Хроматографічні методи аналізу

 

У таких процесах розділення компонентів, як екстракція, у випадках, коли коефіцієнти розподілу між фазами для різних компонентів мало відрізняються один від одного, відокремити їх у одну ступінь не вдається. Щоб повторити розподіл багато разів, вдаються до динамічних методів – хроматографії. У хроматографічному процесі 2 фази – нерухома й рухома (що рухається відносно першої). Поверхня розподілу (межа) між цими фазами досить велика, що забезпечує інтенсивний перерозподіл речовин, які ми розділяємо, між фазами. Просуваючись, рухома фаза багато разів обмінюється з нерухомою цими речовинами, дозволяючи ефективно їх розділяти навіть при близьких коефіцієнтах розподілу.

Хроматографію винайшов ботанік М. С. Цвєт, що у 1901 р. опублікував роботу про відокремлення забарвлених компонентів хлорофілу. Хроматографічні процеси широко застосовують як у аналітичній хімії, так і у препаративному варіанті – щоб здобути продукти відокремлення.

Методи хроматографії класифікують за різними ознаками:

1) За фізичною природою нерухомої та рухомої фаз – на рідинну (рухома фаза є рідкою) й газову хроматографію. У свою чергу рідинну хроматографію розділяють залежно від стану нерухомої фази на твердо-рідинну (нерухома фаза тверда) та рідинно-рідинну (нерухома фаза рідка). Рідинно-рідинну хроматографію часто називають розподільчою хроматографією. Газову хроматографію розділяють на газоадсорбційну (нерухома фаза тверда) та газорідинну або газорозподільчу (нерухома фаза рідка).

2) За механізмом сорбції – на молекулярну й хемосорбційну. У молекулярній нерухома фаза та компоненти, що розділяють, взаємодіють за силами Ван-дер-Ваальса. До хемосорбційної відносять іонообмінну, осадову, лігандообмінну, окисно-відновну. Сорбція тут спричиняється відповідними хімічними реакціями.

3) За засобом хроматографування на фронтальну (аналізована суміш безперервно пропускають через нерухому фазу, й компоненти починають виходити з хроматографічної колонки у порядку збільшення їх здатності до сорбції); проявну, або елюєнтну (де, увівши порцію суміші, через нерухому фазу надалі пропускають тільки рухому, вже без аналізованих компонентів); витіснювальну (де, щоб десорбувати компоненти, надалі пропускають рухому фазу, до якої додано витіснювач – речовину, що здатна сильно сорбуватись, вивільняючи аналізовані компоненти).

4) За формою нерухомої фази – на колоночну (нерухому фазу вміщують у колонку) та площинну (нерухома фаза – смуга паперу або тонкий шар сорбенту, що нанесений на скляну або металеву пластинку).

У сучасних приладах із колоночної елюєнтної хроматографії на виході з колонки вміщують детектор. Він дає сигнал, що залежить від концентрації компонентів, що визначають. На сигнал мають впливати всі компоненти. Селективність детектора відносно окремих компонентів не має особливого значення, оскільки селективність аналізу забезпечується розділенням на колонці. Сигнали детекторів забезпечують теплопровідність, електропровідність, поглинання випромінювань, теплота згоряння і т. ін.

В ідеалі хотілося б, щоб у елюєнтній хроматографії окремі компоненти виходили з колонки як дуже вузькі зони. У дійсності зони розмиваються і компонент утворює так званий хроматографічний пік – максимум концентрації (і відповідного сигналу детектора), в околі якого сигнал поступово сподає. Розмивання у максимумі концентрації спричиняється дифузією компонента як у напрямі руху розчинника, так і у перпендикулярному напрямі. Відіграє роль також і те, що рівновага процесів сорбції-десорбції встановлюється не миттєво, а потребує певного часу. Здатність колонки до утворення чіткого максимуму сигналу на її виході описують у термінах моделі теоретичних тарілок. Цю величину використовують, щоб визначити ефективність хроматографічного процесу, щоб порівнювати різні конструкції колонок, вибір рухомої та нерухомої фаз у проходженні (і розмиванні) зони, що відповідають тому чи іншому реагентові.

Вводячи величину «число теоретичних тарілок», що характеризує якість розділення, розміри піку, тощо, використали модель й термінологію процесу розділення, що був відомий раніше за хроматографію. Це процес ректифікації – ретельного відокремлення компонентів суміші летких компонентів через їх дистиляцію (переганяння). Одноразова дистиляція не дає бажаного розділення і потрібні повторні процеси. Їх можна організувати у ректифікаційній колоні, де випари суміші компонентів, рухаючись уздовж колони, багаторазово конденсуються й знову випаровуються. Поступово випари все більше збагачуються більш летким компонентом (відповідно, конденсат – менш летким), поки не досягнуто бажаної якості розділення. Деякі конструкції колон містять так звані «тарілки», у яких міститься конденсат, через який пропускають випари, щоб досягти рівноваги. Чергова порція випарів, збагачена леткішим компонентом, піднімається з попередньої тарілки, що розташована нижче, у наступну, верхню тарілку. Надлишок конденсату, збагачений менш летким компонентом, зливається із верхньої тарілки у нижню (а із першої тарілки – назад, у «перегінний куб»). У теоретичній моделі обидві фази у тарілці вважають за повністю перемішані. Якість розділення визначається числом тарілок – чим їх більше, тим більше число послідовних дистиляцій імітує колона. Звичайно, що у хроматографічному обладнанні таких «фізичних» тарілок не побачиш, тому у теоретичних моделях «тарілки» назвали «теоретичними».

Пов’язуючи число тарілок із формою хроматограми, використовують модель розмивання піку як випадкового процесу, що відповідає розподілові Гаусса (або так званому нормальному розподілові). Ми маємо з цим розподілом ще зустрітися, вивчаючи розсіяння повторних вимірювань у задачах кількісного аналізу.

На рисунку зображено пік сигналу на виході з колонки, форма якого − так звана крива Гаусса. На осі абсцис може бути час, у який реєструють сигнал, або (якщо розглядати пік, розподілений у колонці) відстань від початку колонки у певний момент часу. На осі ординат – концентрація компоненту в рухомій фазі (або сигнал детектора, h, пропорційний концентрації. Як ординату відносну величину, h / h_max, де у знаменнику – максимальне значення сигналу. Рівняння Гауссова піка –

h = h_max × exp {– [(t – t_R) / s ]² / 2} = [А / (s )] × exp {– [(t – t_R) / s ]² / 2},

де t_R – час, що відповідає максимумові сигналу (величині h_max), А – загальна площа під графіком, s − параметр розподілу, що зветься середнім квадратичним відхиленням. Ця функція симетрична відносно ординати, що відповідає t_R . За властивостями розподілу Гаусса, дотичні до функції проходять на відстані ± s від t_R, й перетинають вісь абсцис на відстані ± »2 s від t_R. Визначаючи s за даними експерименту, іноді вимірюють ширину кривої (різницю між значеннями t) для двох симетричних точок із сигналом h / h_max = 0,5. Ця відстань дорівнює » 2,345 s. За моделлю число теоретичних тарілок дорівнює

n = (t_R / s)² » 5,54 (t_R / w_1/2)² » 16 (t_R / w)²,

де w_1/2 – згадана вище ширина кривої для точок із h / h_max = 0,5, w – відстань між точками перетину дотичних із віссю абсцис, значення 5,54 » (2,345)², 16 = (2 × 2)².

Розрізняти зони від двох компонентів А та В можна, якщо відстань між ними більше за ширину обох зон. Щоб кількісно оцінити здатність розрізнити ці зони, уводять коефіцієнт розділення,

R _s = (t _{R B} – t _{R А}) / (s _A + s _B) = 1,18 (t _{R B} – t _{R А}) / (w _{1/2 A} + w _{1/2 B}),

де останній індекс у величинах вказує, до якого компонента належить величина, а 1,18 = 2,345 / 2 – множник, що переводить w _1/2 у s. Тут вважається, що t _{R А} < t _{R B} (першим рухається компонент А).

Тонкошарова хроматографія (ТШХ).ТШХ запропонована харківськими вченими М. А. Ізмайловим та М. С. Шрайбер, що у 1938 р. опублікували роботу з розділення алкалоїдів на пластинці з оксидом алюмінію. У ТШХ нерухому фазу наносять тонким шаром на скляну, металічну або пластмасову пластинку. Близько від краю пластинки, на так звану стартову лінію, наносять невелику кількість проби аналізованого розчину край пластинки занурюють у розчинник, що стає носієм для рухомої фази. Дією капілярних сил розчинник рухається уздовж шару сорбенту й із різною швидкістю переносить компоненти суміші, що спричиняє їх розділення у просторі.

Існують варіанти ТШХ, де рухому фазу пропускають (через гніт) від середини пластинки до її країв, кільцями. Компоненти, що розділяють, рухаються за радіусами.

Розроблено також двовимірну ТШХ, де, пропустивши рухому фазу в одному напрямі, пластинку підсушують й пропускають рухому фазу іншого складу у перпендикулярному напрямі.

Основні характеристики ТШХ. На рисунку, поданому нижче, подано схему, що вказує розташування плям від різних компонентів на ТШХ. Він відповідає процесу градуювання, коли краплі зразків для двох розчинів чистих компонентів було нанесено на стартову лінію a – a поруч одна від одної, але із зміщенням, щоб вони не змішувались, коли речовину переносить рухома фаза. Фронт її руху позначено лінією b‑b. Фронт перемістився від стартової лінії на відстань xf, середина плями від 1‑ї речовини – на відстань x1, а середина плями від 2‑ї речовини – на відстань x2. Рухаючись, плями розпливаються. Довжину плями від 1‑ї речовини на рисунку позначено як lн‑в, де індекси «н» та «в» відповідають нижній та верхній межі плями (так, відстань, яку пройшла нижню межа плями від 1‑ї речовини на рисунку позначено як xн).

Відношення відстані від стартової лінії до середини плями речовини, до відстані, що проходить фронт рухомої фази, це величина R_f, характерна для речовини та складу рухомої та нерухомої фази. Для 1‑ї та 2‑ї речовин маємо

R_f1 = x₁ / x_f, R_f2 = x₂ / x_f .

У теоретичній моделі процесу величини R_f є постійними, якщо постійним лишаються коефіцієнти розподілу, а отже і частка часу, що проводить молекула речовини, що адсорбується (адсорбату) у рухомій фазі. Отже, слід виміряти величини R_f для стандартних зразків речовин, і використати їх, розшифровуючи хроматограму для аналізованої суміші.

За значеннями R_f ідентифікуємо речовини, здійснюючи якісний аналіз багатьох неогрганічних та, особливо, органічних аналітів.

Якщо аналіт незабарвлений, то, висушивши пластинку з хроматограмою, діють на неї відповідними реагентами, що дають інтенсивно забарвлені продукти із аналітами – проявляють хроматограму.

ТШХ приваблює низькою трудомісткістю, простотою та доступністю обладнання, універсальністю у застосуванні до різноманітних складних об’єктів. Здійснюючи точні виміри, можна оцінити ефективність процесу через число теоретичних тарілок та величину R _s.

Порівнюючи площі плям (чи їх інтенсивність) для об’єкта та стандартів, здійснюють і кількісний аналіз. Із розвитком комп’ютерної техніки для кількісного аналізу у ТШХ розроблено відповідне програмне забезпечення. Хроматограму сканують, використовуючи серійні кольорові сканери з їх програмним забезпеченням, що дає 3 складових сприйняття кольору (відповідно трикольоровому зору й пов’язаних з ним конструкціям дисплеїв, принтерів, взагалі не тільки комп’ютерної, а й поліграфічної техніки). Спеціальна комп’ютерна програма розшифровує зображення від сканера, виводячи з нього 3 складові залежності інтенсивності кольору від відстані між досліджуваною точкою хроматограми і стартовою лінією. Ці функції можна виводити як наочні графіки (на екран чи на принтер), інтегрувати, порівнювати одну з одною (наприклад, стандартного зразка та об’єкта), перераховувати у концентрації. Комп’ютерне обладнання досить поширене, доступне і недороге (порівняно з обладнанням для хроматографічного аналізу іншими методами). Тому вказаний напрям є перспективним.

Як і в інших видах хроматографії, на ефективність розділення впливає перш за все вибір нерухомої та рухомої фази. Досить зручно використовувати пластинки з нерухомою фазою, що випускає промисловість. У нас визнання здобули пластинки марки «Сілуфол» на основі силікагелю, що випускали у Чехословаччині.

Найбільш широке джерело оптимізації конкретної методики – вибір складу розчинника у рухомій фазі. Найчастіше використовують суміші органічних розчинників. Більш полярний компонент розчинника сприяє більшій сольватації полярних аналітів і зменшенню відповідних R_f. Вибір розчинника здійснюємо за порівняльними таблицями їх властивостей.

Умови ТШХ. Щоб сподіватись, що значення R_f у дослідах постійне, і цю величину можна використовувати як надійну характеристику у аналізі за ТШХ, слід підтримувати однакові умови як для стандартної речовини, так і для аналізованого об’єкта:

1) Зразки й об’єкт готують, використовуючи однаковий розчинник. Щоб зменшити витрати розчинника протягом руху фронту хроматограми й (у типовому випадку використання суміші розчинників) забезпечити постійний склад розчинника, процес здійснюють у спеціальній камері, атмосферу якої попередньо насичують випарами розчинника.

2) Концентрації аналізованих речовин та стандартів мають бути близькими, щоб залежності інтенсивності плями від концентрації були близькими до лінійних.

3) На пластинку наносять однакові об’єми розчинів об’єкта та стандартів. Площа плям на стартовій лінії має бути однаковою. Розчини наносять мікрокраплями й дають розчинникові випаритись після нанесення кожної краплі.

4) Розчини як об’єкта, так і стандартів готують, використовуючи той самий розчинник.

5) Зменшуючи похибки від коливання властивостей нерухомої фази, бажано розчини як об’єкта, так і стандартів наносити поруч.

Лабораторна робота № 6.1. розділення нейтральних хелатів (комплексів металівіз органічним лігандом) методом ТШХ.

Мета роботи: ознайомитись із прийомами ТШХ на прикладі розділення 1‑(2‑піридилазо)‑2‑нафтола (ПАН) та його комплексів із Cu (II), Ni (II), Co (II) та Fe (II).

1. Реактиви й обладнання

ПАН, спиртовий розчин із масовою часткою w(ПАН) = 0,01 %.

Розчини з с(Ме (ІІ)) = 1 × 10^‑4 моль/л солей Cu (II), Ni (II), Co (II) та Fe (II).

Буферний розчин із рН = 3,5-4.

Хлороформ; ацетон (або етанол, толуол).

Ділильні лійки, піпетки місткістю 10 мл та 1 мл (останні – з поділками), вимірювальні циліндри місткістю » 10 мл, хроматографічні пластинки, капіляри, камера для хроматографування (звичайно хімічна склянка з кришкою з листового скла).

2. Одержання екстрактів комплексів

У ділильну лійку місткістю » 100 мл уведіть піпеткою 10 мл розчину солі відповідного металу, додайте піпеткою 0,5 мл спиртового розчину ПАН та циліндром 10 мл буферного розчину. Через 5 хв вимірним циліндром додайте 10 мл хлороформу й екстрагуйте утворені комплекси, ретельно перемішавши вміст лійки та відокремивши органічну фазу у пробірку.

3. Хроматографування

На хроматографічній пластинці, відступивши від її нижнього боку на 2 см, олівцем (за лінійкою) проведіть стартову лінію. На цю лінію, на відстані 0,5-1 см одне від одного, нанесіть відібрані у капіляри краплі хлороформних екстрактів комплексів та екстракту об’єкта розчином ПАН’у. Плями від крапель підсушіть, опустіть нижній край хроматографічної пластинки в розчинник – елюент (суміш ацетон – хлороформ у об’ємному відношенні 1:10, або краще етанол ‑толуол у об’ємному відношенні 3:7), що налитий тонким шаром у камеру для хроматографування, й зразу закривають камеру кришкою.

Камеру з сумішшю розчинників готують заздалегідь. Щоб уникнути зміни концентрацій складових цієї суміші на хроматографічній пластинці, спричиненій випаровуванням елюенту, повітря у камері попередньо насичують цими випарами. Зазвичай у елюент занурюють аркушик фільтрувального паперу, що збільшує поверхню випаровування й цим пришвидшує встановлення рівноваги між рідиною та її випарами. Камеру постійно закривають кришкою, знімаючи останню лише на мить, щоб внести пластинку у камеру.

Коли межа між мокрою та сухою частиною пластинки (так званий фронт) досягне відстані » 1 см від верхнього краю пластинки, процес припиніть, вийнявши пластинку з камери. Помітьте місце цієї межі й висушіть пластинку. Виміряйте лінійкою, на якій відстані від стартової лінії розташовані плями від компонентів, що розділені хроматографічно, і на якій відстані розташовано фронт елюенту. Порівнюючи значення R_f для стандартів та компонентів об’єкта, встановіть якісний склад останнього.

Лабораторна робота № 6.2. розділення амінокислот методом ТШХ.

Мета роботи: ознайомитись з прийомами ТШХ на прикладі розділення амінокислот – аланіна, гістидина, глутамінової кислоти.

1. Реактиви й обладнання

Розчини з масовими концентраціями амінокислот, r = 10^‑3 г /л.

Розчин нінгідрину (в етанолі або у суміші розчину оцтової кислоти, із масовою часткою w = 120 г/л, та н‑бутанолу, співвідношення об’ємів розчинників 1:19 ), із масовою часткою нінгідрину w = 0,2 %.

Льодяна оцтова кислота, бутанол.

Ділильні лійки, піпетки місткістю 10 мл та 1 мл (останні – з поділками), вимірювальні циліндри місткістю » 10 мл, хроматографічні пластинки, капіляри, камера для хроматографування (хімічна склянка з кришкою з листового скла).

2. Хроматографування

Методика нанесення проби та стандартних розчинів й хроматографування така ж, як у попередній роботі. Оскільки розчини вихідних речовин є водяними, а швидкість випаровування води порівняно низька, зверніть особливу увагу на висушування крапель вихідних розчинів, що нанесені на стартову лінію. Корисно підігріти вихідні плями у теплому повітрі. Об’єми всіх розчинів дорівнюють 5 мкл. Елюентом є суміш льодяної оцтової кислоти з водою та бутанолом, у об’ємному відношенні 1:1:3. Коли фронт просунеться на » 15 см, процес припиніть, пластинку висушіть при 100-105 ^оС протягом 15 хв. Плями переведіть у забарвлені, оприскуючи пластинку розчином нінгідрину. Порівнюючи R_f для стандартів та об’єкту, зробіть висновок про якісний склад останнього.