должна свободно висеть в лунке, не затрагивая ее краев и дна. Для создания влажной камеры и предохранения от высушивания, края лунки смазывают вазелином. Микроскопируют также как и препарат «раздавленная капля».
Микрокамеры с плотными средами готовят на стерильных предметных стеклах с тонким слоем питательного агара. С помощью пастеровской пипетки наносят бактерии. Обрезают агар вокруг выбранной области, кладут сверху покровное стекло. Для предотвращения высыхания такие препараты либо инкубируют в закрытой камере, либо герметизируют щели между стеклами путем заливки парафином или воском.
Окрашенные препараты бактерий готовят в следующей последовательности. Приготовление мазка: на чистое и обезжиренное предметное стекло наносят культуру исследуемого микроорганизма, тщательно размешивают и распределяют полученную суспензию по поверхности стекла. Для приготовления отпечатка вырезают блок агара и помещают на покровное стекло бактериями вниз и резко прижимают блок к стеклу, после этого препарат сразу же фиксируют.
Высушивание мазка проводят при комнатной температуре.
Фиксация мазка чаще всего осуществляется термически (фламбирование), т. е. над пламенем горелки. Хотя данный метод фиксации и является достаточно грубым, но сохраняет морфологию и отношение бактерий к красителям. Препарат проносят 2 – 4 раза над пламенем спиртовки мазком вверх (стекло должно нагреться до такой степени, чтобы при прикосновении к тыльной стороне ладони вызывало легкое жжение). Фиксация мазка преследует следующие цели: а) инактивировать микроорганизмы; б) закрепить их на поверхности стекла и предотвратить их смывание при последующем окрашивании; в) повысить восприимчивость клеток к красителям.
Для более детального изучения структуры клеток используют фиксирующие растворы, предовращающие ферментативный автолиз бактерий и стабилизирующие макромолекулы путем химического их сшивания. Наиболее часто применяют формалин, спирты, жидкость Карнуа, ацетон и др. Мазки фиксируют, помещая в раствор фиксатора или нанося на мазок.
Окрашивание препаратов проводится с помощью красителей, которые можно разделить на:
• позитивные (метиленовый синий, фуксин) и негативные (нигрозин). Позитивными называются красители, окрашивающие микроорганизмы и другие находящиеся на стекле фиксированные объекты,
негативными – красители, заполняющие пространство, окружающее микроорганизмы, в результате чего последние становятся видимыми в виде силуэтов на фоне красителя;
• кислые (эозин, конго красный) и щелочные (гематоксилин, толуидиновый синий, азур). Кислые красители связываются с веществами, имеющими щелочную реакцию (например, цитоплазматическими белками), щелочные – связываются с базофильными (кислыми) компонентами клеток (нуклеиновыми кислотами, рибосомами).
Основные цвета окрашивания могут быть следующими: красный (основной фуксин, кислый фуксин, сафранин, конго красный); фиолетовый (генциановый фиолетовый, метиловый фиолетовый, кристаллический фиолетовый); синий (метиленовый синий, толуидиновый синий, водный синий); зеленый (малахитовый зеленый, бриллиантовый зеленый).
Способность клеток воспринимать различные красители отражает их тинкториальные свойства. Это определяется структурой и составом клеточной стенки.
Выделяют простые и сложные (дифференцирующие) методы окраски.
Простыми методами окрашивания называют окрашивание препаратов каким-либо одним красителем. Чаще всего при этом используется фуксин, генциановый фиолетовый, метиленовый синий. В случае использования негативных красителей среда, в которой находятся микроорганизмы, становится полупрозрачной; в результате клетки, в которые краситель не проникает, выглядят как светлые частицы на равномерно окрашенном фоне. Некоторые микроорганизмы, например спирохеты, плохо выявляемые с помощью позитивных красителей, легко выявляются при окрашивании негативными красителями.
Споры имеют вид преломляющих свет включений в вегетативной клетке.
Техника приготовления препарата заключается в следующем.
Фиксированный препарат помещают на параллельные стеклянные рейки, которые лежат над кюветой. На мазок наносят 1 % водный раствор фуксина или метиленового синего на 1 – 2 мин. Следят за тем, чтобы во время окрашивания раствор красителя не подсыхал. После завершения окрашивания препарат промывают водой до тех пор, пока стекающая воде не станет бесцветной. Затем препарат высушивают, промокая его фильтровальной бумагой, наносят на окрашенный сухой мазок каплю иммерсионного масла и микроскопируют с иммерсионной системой.
При сложных методах окрашивания на один и тот же препарат воздействуют несколькими красящими веществами, одно из которых называется основным, другие – дополнительными. Кроме красителей используются различные обесцвечивающие вещества: спирты, кислоты, ацетон и др. С помощью сложных методов окрашивания выявляют цитологические особенности клеток микроорганизмов (клеточные структуры, запасные вещества, включения и т. д.).
Окраска по методу Грама является самым универсальным из сложных методов окраски. Окраска положена в основу дифференциации бактерий и отражает способность клеток воспринимать и удерживать внутри клетки красящий комплекс генцианового фиолетового и йода либо терять его после обработки спиртом. Соответственно выделяют грамположительные (Bacillus, Clostridium, Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Sarcina, etc.) и грамотрицательные (Escherichia, Pseudomonas, Erwinia, Neisseria, Rickettsia, etc.) формы.
Техника: 1. Фиксированный мазок покрывают кусочком фильтровальной бумаги и на него наносят карболовый раствор генцианового фиолетового. Окрашивание проводят на протяжении 1 – 2 мин.
2. Бумажку снимают, краситель сливают и, не промывая препарат водой, обрабатывают его на протяжении 1 – 2 мин раствором Люголя до почернения.
3. Сливают раствор Люголя, окрашенный мазок обесцвечивают 96º этиловым спиртом (препарат несколько раз помещают в стакан со спиртом до прекращения отхождения фиолетовых струек). Обесцвечивание проводят не более 30 с.
4. Препарат промывают водой.
5. Мазок дополнительно окрашивают на протяжении 1 – 2 мин водным раствором фуксина.
6. Краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют с иммерсионной системой. Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, грамотрицательные – в розовый.
Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля-Нильсена отражает особенности некоторых микобактерий и нокардий. Эти бактерии не окрашиваются обычными методами, однако если при окрашивании используются фенол, детергенты или нагревание, то окрашенные клетки получить удается. В этом случае окраска клеток сохраняется даже при последующем обесцвечивании в смеси кислота-спирт. Кислотоустойчивость обусловлена большим содержанием в клетке сложных липидов, в частности, миколовых кислот.
Техника: 1. Фиксированный мазок покрывают кусочком фильтровальной бумаги и на него наносят карболовый раствор фуксина, приготовленный по Цилю.
2. Мазок с красителем 2 – 3 раза подогревают до появления паров, держа его в пламени спиртовки.
3. Препарату дают остыть, снимают фильтровальную бумагу, сливают краситель и промывают водой.
4. Окрашенный мазок обесцвечивают 5 % раствором серной кислоты (препарат помещают 2 – 3 раза в стаканчик с кислотой, не задерживая в ней).
5. Препарат промывают водой и докрашивают на протяжении 3 – 5 мин метиленовым синим по Леффлеру.
6. Краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют с иммерсионной системой. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет, некислотоустойчивые – в синий.
Задание
1. Провести окраску бактерий зубного налета с использованием простых методов.
2. Провести окраску бактерий по методу Грама.