1. Получение образцов ДНК (или РНК) реализуется в двух вариантах:
а) выделение всей ДНК (тотальной или геномной) из клеток:
б) накопление определенных фрагментов с помощью ПЦР.
Источником геномной ДНК являются любые ядросодержащие клетки. Выделенная из клеток ДНК представляет собой весь геном организма, поэтому такие образцы называют геномной ДНК. Материалом для исследования является периферическая кровь (лейкоциты), хорион, амниотические клетки, культура фиброб-ластов. эпителий слизистой щеки, волосяные луковицы и др. Для диагностики болезни или гетерозиготного состояния достаточно исследовать лишь небольшой фрагмент генома. поэтому для проведения анализа необходимо получить достаточное количество таких фрагментов, т.е. амплифицировать (умножить) их. Накопление нужных фрагментов ДНК решается с помощью ПЦР.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - метод амплификации ДНК т уйго. В течение нескольких часов можно размножить определенную последовательность ДНК в количестве, превышающем исходное в миллион и более раз. Необходимым условием для проведения ПЦР является знание нукледотидной последовательности амгашфицируемого фрагмента. В соответствии с нуклеотидной последовательностью концов исследуемого участка синтезируется два олигонуклеотидных прай-мера (затравки). Длина праймеров составляет 20-30 пар нуклеотидов. Процесс амплификации осуществляется в виде нескольких повторяющихся циклов. Каждый цикл включает три стадии: температурная денатурация ДНК. присоединение праймеров к комплементарным последовательностям одноцепочечных молекул (отжиг), синтез полинуклеотидных цепей на одноцепочечных молекулах в границах присоединенных праймеров с помощью полимеразы.
2. Рестрикция ДНК на фрагменты. Этот процесс осуществляется ресрикта-зами (они относятся к бактериальным эндонуклеазам). Они разрывают двухцепо-чечную ДНК в пределах строго определенных для каждого фрагмента последовательностей нуклеотидов протяженностью 4-6 пар нуклеотидов.
3. Электрофорез фрагментов ДНК обеспечивает разделение этих фрагментов при их распределении на поверхности агарозного или полиакриламидного геля. Фрагменты ДНК движутся в геле, помещенном в электрическое поле, от отрицательного полюса к положительному. После окончания электрофореза каждый фрагмент ДНК занимает определенное положение в виде дискретной полосы в конкретном месте геля. Длину каждого фрагмента определяют путем сравнения пройденного фрагментом расстояния с расстоянием, пройденным стандартным образцом ДНК с известными размерами
4. Визуализация и идентификация фрагментов ДНК. После окончания ПЦР гель обрабатывается этидия бромидом, который связывается с ДНК. при ультрафи- олетовом облучении поверхности геля выявляется свечение в красной области спектра. Разработаны и другие методы окраски ПЦР-фрагментов. Идентификация специфических фрагментов ДНК осуществляется с помощью блот-гибридизации по Саузерну. Проводят гибридизацию фрагментов ДНК (которые фиксируют на специальном фильтре) со специфическим по нуклеотидной последовательности меченым радионуклидом или флюоресцентной метши олигонуклеотидным синтетическим зондом или клонированным фрагментом ДНК. Нуклеотидная последовательность зонда должна быть полностью или частично комплементарна изучаемо-ш участку геномной ДНК. Радиоактивно меченные участки выявляют путем экспонирования фильтра с рентгеновской пленкой (ауторадиография). После проявления на пленке видны полосы меченной зондом ДНК. Нерадиоактивные метки визуализируют с помощью флюоресценции или опосредованно с помощью антител. Различают прямую и косвенную ДНК-диагностику генных наследственных болезней.
Прямые методы возможны при условии, что ген -заболевания клонирован, известна его экзон интронная организация или нуклеотидная последовательность комплементарной ДНК. При прямой диагностике предметом анализа является мутация гена. Косвенные методы диагностики применяются, если ген заболевания не клонирован или заболевание генетически гетерогенное. Этот метод основан на использовании сцепленных с геном полиморфных маркеров. В этом случае определяется гашютип хромосомы, несущей мутантный ген в семьях высокого риска, т.е. у родителей больного и его ближайших родственников. Такой подход возможен практически для всех генных заболеваний с известной локализацией гена.