Этот метод используют для подсчета количества микроорганизмов в жидких материалах с низкой плотностью клеток. Метод основан на концентрировании клеток на поверхности фильтра в результате фильтрации определенного объема исследуемой пробы с последующим их окрашиванием и подсчетом в микроскопе. Для фильтрации выбирают фильтр с диаметром пор, позволяющим задерживать клетки, находящиеся в исследуемом материале.
С помощью мембранного фильтрования могут быть подсчитаны как жизнеспособные клетки микроорганизмов, так и определено общее количество клеток. Начальным этапом данной работы является приготовление фильтров, прибора для фильтрования и собственно фильтрования.
Техника: 1. Собирают прибор для фильтрования под вакуумом. Для этого основание стерильного фильтродержателя вставляют в стерильную колбу Бунзена, с помощью стерильного пинцета (пинцет окунают в спирт и обжигают) помещают в фильтродержатель стерильный фильтр (стерилизуют кипячением) и закрепляют зажимом. Отводной конец колбы Бунзена соединяют с вакуумным насосом.
2. Строго определенный объем исследуемого материала пропускают через мембранный фильтр, создавая с помощью насоса вакуум.
3. Фильтр, с осевшими клетками микроорганизмов, снимают стерильным пинцетом и исследую в зависимости от целей эксперимента.
При подсчете общего количества клеток микроорганизмов проводят окрашивание фильтра 5 % раствором эритрозина в 5 % растворе фенола. Для этого фильтр помещают нижней стороной в чашку Петри на фильтровальную бумагу, насыщенную красителем, чашку закрывают и оставляют на 30 – 60 мин. Фильтр отмывают от красителя, последовательно перенося его в чашки Петри с фильтровальной бумагой, насыщенной дистиллированной водой до тех пор, пока он не перестанет окрашивать влажную фильтровальную бумагу. Фильтр высушивают на воздухе и готовят препарат для микроскопирования следующим образом. На предметное стекло накапывают иммерсионное масло и помещают на него окрашенный мембранный фильтр таким образом, чтобы клетки микроорганизмов были сверху. На поверхность фильтра наносят еще каплю иммерсионного масла и покрывают фильтр покровным стеклом.
Количество клеток микроорганизмов подсчитывают, используя иммерсионный объектив ×90 в квадратах окулярной сетки или в поле зрения микроскопа. Правила подсчета аналогичны тем, которых придерживаются для метода Виноградского–Брида. По следующей формуле определяют количество клеток в 1 мл исследуемого материала:
M = a x F x 106
V x s,
где М – количество клеток в 1 мл;
а – среднее число клеток в квадрате окулярной сетки (поле зрения);
s и F – площадь квадрата окулярной сетки (поля зрения) и мембранного фильтра в мм², соответственно;
V – объем профильтрованной суспензии в мл;
106– коэффициент перевода мм² в мкм².
При определении количества жизнеспособных клеток микроорганизмов с помощью мембранных фильтров исходят из того, что если фильтр с находящимися на его поверхности микроорганизмами поместить на агаризованную питательную среду, то питательные вещества, проникая через поры фильтра, обеспечивают возможность формирования колоний, различимых невооруженным глазом. Подсчитав колонии, выросшие на поверхности фильтра после соответствующего инкубирования, определяют количество жизнеспособных клеток микроорганизмов, которые были им задержаны. Этот метод аналогичен методу подсчета клеток на чашках, но является более чувствительным, поскольку через фильтр можно пропускать практически неограниченные объемы исследуемого материала. Во многих случаях из-за низкой плотности микроорганизмов, обычный подсчет на чашках невозможен.
После проведения фильтрования с соблюдением стерильности, мембранный фильтр снимают пинцетом и помещают на поверхность 1,5 % агаризованной среды в чашке Петри. Следят за тем, чтобы между фильтром и средой не образовывалось пузырьков воздуха. Чашку помещают в термостат и инкубируют при оптимальной температуре.
При подсчете колоний для увеличения контрастности мембранный фильтр с колониями окрашивают. Для этого поверхность фильтра, находящегося в чашке Петри, заливают 0,01 % водным раствором оксалата малахитового, который через 8 – 10 с сливают. При этом способе окрашивания колонии выглядят белыми или желтыми на фоне зеленого фильтра. Рассчитывают количество жизнеспособных клеток в 1 мл исследуемого материала.
Метод подсчета клеток на мембранных фильтрах с помощью люминесцентного микроскопа заключается в концентрировании бактерий из исследуемого материала на нелюминесцирующий мембранный фильтр, флюорохромировании акридиновым оранжевым и подсчете клеток в специальном (люминесцентном) микроскопе. Этот метод удобен тем, что позволяет непосредственно подсчитать как общее количество клеток, так и количество жизнеспособных клеток. При окрашивании акридиновыми красителями жизнеспособные клетки имеют зеленую, а нежизнесобные (мертвые) – красную окраску.
Мембранный фильтр с бактериями помещают в чашку Петри на фильтровальную бумагу, насыщенную 0,05 % раствором акридинового оранжевого на фосфатном буфере (рН 6,0). Окрашивание проводят 15 – 20 мин. Фильтр промывают, последовательно перенося в чашки Петри с фильтровальной бумагой, смоченной водой. После высушивания готовят препарат для микроскопирования: на предметное стекло наносят нелюминесцирующее вазелиновое масло и помещают на него фильтр так, чтобы бактерии были сверху. На поверхность фильтра наносят еще каплю масла и покрывают тонким покровным стеклом.
Препарат микроскопируют в люминесцентном микроскопе со светофильтрами СЗС-14, БС-8 или ФС-1. Подсчитывают живые и мертвые
клетки в 20 случайно выбранных полях зрения и по формуле подсчитывают количество клеток в 1 мл исследуемого материала, использовав формулу, приведенную в методике для подсчета клеток на мембранных фильтрах.