О росте микроорганизмов в естественных субстратах или питательных средах судят по количеству клеток в единице объема. Данная величина носит название титра клеток (или фаговых частиц). Выбор метода для определения числа клеток зависит от цели исследования, свойств питательной среды или субстрата, а также особенностей роста и морфологии микроорганизмов. Существуют методы, позволяющие определять общее количество микроорганизмов в исследуемом материале или только количество жизнеспособных клеток. С другой стороны, методы подсчета могут быть разделены на методы прямого счета (микроскопические), методы подсчета колоний (методы высева) и методы оптические (нефелометрия, спектрофотометрия и т. д.).
Чтобы определить общее количество микроорганизмов в различных материалах, применяют методы прямого подсчета клеток под микроскопом (в специальных счетных камерах, в фиксированных мазках, на мембранных фильтрах). Такие методы широко применяются в исследованиях микрофлоры воды и почвы. Эффективность такого подсчета, как правило, в 10 – 10000 раз выше, чем при подсчете методом высева, так как многие микроорганизмы не растут на питательных средах и учесть их можно только под микроскопом. Метод дает возможность получить дополнительную информацию о размерах и морфологии изучаемого объекта. Кроме того, прямой подсчет микроорганизмов производится быстрее, более дешев, оборудование для его осуществления имеется в каждой лаборатории.
1. Подсчет клеток в окрашенных препаратах (метод Виноградского–Брида)
Преимущество метода заключается в том, что фиксированные окрашенные препараты хорошо сохраняются и подсчет можно проводить в удобное для исследователя время.
Техника: а) на хорошо обезжиренном предметном стекле маркером рисуют прямоугольник строго известной площади (2, 4 или 6 см²),
б) на стекло в прямоугольник микропипеткой (или автоматической пипеткой) наносят определенный объем суспензии клеток (0,01; 0,02 или 0,03 мл),
в) суспензию равномерно распределяют петлей по всей площади прямоугольника,
г) препарат высушивают на воздухе и фиксируют 15 мин 96 % этанолом,
д) проводят окрашивание фуксином Циля 1 – 2 мин,
е) краситель сливают, препарат промывают водой, последовательно погружая стекло в 5 – 6 стаканов с водой) и высушивают на воздухе.
Количество клеток микроорганизмов подсчитывают, используя иммерсионный объектив, в квадратах окулярной сетки, которую помещают в окуляр между собирательной и глазной линзами. При отсутствии сетки подсчитывают число клеток в поле зрения микроскопа.
Площадь квадрата сетки или поля зрения определяют с помощью объект микрометра. Последний помещают на столик микроскопа вместо препарата и при том же увеличении, при котором проводили подсчет, определяют длину стороны квадрата окулярной сетки или диаметр поля зрения.
Для получения достоверных результатов клетки микроорганизмов рекомендуется подсчитывать не менее чем в 50 – 100 полях зрения, а общее количество подсчитанных клеток не должно быть менее 600.
Количество клеток микроорганизмов, содержащихся в 1 мл исследуемого материала, вычисляют по формуле:
A x S
M = x n,
V x s
где М – количество клеток в 1 мл;
А – среднее число клеток в квадрате окулярной сетки (поле зрения);
s и S – площадь квадрата окулярной сетки (поля зрения) и приготовленного мазка в мкм² соответственно;
V – объем нанесенной на стекло суспензии в мл;
n– разведение исследуемого материала.