Для изучения микроорганизмов в окрашенном виде на предметном стекле делают мазок, высушивают, фиксируют его и после этого окрашивают. Приготовление мазков. Исследуемый материал распределяют тонким слоем по поверхности предметного хорошо обезжиренного стекла. Мазки готовят из культур микробов, патологического материала. Техника приготовления мазков определяется характером исследуемого материала. Приготовление мазков из микробных культур с жидкой питательной среды и из жидкого патологического материала. Маленькую каплю исследуемой жидкости наносят бактериальной петлей на предметное стекло и круговыми движениями петли распределяют равномерным слоем в виде кружка диаметром в копеечную монету. Второе — шлифованное — стекло, которое должно быть уже предметного, ставят на первое под углом 45° и подводят к капле до соприкосновения с ней. После того как капля растечется по шлифованному краю, стеклом делают скользящее движение справа налево, равномерно распределяя каплю тонким слоем по всей поверхности стекла. Толщина мазка зависит от величины угла между стеклами: чем острее угол, тем тоньше мазок. Правильно-приготовленный мазок имеет одинаковую толщину на всем протяжении. 2. Приготовление толстой капли. На середину предметного стекла пастеровской пипеткой наносят каплю.Нанесенную на стекло размазывают бактериальной петлей так, чтобы диаметр образующегося мазка соответствовал величине копеечной монеты. Стекло оставляют в горизонтальном положении до подсыхания. Капля в «толстой капле» распределяется неравномерно, образуя неровный край. 3. Приготовленный мазок, накрывают другим предметным стеклом. Стекла слегка придавливают друг к другу. После этого свободные концы стекол захватывают I и II пальцами обеих рук и разводят в противоположные стороны так, чтобы при движении оба стекла плотно прилегали друг к другу. Получаются мазки с равномерно распределенным материалом, занимающим большую часть. 4. Приготовление мазка из культур с плотных питательных сред.На середину чистого, хорошо обезжиренного стекла наносят каплю водопроводной воды, в нее вносят бактериальную петлю с небольшим количеством исследуемой микробной культуры так, чтобы капля жидкости стала слегка мутноватой. После этого излишек микробного материала на петле сжигают в пламени горелки и приступают к приготовлению мазка по описанному выше способу (1). 5. Приготовление мазков из органов и тканей. Поверхность органа с целью обеззараживания прижигают накаленными браншами пинцета, делают по этому месту надрез и из глубины остроконечными ножницами вырезают небольшой кусочек ткани, который помещают между двумя предметными стеклами. Далее поступают так же, как при приготовлении мазка из гноя и мокроты. Если ткань органа плотная, то из глубины разреза делают скальпелем соскоб. Полученный при соскабливании материал распределяют тонким слоем по поверхности стекла скальпелем или бактериальной петлей.
Для изучения взаимного расположения элементов ткани и находящихся в ней микроорганизмов делают мазки-отпечатки. Для этого вырезанный из середины органа небольшой кусочек ткани захватывают пинцетом и прикладывают поверхностью среза к предметному стеклу несколько раз последовательно, получая таким образом ряд мазков-отпечатков. Высушивание и фиксирование мазков. Приготовленный на предметном стекле мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют. При фиксировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата микробные клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые. Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие применение химических средств, вызывающих коагуляцию белков цитоплазмы. Физический способ фиксации. Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за ребра мазком кверху и плавным движением проводят 2—3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2 с. Надежность фиксации проверяют следующим простым приемом: свободную от мазка поверхность предметного стекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти.
При правильном фиксировании мазка стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога. Химический способ фиксации. Для фиксации мазков применяют также химические вещества и соединения (табл. 4). Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом и затем высушивают на воздухе. Техника окраски мазков. Для окраски мазков пользуются растворами красок или красящей бумагой, предложенной А. И. Синевым. Простота приготовления, удобство применения, а также возможность хранения красящих бумаг в течение неограниченно долгого времени явились основанием для широкого их использования при различных способах окраски. Рецепты приготовления красок и реактивов, применяемых при окраске бактериальных препаратов, даны в приложении (с. 341). Окраска мазков красящей бумагой. На высушенный и фиксированный препарат наносят несколько капель воды, кладут окрашенные бумажки величиной 2X2 см. В течение всего времени прокрашивания бумага должна оставаться влажной и плотно прилегать к поверхности стекла.
При подсыхании бумагу дополнительно смачивают водой. Продолжительность окрашивания мазка определяется методом окраски. По окончании окраски бумагу осторожно снимают пинцетом, а мазок промывают водопроводной водой и подсушивают на воздухе или фильтровальной бумагой. Окраска мазков растворами к р а с и тел е й. На высушенный и фиксированный препарат пипеткой наносят краситель в таком количестве, чтобы он покрывал весь мазок. При окраске мазков концентрированными растворами красителей (карболовый фуксин Циля, карболовый генциа-новый или кристаллический фиолетовый) окрашивание производят через фильтровальную бумагу, задерживающую частицы красителя: на фиксированный мазок кладут полоску фильтровальной бумаги и на нее наливают раствор красителя.