Этот метод широко применяется в микробиологических исследованиях, так как позволяет достаточно точно и сравнительно быстро определить количество клеток в культуральной среде. В основе метода лежит измерение количества света, рассеянного взвесью клеток. Микроорганизмы в большинстве случаев не окрашены и почти прозрачны, поэтому суспензии клеток в видимой области спектра поглощают свет незначительно. Уменьшение интенсивности света после его прохождения через взвесь клеток связано, главным образом, с его рассеиванием. В определенных пределах рассеивание света клетками пропорционально их численности. Следует помнить, что количество рассеянного света пропорционально отношению размера частицы к длине волны падающего света. Поэтому при постоянной длине волны падающего света, светорассеяние зависит от размеров клетки и будет тем большим, чем крупнее клетки и измерение светорассеяния целесообразно для тех культур микроорганизмов, развитие которых вызывает равномерное помутнение среды и не сопровождается заметным изменением формы и размеров клетки, образованием мицелия, пленок и других скоплений.
Величину светорассеяния измеряют с помощью нефелометров, спектрофотометров или фотоэлектроколориметров. В этих приборах измеряется первичный пучок света, который проходит через пробу и, не отклоняясь, падает на фотоэлемент. Обычно при этом сравнивается интенсивность света, проходящего через суспензию клеток и через среду без клеток. Для измерения светорассеяния выбирают светофильтр, обеспечивающий максимум пропускания света данной взвесью. Питательная среда для культивирования микроорганизмов, в которой предполагается определять количество клеток по рассеиванию, должна быть оптически прозрачной.
Количество клеток определяют по калибровочной кривой, отображающей зависимость между величиной светорассеяния и числом клеток в единице объема исследуемой взвеси. Для построения калибровочной кривой поступают следующим образом. Измеряют величин светорассеяния взвеси с различным содержанием клеток и в каждой из них одним из доступных способов подсчитывают количество клеток в единице объема. Полученную зависимость выражают графически, откладывая на осях: абсцисс – показания нефелометра, ординат – количество клеток, содержащихся в 1 мл. Калибровочные кривые индивидуальны для каждой культуры; для определенных условий выращивания культуры (состав среды, температура, аэрация и т. д.).
5. Определение количества жизнеспособных клеток путем высева на питательные среды (чашечный метод Коха)
Сущность метода подсчета количества клеток путем высева заключается в высеве определенного объема исследуемой суспензии микроорганизмов на агаризованную питательную среду в чашках Петри и подсчете формирующихся колоний, принимая во внимание, что каждая колония – потомство одной жизнеспособной клетки. Существует много вариантов метода.
При посеве на поверхность агара (метод Коха) проводят три этапа: приготовление разведений исследуемого материала, посев на агаризованную среду в чашках Петри и подсчет сформировавшихся колоний.
Для получения изолированных колоний необходимо приготовить ряд последовательных разведений, так как численность микробных популяций обычно достаточно велика. Разведения готовят в физиологическом растворе, используя шаг разведения 10-1. Для этого стерильный физиологический раствор разливают по 4,5 мл в стерильные пробирки, соблюдая правила асептики. Затем 0,5 мл исследуемого материала стерильной пипеткой вносят в пробирку с 4,5 мл физиологического раствора и считают это разведение первым (10-1). Содержимое пробирки тщательно перемешивают, новой пипеткой отбирают 0,5 мл суспензии и переносят во вторую пробирку, получая при этом второеразведение (10-2). Таким же образом готовят и последующие разведения. Степень разведения зависит от плотности исследуемой популяции микроорганизмов: чем она выше, тем больше разведений следует использовать.
При проведении посева на поверхность подсушенной агаризованной питательной среды в чашке Петри стерильной пипеткой наносят точно отмеренный объем (0,1 мл) соответствующего разведения взвеси микроорганизмов и распределяют стерильным шпателем по всей поверхности среды. Высевы на плотную среду проводят, как правило, из трех последних разведений, причем делают два параллельных высева на отдельные чашки. Посев из каждого разведения следует проводить новой стерильной пипеткой и заново стерилизовать шпатель. После посева чашки помещают в термостат крышками вниз.
Подсчет выросших колоний осуществляют обычно через сутки для большинства бактериальных клеток, через 5 – 7 суток для грибов и дрожжей, а колонии актиномицетов учитывают через 7 – 14 суток инкубирования.
При расчете количества клеток микроорганизмов в 1 мл исходной суспензии суммируют результаты параллельных высевов из одного и того же разведения и определяют среднее количество колоний для данного разведения. Лучшим разведением следует считать то, при высеве из которого на агаризованной питательной среде сформировалось от 30 до 300 колоний. Нижний предел устанавливается из соображений статистической достоверности, а верхний – из-за опасности слияния индивидуальных колоний. Полученные данные подставляют в
формулу:
M = a x 10ⁿ
V
где М – количество клеток в 1 мл; а – среднее количество колоний при высеве из данного разведения; V – объем суспензии в мл, взятой для посева; 10 – коэффициент разведения; n – порядковый номер разведения.
Метод посева в агаризованную среду осуществляют путем внесения в стерильную чашку Петри суспензии микроорганизмов из соответствующего разведения с последующим заливанием расплавленной и охлажденной до 450 агаризованной средой. Содержимое чашки перемешивают и дают среде застыть.
Метод посева в тонком слое предполагает внесение разведенной суспензии микроорганизмов в пробирки с небольшим объемом (2,5 – 3,5 мл) расплавленной полужидкой агаризованной средой, которую затем разливают по стерильным чашкам, уже содержащим один слой застывшей агаризованной среды и дают застыть верхнему слою.
Каждый из вышеперечисленных методов посева имеет свою область использования и определенные ограничения. При посеве на поверхность агаризованной среды все выросшие колонии являются поверхностными. Именно в этом случае изучают характерные изменения в индикаторных агаровых средах. При посеве в агаризованные среды колонии, как правило, компактны и невелики по размерам, так как формируются под слоем агара, что дает возможность учета большего их количества. Вторым преимуществом метода является возможность дополнительных манипуляций с составом среды: верхний и нижнийслой могут содержать разные питательные добавки. Кроме того, к верхнему слою могут быть добавлены красители для облегчения обнаружения колоний.