Молекулярные механизмы апоптоза. Апоптоз – многоэтапный процесс.
Начальный этап – прием сигнала, предвестника гибели в виде информации, поступающей в клетку извне или возникающей в недрах самой клетки. К эффекторам апоптоза относят свободные кислородные радикалы, эндонуклеазы, цистеиновые и сериновые протеазы, семейство TNF, нейротрансмиттеры (глутамат, допамин, N-метил-d-аспартат), онкогены (myc, rel) и гормоны [10]. Сигнал воспринимается рецептором, подвергается анализу и далее передается молекулам-посредникам. В конечном итоге происходит активация особых ферментов, называемых каспазами.
Наряду с апоптозными имеются каспазы, которые активируют цитокины, участвующие в воспалительных процессах. Каспазы Каспазы относятся к семейству эволюционно консервативных протеаз – ферментов, катализирующих ограниченное расщепление клеточных белков. Известны 14 членов семейства, в активном центре каждого фермента расположен остаток цистеина. Все они являются аспазами: специфически узнают определенные тетрапептидные звенья белков и расщепляют пептидную связь по карбоксильному концу остатка аспарагиновой кислоты.
В клетке каспазы синтезируются в форме латентных предшественников – проферментов, называемых прокаспазами (рис.1). Рис.1. Активация прокаспаз путем протеолитического расщепления на субъединицы и их последующей ассоциации: I – продомен, II – промежуточный домен, предшественник большой субъединицы, III – C-концевой домен, предшественник малой субъединицы каспаз [12]. По особенностям действия различают инициирующие и эффекторные каспазы или соответственно каспазы первого и второго эшелонов.
Актив ация инициирующих прокаспаз происходит при участии специальных белков-адаптеров. На этапе активации каспаз первого эшелона жизнь клетки еще можно сохранить. Существуют регуляторы, которые блокируют или, напротив, усиливают разрушительное действие каспаз первого эшелона. К ним относятся белки Bcl-2 (ингибиторы апоптоза: A1, Bcl-2, Bcl-W, Bcl-XL, Brag-1, Mcl-1 и NR13) и Bax (промоторы апоптоза: Bad, Bak, Bax, Bcl-XS, Bid, Bik, Bim, Hrk, Mtd). Эти белки эволюционно консервативны: гомолог Bcl-2 обнаружен даже у губок Geodia cydomium и Suberites domuncula, у которых апоптоз необходим для морфогенеза.
Субстраты каспаз первого эшелона (к ним относятся каспазы-2, -8, -9, -10 и -12) – латентные формы каспаз второго эшелона – прокаспазы-3, -6, и -7[12]. По субстратной специфичности каспазы делят на 3 семейства: 1 группа (1, 4, 5 каспазы) – предпочитают действовать на тетрапептид включающий триптофан, играют основную роль в воспалении; 2 группа (2, 3, 7 каспазы) – узнают тетрапептид, в котором на первом месте расположен аспарагин; 3 группа (6, 8, 9, 10) – узнают тетрапептид, начинающийся с гидрофобной аминокислоты (лейцина, изолейцина, валина) [1] Свыше 60 различных белков являются субстратами эффекторных каспаз.
По функциональной принадлежности они разделяются на несколько групп: • подвергается протеолизу ингибитор ДНКазы, ответственной за фрагментацию ДНК. В нормальных клетках апоптозная ДНКаза CAD (caspase-activated DNase – ДНКаза, активируемая каспазой) образует неактивный комплекс с ингибитором CAD, обозначаемым ICAD или DFF (DNA fragmentation factor – фактор фрагментации ДНК). При апоптозе ингибитор ICAD с участием каспаз-3 или -7 инактивируется и свободная CAD, вызывая межнуклеосомальные разрывы хроматина, ведет к образованию фрагментов ДНК с молекулярной массой, кратной молекулярной массе ДНК в нуклеосомных частицах, – 180–200 пар нуклеотидов.
Эти фрагменты при электрофоретическом разделении в агарозном геле дают характерную лесенку ДНК. Апоптоз возможен и без фрагментации ДНК; • происходят инактивация и нарушение регуляции белков, участвующих в репарации ДНК, сплайсинге мРНК, репликации ДНК. Мишенью каспаз является поли(АДФ-рибозо)полимераза (ПАРП). Этот фермент участвует в репарации ДНК, катализируя поли-АДФ-рибозилирование гистонов и других белков, связанных с ДНК. Донором АДФ-рибозы является NAD +. Активность ПАРП возрастает в 500 раз и более при связывании с участками разрыва ДНК. Апоптозная гибель клетки сопровождается расщеплением ПАРП каспазами.
Чрезмерная активация ПАРП при массированных разрывах ДНК, сильно снижая содержание внутриклеточного NAD+, ведет к подавлению гликолиза и митохондриального дыхания и вызывает гибель клетки по варианту не кроза; • разрушаются белки цитоскелета: ламины (структурные белки, выстилающие изнутри поверхность внутренней ядерной мембраны), актин, фодрин, кератины, а также фермент гельдолин, катализирующий деполимеризацию актина; • модифицируются белки – регуляторы клеточного деления.
Активируются циклинзависимые киназы, разрушаются белки (p21 и p27), подавляющие активность этих киназ; • разрушаются антиапоптозные белки семейства Bcl-2, проапоптозный белок Bid, белки IAP; • модифицируются белки, участвующие в межклеточной сигнализации, ядерные факторы траскрипции.
Наибольшей активностью в расщеплении этих белков обладает каспаза-3: считают, что после ее активации клетка необратимо теряет пути к выживанию.
Структурно прокаспаза (молекулярная масса до 50 кДа) состоит из трех звеньев: N-концевого звена (продомена), промежуточного домена, предшественника большой субъединицы (20 кДа) и С-концевого домена, предшественника малой субъединицы (10 кДа) зрело го фермента. Продомены инициирующих (а также воспалительных) прокаспаз содержат свыше 100 аминокислотных остатков. Они выполняют важную функцию в активации фермента: осуществляют взаимодействие прокаспаз с белками-адаптерами.
В этих белок-белковых взаимодействиях участвуют специализированные участки продоменов, у разных прокаспаз это DED (death effector domain – домен эффектора смерти), CARD (caspase recruitment dоmain –домен рекрутирования каспазы), DD (death domain – домен смерти) [1 3]. Все они имеют сходную структуру, содержат по шесть α-спиральных участков. Прокаспазы обладают незначительной протеолитической активностью, составляющей 1–2% активности зрелой каспазы [8]. Будучи в мономерной форме, прокаспазы, концентрация которых в клетке ничтожна, находятся в латентном состоянии.
Предполагается, что пространственное сближение молекул прокaспаз при их агрегации ведет к образованию активных каспаз через механизм протеолитического само- и перекре стного расщепления (ауто- или транс-процессинга). Так, у прокаспазы-9 это CARD, а у прокаспазы-8 два последовательно соединенных DED. Такие же домены имеются у адаптерных молекул, что позволяет реализовать междоменное, так называемое гомофильное взаимодействие между прокаспазой и адаптером – CARD–CARD, DED–DED. Продомены эффекторных прокаспаз короче, чем у инициирующих прокаспаз, содержат менее 30 ами нокислотных остатков и выполняют функцию ингибитора активации прокаспаз.
Выявлены белки (их обозначают IAP), которые, блокируя отщепление продомена эффекторных прокаспаз и тем самым подавляя их активацию, предотвращают апоптоз. Активация каспазы заключается в протеолитическом удалении продомена, разрыве связи между большой и малой субъединицами и последующей сборке из них гетеродимера.
Два гетеродимера, связываясь друг с другом через малые субъединицы, образуют тетрамер – активную форму каспазы, обладающую двумя идентичными каталитическими центрами [5]. Существует несколько путей развития эффекторной фазы апоптоза, принципиальное отличие которых заключается в механизме инициации и трансдукции проапоптического сигнала. В настоящее время описано три генеральных пути апоптоза: митохондриальный (Bcl-2-зависимый) путь, гранзим В- связанный путь, и опосредованный через «рецепторы смерти» [11]. Bcl-2-зависимый путь апоптоза В клетках, подвергшихся воздействию индуктора апоптоза, резко снижается мембранный потенциал (Dy)митохондрий.
Падение Dy обусловлено увеличением проницаемости внутренней мембраны митохондрий (permeability transition) вследствие образования гигантских пор. Разнообразны факторы, вызывающие раскрытие пор. К ним относятся истощение клеток восстановленным глутатионом, NAD(P)H, ATP и ADP, образование активных форм кислорода, разобщение окислительного фосфорилирования протонофорными соединениями, увеличение содержания Ca2+ в цитоплазме [7]. Образование пор в митохондриях можно вызвать церамидом, NO, каспазами, амфипатическими пептидами, жирными кислотами.
Поры имеют диаметр 2,9 нм, позволяющий пересекать мембрану веществам с молекулярной массой 1,5 кДа и ниже. Следствием раскрытия поры является набухание митохондриального матрикса, разрыв наружной мембраны митохондрий и высвобождение растворимых белков межмембранного объема.
Среди этих белков – ряд апоптогенных факторов: цитохром с, прокаспазы 2, 3 и 9, белок A IF (apoptosis inducing factor), представляющий собой флавопротеин с молекулярной массой 57 кДа. Прокаспаза-3 обнаруживается как в межмембранном объеме митохондрий, так и в цитоплазме. Образование гигантских пор не является единственным механизмом выхода межмембранных белков митохондрий в цитоплазму. Предполагается, что разрыв наружной мембраны митохондрий может быть вызван гиперполяризацией внутренней мембраны (ср. с гипополяризацией при раскрытии гигантских пор). Возможен и альтернативный механизм, без разрыва мембраны, – раскрытие гигантского белкового канала в самой наружной мембране, способного пропускать цитохром с и другие белки из межмембранного пространства.
Высвобождаемый из митохондрий цитохром с вместе с цитоплазматическим фактором APAF-1 (apoptosis protease activating factor-1) участвует в активации каспазы-9. APAF-1 – белок с молекулярной массой 130 кДа, содержащий CA RD-домен (caspase activation and recruitment domain) на N-конце и 12 повторяющихся аминокислотных WD-40-последовательностей (WD – дипептид из триптофана и аспартата) на С-конце, образует комплекс с прокаспазой-9 в присутствии цитохрома с и dATP или АТР (концентрация dATP в клетке в 1000 раз ниже концентрации АТР). К наиболее охарактеризованным WD-белкам относится b -cубъединица G-белков.
Из этих субъединиц собираются жесткие, симметричные структуры, наподобие веера или пропеллера.
WD-Повторы свойственны белкам, участвующим в регуляции деления и дифференцировки эукариотных клеток, транскрипции генов, модификации мРНК, трансмембранной передачи сигналов, слияния мембранных везикул. Среди прокариот WD-белки обнаружены у цианобактерий. APAF-1 играет роль арматуры, на которой происходит аутокаталитический процессинг каспазы-9. Предполагается, что в результате зависимого от гидролиза dATP ( или АТР) конформационного изменения APAF-1 приобретает способность связывать цитохром с. Связав цитохром с, APAF-1 претерпевает дальнейшее конформационное изменение, способствующее его олигомеризации и открывающее доступ CARD-домена APAF-1 для прокаспазы-9, которая тоже содержит CARD-домен.
Так образуется конструкция, называемая тоже апоптосомой (рис.2), с молекулярной массой > 1,3 млн дальтон, в составе которой – не менее 8 субъединиц APA F-1. Благодаря гомофильному CARD-CARD-взаимодействию с APAF-1 в эквимолярном соотношении связывается прокаспаза-9, а затем прокаспаза-9 связывает прокаспазу-3. Пространственное сближение молекул прокаспазы-9 на мультимерной арматуре из APAF-1-цитохром-с-комплексов, по-видимому, приводит к межмолекулярному протеолитическому процессингу прокаспазы-9 с образованием активной каспазы-9. Сходный механизм предложен для активации прокаспазы CED-3 у червя Caenorhabditis elegans–аналога прокаспазы-9 млекопитающих.
Альтернативный вариант – прокаспаза-9, связавшись с апоптосомой, может принять конформацию, которая приводит к внутримолекулярному процессингу (самоактивации). Зрелая каспаза-9 затем расщепляет и активирует прокаспазу-3. Мутантный APAF-1, лишенный WD-40-повторов, активирует прокаспазу-9, но не способен к рекрутированию и активации прокаспазы-3. Ф лавопротеин AIF, будучи добавленным к изолированным ядрам из клеток HeLa, вызывает конденсацию хроматина и фрагментацию ДНК, а при добавлении к изолированным митохондриям печени крыс – высвобождение цитохрома с и каспазы-9. Микроинъекция AIF в интактные фибробласты крыс приводит к конденсации хроматина по переферии ядра, разрыву ДНК на крупные фрагменты длиной 50 т.п.н. и больше, диссипации Dy в митохондриях и переходу фосфатидилсерина из внутреннего слоя цитоплазматической мембраны в наружный. Ни один из этих эффектов AIF не предотвращается пептидным ингибитором каспаз N-бензоилоксикарбонил-Val-Ala-Asp-трифто рметилкетоном (Z-VAD.fmk), который предотвращает апоптоз, индуцированный микроинъецированным цитохромом с. Эти данные показывают, что AIF является митохондриальным эффектором ПКС у животных, действующим независимо от каспаз.
Рис.2. Структура апоптосомы – гептамерный комплекс моле кул АPAF-1 и цитохрома с [5]. Кроме рассмотренных компонентов, при нарушении наружной мембраны митохондрий из межмембранного объема выделяется термолабильный фактор, вызывающий необратимое превращение ксантиндегидрогеназы в ксантиноксидазу.
Фактор устойчив к ряду испытанных ингибиторов протеаз, включая каспазы, сериновые и металлопротеазы.
Ксантиндегидрогеназа катализирует зависимое от NAD+ окисление ксантина до гипоксантина и последующее окисление гипоксантина до мочевой кислоты. Ксантиноксидаза катализирует те же реакции, но не с NAD+, а с О2 в качестве акцептора электронов.
При этом образуются О2 Н2О2, а из них – и другие активные формы кислорода (АФК), которые разрушают митохондрии и являются мощными индукторами апоптоза. Механизмы образования АФК, конечно, не ограничиваются ксантиноксидазной реакцией.
Главным источником А ФК в клетках являются митохондрии. Резкое увеличение АФК происходит при возрастании мембранного потенциала в митохондриях, когда снижено потребление ATP и скорость дыхания лимитируется ADP. Доля электронного потока через дыхательную цепь митохондрий, идущая на образование О 2 достигает 1-5 %. Цитоплазматическая мембрана макрофагов и нейтрофилов, как уже отмечалось, содержит О2- – генерирующую NADPH-оксидазу.
В зависимости от пути, по которому осуществляется активация ка спаз, различают разные типы клеток. Клетки типа I (в частности, линия лимфобластоидных В-клеток SKW и T-клетки линии Н9) подвергаются ПКС по пути, зависимому от апоптозных рецепторов плазматической мембраны без участия митохондриальных белков. Клетки типа II (например, линии Т-клеток Jurkat и СЕМ) погибают по пути апоптоза, зависимому от митохондриального цитохрома с. ПКС, вызванная химиотерапевтическими соединениями, УФ- или γ-облучением, по-видимому, напрямую связана с апоптозной функцией митохондрий: клетки, лишенные генов белка APAF-1 или каспазы-9, устойчивы к химио- и радиационной обработке, но погибают при индукции Fas-рецептора.
Некоторые клетки, например, клетки эмбриональной нервной системы, включают механизмы апоптоза, если они испытывают дефицит апоптозподавляющих сигналов (называемых также факторами выживания) от других клеток. Физиологический смысл процесса – в элиминации избыточных нервных клеток, конкурирующих за о граниченный фонд факторов выживания.
Эпителиальные клетки при отделении от внеклеточного матрикса, вырабатывающего факторы выживания, тоже обречены на ПКС. Факторы выживания связываются соответствующими цитоплазматическими рецепторами, активируя синтез подавляющих апоптоз агентов и блокируя стимуляторы апоптоза. Некоторые вещества (например, стероидные гормоны) оказывают дифференцированный эффект на различные типы клеток – предотвращают апоптоз одних типов клет ок и индуцируют его у других [13]. Существует еще несколько механизмов, приводящих к апоптозу через ингибирование Bcl-2. Например, возможна регуляция через онкосупрессор - белок p53, замедляющий в нормальных клетках пролиферативную активность.
При повреждении ДНК под действием ионизирующего или ультрафиолетового излучения, ингибиторов топоизомеразы II, а также при некоторых других воздействиях, происходит активация экспрессии гена р53. Белок p 53 задерживает клетку в фазе G1/S клеточного цикла (через репрессию генов, регулирующих транскрипцию), чтобы дать время для работы репаративных систем.
На уровне транскрипции фактор р53 регулирует экспрессию генов, участвующих в блокаде клеточного цикла - р21 (ингибитор большинства циклин-зависимых киназ), а также взаимодействует либо с комплексами, определяющими синтез и репарацию ДНК, либо с белками, модулирующими апоптоз (например, Вах). Если повреждения ликвидировать не удается, то p53 запускает апоптоз. Происходит это через инактивирование Bcl-2 при связывании с белком Bax. Известно, что некоторые стимулы, такие как гипоксия или митогенные онкогены, активируют ген p53, переводя клетку на апоптический путь [3].