Структурная организация.

Первичная структура – полинуклеотидная цепь.

Вторичная структура – две комплементарные и антипараллельные полициклические цепи.

Третичная структура – трехмерная спираль.

Видовая специфичность: А+Т/Г+Ц; - у эукариот избыток

А+Т, у прокариот встречаются формы с избытком А+Т и Г+Ц.

ДНК содержит 10⁸ нуклеотидов, порядок чередования нуклеотидов составляет 4*10⁸.

Двойная спираль ДНК непрестанно меняющаяся структура, самые быстрые процессы происходят в ней за пикосекунду (10^-12с), более медленные от тысячной доли секунды до одного часа. Малые ДНК – митохондрии, хлоропласты содержат 10-100 * 10³ н.п., в среднем 10⁶ н.п.

2. Репликация ДНК. ДНК- единственное вещество, количество которого строго постоянно во всех клетках организма. Репликация ДНК происходит перед каждым удвоением хромосом и делением клетки, у эукариот в фазу S интерфазы. Структура способная к репликации – репликон ( хромосома, плазмида, вирусный геном). Репликация обеспечивает материальную непрерывность наследственного вещества клетки.

Уотсон и Крик предложили схему репродукции ДНК, согласно которой спиралевидная двухцепочная ДНК сначала раскручивается ( расплетается) вдоль оси, при этом слабые водородные связи между азотистыми основаниями рвутся и цепи расходятся, образуя репликационную вилку. Одновременно с этим к нуклеотидам каждой цепи пристраиваются комплементарные нуклеотиды, которые с помощью ферментов ДНК- полимераз связываются в новые полинуклеотидные цепи. В результате из одной образуются две новые дочерние молекулы ДНК. Каждая дочерняя молекула, наследуя структуру одной цепи материнской молекулы, строго сохраняет специфичность заключенной в ней информации. Поскольку матрицей для репликации служит одна из двух цепей молекулы такой тип синтеза ДНК носит название полуконсервативной репродукции. Г. Стент выдвигал ещё два способа репликации: консервативный и дисперсный, которые были опровергнуты исследованиями М. Мельсона и Ф.Сталя с изотопами азота ¹⁵N.

У прокариот репликация идёт с одной стартовой точки, у эукариот стартовых точек несколько. На лидирующей цепи 5' - 3' репликация идёт в виде сплошной нити, на запаздывающей 3' - 5' вначале образуются отрезки у эукариот по 100 – 200 , а у прокариот по 1000 – 2000 нуклеотидов – фрагменты Оказаки, которые затем ферментами ( лигазой), сшиваются в единую цепь. Кольцевые ДНК прокариот реплицируются в виде « катящегося обруча». Одна из нитей ДНК разрывается и её конец прикрепляется к клеточной мембране , а на противоположном конце, как на матрице, идёт синтез дочерней нити ДНК. Скорость репликации у бактерий – 500, у вирусов – 900 нуклеотидов в минуту, у эукариот значительно медленнее – 20 – 40 нуклеотидов в минуту.

3. Строение и типы РНК.

Установлено, что синтез белка происходит не в ядре, где находится ДНК, а в цитоплазме. Следовательно, ДНК не может служить матрицей для синтеза белка. Каковы молекулярные механизмы переписи информации?

Выяснилось, что молекулами ответственными за внутриклеточную транспортировку информации и за преобразование ее в последовательность аминокислот в структуре белковой молекулы являются РНК. Молекулы РНК имеют 1 полипептидную цепь.

Молекулярная масса РНК колеблется от 2*10⁴ до 2*10⁶Д. Существует 3 основных вида РНК: информационная иРНК или мРНК, рибосомальная рРНК, транспортная тРНК, которые различаются по величине молекул и функциям. Все типы РНК синтезируются на ДНК при участии РНК – полимераз. Установлено, что у бактерий в синтезе тРНК участвует только 0,028% молекулы ДНК, в синтезе рРНК - 0,3%. На большей части молекулы ДНК синтезируется иРНК.

Информационная РНК впервые была обнаружена в 1957г. У бактерии кишечной палочки, зараженная фагом Т2. Выделили иРНК из зараженных фагом бактерий и метазом химического анализа доказали, что нуклеотидный состав иРНК точно соответствует нуклеотидному составу ДНК фагу.

Роль иРНК заключается в переписывании наследственной информации с участием ДНК (гена) другие с копированной последовательности азотистых оснований переносят ее в рибосомы, где происходит синтез определенного белка. Каждый триплет (три нуклеотида) на иРНК называется кодоном. От него зависит какая встанет аминокислота в данном месте при синтезе белка.

В рибосомах иРНК выполняет еще роль матрицы (они поэтому называются еще матричными) иРНК составляет около 5% всей клеточной РНК. Отмечаем 2*10⁶Д молекулярной массой, следовательно, состоит из многих сотен и даже тысяч нуклеотидов. Существует большое разнообразие иРНК как в отношении состава, так и величины молекул. Почему?

В клетке много белков разнообразных по строению (только в бактериальной клетке их в среднем 2 тысячи), а строение обусловлено своей иРНК.

Транспортная РНК отличает гены молекулярной массой 24-30*10³ Д и содержит в своей молекуле 75-80 нуклеотидов.

За последние годы установлена нуклеотидная последовательность у многих молекул тРНК. На тРНК приходиться около 10-15% всей клеточной РНК. Роль тРНК заключается в том, они переносят аминокислоты к рибосомам и участвуют в синтезе белка. Каждая аминокислота присоединяется к определенной тРНК. Для ряда аминокислот открыто более одной тРНК. К настоящему времени обнаружено больше 60 тРНК.

Рибосомальная РНК (рРНК) молекулярная масса 5-20*10⁵Д, содержит до 6000 нуклеотидов. Рибосомальная РНК накапливается в ядрышках, затем поступает в цитоплазму. Комплексуясь с особыми белками она образует рибосомы, в которых осуществляется синтез белков в клетке. Поскольку рибосом в клетке много (тысячи ), поэтому и общее количество рРНК составляет около 80% всей РНК клетки.

Биологическая роль рРНК до конца не выяснена. Считают, что одной из функций рРНК является образование «каркаса» определяющего морфологию рибосомы.

Рибосомы представляют собой органеллы величиной 20-30 нм. Они построены из двух суб- частиц разного размера, формы и химического состава. В животных клетках большая часть рибосом связана с мембранами эндоплазматического ретикулума. На определенных стадиях белкового синтеза в клетке происходит разделение рибосом на суб-еденицы.

Отметим, что число рибосом в клетке прокариот ≈10⁴, у эукариот -10⁵. В период синтеза белка рибосомы могут объединяться полисомы, образуя высоко организованные комплексы.

Контрольные вопросы: 1. Какие пуриновые и пиримидиновые основания входят в ДНК? 2. Каковы доказательства генетической роли нуклеиновых кислот? 3. Какие азотистые основания образуют комплементарные пары в ДНК ? 4. Назовите основные особенности строения ДНК и РНК. 5.В чём сущность и каков механизм репликации ДНК? 6. В чём сущность правил Чаргаффа? 7. Назовите типы РНК и какова их генетическая роль?

Лекция 8

Тема: Биосинтез белка в клетке.

Вопросы: 1. Этапы реализации генетической информации: транскрипция, генетический код, трансляция. 2. Регуляция синтеза белка в клетке у прокариот. 3. Механизм генной активности у эукариот.

1. Этапы реализации генетической информации. Установлено, что наследственность реализуется в процессе биосинтеза белка по схеме ДНКـــــ РНК ـــــ белок. Синтез ферментов и др. белков необходим для жизнедеятельности и развития организма происходит в основанном в первой фазе интерфазы до начала репликации ДНК. Для синтеза белка необходимы следующие компоненты ДНК (гены), иРНК, тРНК, рибосомы, ферменты, белковые факторы, которые принимают непосредственное участие в системе трансляции. Источники энергии АТф, ГТф. Ионы Mg^{2 +} и аминокислоты. В процессе синтеза белка различают этапы: транскрипцию и трансляцию.

Транскрипция – переписывание нуклеотидных последовательностей определённых участков ДНК в форме мРНК, т. е.первый шаг на пути к формированию признака. Синтезированные в ходе обмена веществ в клетке рибонуклеозиды, в форме рибонуклеозидтрифосфатов, пристраиваются к комплементарным основаниям ДНК. Матрицей для синтеза иРНК является ген в молекуле ДНК, с которого точно транскрибируется порядок нуклеотидов в гене с 3'- 5' конца. Считывание наследственной информации начинается с промотора, который расположен перед геном и включает около 80 нуклеотидов, у вирусов около 10 нуклеотидов ( один виток спирали). Фермент ДНК- зависимая РНК- полимераза узнает промотор прочно с ним связывается , « расплавляет» его, разъединяя нуклеотиды комплементарных цепей. По мере разъединения цепей ДНК, на одной из них – смысловой 5'-- 3' идёт синтез РНК ( рибонуклеозидтрифосфаты с помощью ферментов с отщеплением пирофосфатов связываются в цепь РНК).Участки гена, на которых прошёл синтез РНК , вновь соединяются, а синтезированная РНК постепенно отделяется от ДНК. В организме транскрибируются только те гены, продукт которых необходим в данный момент онтогенеза, т.е. около 10% генов. Синтезированная РНК называется « сырой» или проРНК, которая не может выйти в цитоплазму, пока не пройдут посттранскрипционные процессы – процессинг( сплайсинг, метилирование внутренних оснований и 5'- конца, к которому присоединяется остаток метилированного гуанина « колпачек»,играющй роль при связывании иРНК с малой субединицей рибосомы, а к 3'- концу присоединяется около 200 остатков адениловой кислоты). После этого иРНК выходит в цитоплазму. В цитоплазме идёт активация аминокислот, которые с помощью фермента – аминоацил тРНК синтетазы присоединяются к своим тРНК ( к акцепторному участку ЦЦА). «Нагруженная» тРНК в комплексе с белковыми факторами, ГТФ подходит к рибосоме.

Генетический код – система перевода нуклеотидной последовательности мРНК в аминокислотную последовательность первичной полипептидной цепи белка. В алфавите ДНК 4 буквы ( нуклеотиды), известно 20 основных аминокислот. Алфавитом нуклеотидов записываются трёхбуквенные слова (аминокислоты), которые затем объединяются во фразы (гены). Трёхбуквенное сочетание в ДНК – триплет, в РНК – кодон. Основные свойства генетического кода:

- триплетный;

- вырожденный, т.е. одной аминокислоте, как правило, соответствует более одного ( 1-6) кодона. В кодонах для одной аминокислоты первые два нуклеотида чаще всего одинаковые, а третий варьирует;

-универсальный, он един для всего живого;

- неперекрывающийся, нуклеотидная последовательность считывается в одном направлении подряд, триплет за триплетом. Кодоны не перекрываются;

- АУГ – стартовый кодон;

- УАГ, УАА, и УГА – кодоны терминаторы;

Трансляция. Передача с помощью генетического кода нуклеотидной последовательности мРНК в аминокислотную последовательность белковой молекулы в комплексе мРНК с рибосомами. В трансляции выделяют: инициацию, элонгацию и терминацию. Вначале рибосома состоит из двух отдельных субединиц. иРНК присоединяется к малой 30 S cубъединице. Трансляция начинается с кодона инициации- АУГ ( антикодон тРНК-УАЦ.кодирующий метионин). Затем присоединяется большая субъединица 50 S рибосомы,создаётся активный комплекс. В функционально активной 80S рибосоме имеются аминоацильный и пептидильный центры. Аминокислота метионин,которую кодирует стартовый кодон АУГ из аминоацильного центра переходит в пептидильный, освобождая место для следующей аминокислоты. Начинается элонгация. Поступившая следующая аминокислота с помощью фермента пептидилтрансферазы присоединяется своей аминогруппой ( NH₂ ) к карбоксильной группе (COOH) предыдущей, образуя пептидную связь (-CO – NH₂ - ). Рибосома перемещается на один кодон. На одной мРНК могут работать до 100 рибосом. Трансляция продолжается до тех пор пока в цепи нуклеотидов не появится кодон терминации, который блокирует трансляцию.

2. Регуляция синтеза белка у прокариот. На основании изучения синтеза ферментов у кишечной палочки французские генетики Ф. Жакоб и Ж. Моно предложили теорию индукции и репрессии белкового синтеза. По их теории гены, влияющие на синтез какого- то фермента или белка, расположены в молекуле ДНК последовательно друг за другом в порядке их влияния на ход синтеза ( структурные гены ). Перед структурными генами расположен ген оператор, а перед ним ген промотор ( прикрепляется РНК полимераза, осуществляет транскрипцию оперона ), на некотором расстоянии от них расположен ген регулятор, под контролем которого вырабатывается белок – репрессор с двумя специфическими участками: один для присоединения к оператору, другой для связывания с индуктором. В целом эта группа генов, определяющая синтез функционально связанных ферментов, называется – оперон. Синтез ферментов начинается под влиянием индуктора( определенное вещество, соединение, которое служит материалом для данного , или сходное с ним вещество. Индуктор соединяется с репрессором, инактивирует его. Ген оператор освобождается, начинается синтез иРНК на структурных генах и соответствующий синтез ферментов. Синтез идёт до тех пор пока в клетку поступает индуктор.

Существуют опероны аминокислот, азотистых оснований, анаболитических ферментов, которые функционируют по принципу обратной связи. В этом случае синтез ферментов идет до тех пор пока, пока конечного продукта в клетке недостаточно. Избыток продукта репрессирует синтез ферментов , участвующих в его образовании.

Механизм генной активности у эукариот. Механизм действия оперонов у прокариот возможен и для эукариот. Однако, механизмы регуляции генов у эукариот значительно сложнее и менее изучены:

-для эукариот характерна дифференциация органов и тканей, которые состоят из узкоспециализированных клеток и в них синтезируются белки определённого состава и функций , характерных для данной клетки, поэтому в них в активном состоянии будет только та часть генетической информации, которая необходима для синтеза строго определённых белков. Установлено, что у эукариот имеются гены , которые работают только в специализированных тканях ( ген – миозин в мышцах), гены ответственные за выполнение ограниченных функций ( ген- гемоглобин; кератин волос).

- репликация ДНК. Дифференцировка клеток определяет и способ их деления. Характер деления зависит от способности ДНК синтезировать белки, обеспечивающие репликацию ДНК и митоз (в нейронах, мышечных клетках, клетках печени репликация идет длительное время, наоборот, клетки эпителия кишечника, костного мозга довольно интенсивно делятся).

- Стабильность иРНК. В отличие от прокариот, у эукариот иРНК может длительное время находится в цитоплазме в виде информосом, т. е. для них характерно длительное и не одновременное протекание транскрипции и трансляции. Поэтому, у них возможно образование без ядерных клеток, которые нормально функционируют за счёт ранее синтезированных иРНК (превращение ретикулоцитов в эритроциты идет 6 суток, ядра у них отсутствуют, но синтез белков в них протекает на иРНК, которые образовались в ядрах на предшествующей стадии нормобласта)

-Каскадная регуляция генов. В клетке происходит одновременное включение и выключение большой группы генов, локализованных в разных хромосомах. Регуляция осуществляется под воздействием специализированных сигнальных веществ, которые синтезируются в клетках других тканей. Важное значение имеет гормональная регуляция активности генов ( инсулин – гормон поджелудочной железы- белок из одной полипептидной цепи, 51 аминокислота, регулирует генетический аппарат клеток печени, в которых синтезируются ферменты для нормального протекания двух противоположных процессов: синтеза глюкозы из не углеводистых веществ и гликолиза глюкозы и синтеза из неё гликогена. Соотношение комплекса ферментов этих систем и регулирует оптимальную концентрацию глюкозы в крови. Инсулин – индуктор, активирует оперон содержащий 3 структурных гена, синтезирующих ферменты необходимые для гликолиза и синтеза гликогена. Одновременно – репрессор четырех генов другого оперона, влияющих на синтез глюкозы). Различные гормоны стимулируют активность генов у с – х животных, следовательно, влияют на продуктивность.

На активность генов влияет цитоплазма дифференцированных клеток и белки гистоны. При дифференцировке клетка приобретает способность реагировать только на определённые раздражители и синтезирует лько те белки, которые необходимы для её функционирования, эти свойства клетка сохраняет последующих клеточных поколениях.

Взаимодействие генов в онтогенезе показывает, что каждый этап развития, ведущий к образованию зачатка новой ткани зависит от взаимодействия генов данной клетки с генами других клеток, что приводит к изменению цитоплазмы за счёт индуцирования тех генов, которые в конечном счёте приводят к дифференцировке, на молекулярном уровне путём транскрипции и трансляции.

Контрольные вопросы: 1. Что такое транскрипция? 2. Что такое трансляция? 3.Что такое сплайсинг? 4. Перечислите основные свойства генетического кода. 4. В чём сущность теории Жакоба и Моно. 5. Какие факторы влияют на генную активность у эукариот? 6. Сколько аминокислот содержит белок, если кодирующая часть, соответствующего ему гена, состоит из 3000 нуклеотидов?

 

 

Лекция 10.

 

Тема: Генетика микроорганизмов.

1.Микроорганизмы – объекты генетических исследований.

2. Строение и размножение микроорганизмов.

3. Взаимодействие фага с бактериальной клеткой.

4. Перенос генетической информации у микроорганизмов.

1. Микроорганизмы – объекты генетических исследований. Бактерии и вирусы стали объектами генетических исследований с 40-х годов прошлого столетия, после того как С. Луриа и М. Дельбрюк показали, как нужно проводить опыты с микроорганизмами, как вести учет их признаков и анализировать полученные результаты.

Преимущество микроорганизмов как генетических объектов: 1. простота их культивирования; 2. Короткий период их регенерации; 3. Огромная численность потомства( мутации 1 на 1 млн. клеток и реже); 4. Гаплоидный набор хромосом, совмещаются функции гаметы и особи. Классическими объектами генетических исследований стали Escherichia coli, salmonella, нейроспора и дрожжи, а среди вирусов- бактериофаги, поражающие эти виды бактерий и вирус табачной мозаики.

Строение микроорганизмов. Химический состав клеток бактерий в основном такой же, как и клеток высокоорганизованных организмов. Они окружены оболочкой, внутри которой находятся цитоплазма, ядерный аппарат, рибосомы, ферменты и др. включения. В отличие от клеток эукариот в клетках бактерий отсутствуют митохондрии, аппарат Гольджи, эндоплазматическая сеть. Цитоплазма – коллоид с зернистой структурой. Основная масса гранул – рибосомы с константой седиментации 70S. В центральной части цитоплазмы – нуклеоид и плазмиды. Нуклеоид- одна длинная молекула ДНК ( хромосома ). ДНК бактерий не отличается от ДНК высших организмов. При размножении клетки наиболее ответственным является воспроизведение нуклеоида. В нуклеоиде ДНК суперспирализована и одним концом прикреплена к клеточной мембране – мезосоме ( впячиванию клеточной оболочке внутрь) Связь с мембраной предполагают необходима для репликации ДНК и для разделения дочерних молекул. Репликация полуконсервативным способом. Репликация начинается со специального участка – источника репликации, который соединен с мезосомой. В месте прикрепления ДНК к мезосоме одна из цепей ДНК разрывается. Конец 5' наружной разорванной цепи ДНК прикрепляется рядом к новому месту мезосомы. Хромосома вращается против часовой стрелки за местом прикрепления ДНК к мембране. Репликация идёт в одном направлении. К моменту завершения репликации точки прикрепления дочерних ДНК отдвигаются благодаря активному росту участка мембраны. По окончании репликации образуется межклеточная перегородка.

Строение и размножение вирусов.Вирусы резко отличаются от всех известных форм жизни. Они очень малы ( от 20 до 450 нм). Вирусы содержат одну из нуклеиновых кислот, которая окружена белковой оболочкой (капсид). Геном может быть представлен двухцепочной, одноцепочной ДНК, одно или двухцепочной РНК. Молекулярная масса ДНК от 1,5 · 10⁶ до 1,6 · 10⁸ у РНК 1,6·10⁶ до 9·10⁶ Д. Молекулы нуклеиновых кислот могут быть линейными и кольцевыми. Кживым их относят потому, что они обладают изменчивостью,размножением, обменом веществ, к неживым из-за слишком малого размера,неспособности самостоятельно синтезировать собственные белки и самостоятельно размножаться. Их называют « ядовитые кристаллы». Вирусы суперпаразиты, они репродуцируются только внутри клеток какого-то организма, используя для этого все необходимые компоненты клеток. Вирусы инфицируют от одноклеточных организмов до человека. К настоящему времени лучше изучены вирусы паразитирующие в бактериях, их называют бактериофаги, и х размеры от20 до200 н.м.

Взаимодействие фага с бактериальной клеткой. Вголовке фага плотно упакована нуклеиновая кислота. На конце хвостового отростка име.тся специальные волоконца облегчающие прикрепление фага к бактериальной клетке. Заражение происходит если клетка чувствительна к вирусу.Хвостовым отростком фаг прикрепляется к оболочке клетки,которая растворяется с помощью фермента лизоцима. Хвосмтовой отросток сокращается и нуклеиновая кислота впрыскивается внутрь клетки. Фаги с опустевшей головкой остаются адсорбированными на оболочке клетки. Некоторое время после проникновения нуклеиновой кислоты в клетку фаги не обнаруживаются ( скрытый период). В этот период начинается синтез ранних белков необходимых для синтеза нуклеиновых кислот фага под контролем фагового генома. Синтезируется несколько сотен нуклеиновых кислот фага (частично из питательных веществ клетки и частично из деградированной ДНК клетки) Синтез всех ферментов и фаговых структурных белков контролируется фаговой ДНК, которую можно обнаружить через 8 – 9 мин. после заражения. К 12 мин. Синтез ранних белков прекращается. В конце латентного периода идёт сборка частей фага с образование полного капсида. После этого клетка лизируется и фаги попадают в окружающую среду. По характеру взаимодействия с бактериальной клеткой фаги делятся на вирулентные и авирулентные ( умеренные). Умеренные могут вызывать лизис клетки, но могут перейти в неинфекционную форму. Путём кроссинговера фаги встраиваются в геном хозяина и передаются в дочерние клетки. Существование в геноме хозяина профага называется – лизогенией. В одном случае на 10000 делений клетки фаг может выйти из генома перейти в вирулентную форму и лизировать клетку. Умеренные фаги могут быть дефектными,т.е. неспособны к образованию зрелых фагов и используются в генной инженерии (осуществляют трансдукцию).

Трансформация.Трансформацию открыл Гриффитс в 1928г. Явление трансформации было установлено у стрептококков, менингококков и целого ряда других бактерий. В процессе трансформации принимают участие две бактериальные клетки – донор и реципиент. Трансформирующий агент представляет собой часть молекулы ДНК донора, которая внедряется в геном реципиента, изменяя его фенотип. В процессе трансформации клетки донора и реципиента не соприкасаются друг с другом. Механизм переноса генетического материала заключаются в том, что из клеток донора выделяются в окружающую среду молекулы или фрагменты молекул ДНК. Сначала ДНК адсорбируется на оболочке клетки реципиента. Затем через определенные рецепторные участки ее стенки при помощи специальных клеточных белков ДНК втягивается внутрь клетки. Проникающая донорская ДНК должна быть двухцепочной. В реципиентной клетке она становиться одноцепочной. В ДНК включается одна из цепей трансформирующего фрагмента. Эта цепь вступает в синапсис с гомологичным участком хромосомы реципиента и встраивается в нее посредством кроссинговера. При этом участок ДНК реципиента замещается фрагментом донора. Молекула ДНК со вставкой трансформирующего участка оказывается гибридной. При следующем удвоении возникает одна нормальная дочерняя молекула ДНК, другая трансформированная.

Еще в начальном периоде изучения явления трансформации установлено, что способность бактерий- реципиентов к трансформации определяется их физиологическим состоянием. Такое физиологическое состояние было названо компетентностью. Состояние компетентности краткосрочно и приурочено к определенному времени клеточного цикла. Было обнаружено, что трансформирующей способностью обладают только крупные молекулы ДНК с молекулярной массой 10⁶Д и более. Кроме того, необходимо, чтобы ДНК была полностью или частично гомологична ДНК реципиента.

У бактерий трансформация имеет место в пределах одного вида, но наблюдается и между разными близкими видами. Это указывает на то, что у них сохранилась гомологичность некоторых участков ДНК.

Трансдукция. Перенос генов из одной бактериальной клетки в другую при помощи умеренных фагов называется трансдукцией. Впервые явление трансдукции Н.Д. Циндер и Дж. Ледерберг в 1952г. Они проводили исследования на патогенных для мышей бактериях Salmonella typhimurium. Были отобраны два штамма S. typhimurium: штамм 22А ауксотрофный, неспособный синтезировать триптофан (Т-), и штамм 2А, способный синтезировать триптофан (Т+). Эти штаммы засеивались в U-образную трубку, разделенную внизу бактериальным фильтром. В одно колено трубки засевали штамм 22А (Т-), в другое колено штамм 2А (Т+).После определенного периода инкубации бактерии штамма 22А, при посеве на минимальную питательную среду, дали небольшое количество колоний (частота появления трансдуцированных клеток была равна 1*10^-5). Это свидетельствовало о том, что некоторые клетки приобрели способность синтезировать триптофан.

Каким же образом бактерии могли приобрести это свойство? Контакт между ними исключался наличием бактериального фильтра. Возможность обратной мутации штамма 22А была маловероятной, так как он отличался большой стабильностью. Циндер и Леденберг пришли к выводу, что наследственная информация перенесена при помощи фага. Исследования показали, что штамм 22А был лизогенен по фагу Р22. Этот фаг освобождался из лизогенной культуры, проходил через фильтр и лизировал штамм 2А. Присоединив часть генетического материала штамма 2А, фаг возвращался обратно и передавал этот генетический материал штамму 22А. Последний приобретал специфические наследственные свойства штамма 2А, в данном случае способность синтезировать триптофан. Аналогичным образом могут быть трансдуцированы и многие другие признаки, в том числе способность к сбраживанию, устойчивость к антибиотикам и антигенные свойства.

Несколько позднее явление трансдукции было установлено у кишечной палочки и актиномицетов. Функции переносчика генетического материала выполняют Е. coli фаги лямбда (символ λ) и Р-1, у шигелл – Р- 1, у сальмонелл – Р-22.

Известны трансдуцирующие фаги и у других бактерий. Как правило, трансдуцируется один ген, реже два сцеплнных гена и очень редко три. При переносе генетического материала происходит замена участка молекулы ДНК фага. Фаг при этом теряет свой собственный фрагмент и становится дефектным. Включение генетического материала в хромосому бактерии реципиента осуществляется механизмом типа кроссинговера. Происходит обмен наследственным материалом между гомологичными участками хромосомы реципиента и материала привнесенного фагом. Различают три вида трансдукции: общую (неспецифическую), специфическую, абортивную. В результате неспецифической трансдукции в реципиентные клетки могут переноситься различные гены бактерии донора. При специфической трансдукции профаг включается в определенное место хромосомы бактерии и трансдуцирует определенные гены, расположенные в клетке донора рядом с профагом ( фаг λ трансдуцирует локус, обуславливающий способность к сбраживанию лактозы).В этом случае при отделении профагов от ДНК хозяина прилегающие к профагу бактериальные гены вместе с ним выщепляются из состава хромосомы, а часть генов профага остаются в её составе. Частота общей трансдукции составляет от 1 на 1млн. до 1 на 100млн. Специфическая трансдукция происходит чаще. Установлено, что фрагмент хромосомы донора, перенесенный в клетку реципиента, не всегда включается в хромосому реципиента, а может сохраняться в цитоплазме клетки, хотя и не размножается. При деление бактерий он попадает только в одну из дочерних клеток. Такое состояние получило название абортивной трансдукции.

Коньюгация. Коньюгацией называется передача генетического материала от одних бактерий другим при их скрещивании. Впервые процесс коньюгации у бактерий обнаружили Д. Леденберг и Э. Татум в 1946г. Они провели классический эксперимент, который заключается в следующем.

Были отобраны два ауксотрофных мутантных штамма Е. coli К-12: неспособный синтезировать метионин и биотин штамм Met¯ Bio¯ и неспособный синтезировать треонин и лейцин штамм Thr¯ Leu¯ . Оба штамма в течение ночи выращивали вместе на полноценной среде. Затем смешанную культуру центрифугировали, отмывали от полноценной среды и высевали на минимальной питательной среде без добавления метионина, биотина, треонина и лейцина появились прототрофные колонии Met+ Bio+ Thr+ Leu+ с частотой около 1 на каждые 10⁷ родительских клеток. Дополнительные эксперименты показали, что ни трансформации, ни трансдукции в данном случае не происходило. Из этого следовало, что образование рекомбинантных геномов бактерий происходило в результате контакта родительских клеток.

В 1952г. Хейс установил неравноценную роль родительских штаммов при коньюгации. Выяснилось, что один штамм является донором (мужским), а другой – реципиентом (женским). Клетки-доноры обладают половым фактором F. Он является коньюгативной плазмидой и представляет собой циркулярно замкнутую молекулу ДНК. Половой фактор F автономно существует в цитоплазме. Бактериальные клетки с фактором F обозначаются F+, не имеющего его – F-.Они неспособны быть донорами и являются реципиентами генетического материала.

При коньюгации клетки-доноры F+ или Hfr соединяются с клетками- реципиентами F- при помощи коньюгационного мостика – особой протоплазматической трубки, образуемой клеткой F+. В клетке донора Hfr под влияием фермента эндонуклеазы в точке внедрения фактора F происходит разрыв цепи ДНК. Свободный конец одной из цепей ДНК постепенной начинает передвигаться через коньюгационный мостик в клетку реципиента (F-) и сразу достраивается до двухцепочной структуры. На оставшейся в клетке-доноре цепи ДНК синтезируются вторая цепь. Для переноса всей цепи ДНК в клетку реципиента требуется при 37°С 90 – 100мин, но коньюгационный мостик очень хрупкий, легко разрывается и, как правило, вся цепь не успевает перейти. Поэтому и фактор F обычно не передается, так как располагается в конце хромосомы. С более высокой частотой передаются гены, расположенные около начальной О-точки хромосомы донора. Затем ДНК донора в гомологичных участках вступает в контакт с ДНК реципиента и в результате кроссинговера некоторые участки одной цепи ДНК реципиента заменяются фрагментами ДНК донора.

При коньюгации половой фактор вместе с фрагментом ДНК иногда переходит в женскую клетку, превращая ее в мужскую и передавая ей свойства, контролируемые фрагментом хромосомы донора. Процесс переноса генетической информации при помощи полового фактора называется сексдукцией.

Плазмиды. Кроме половых факторов, которые участвуют в скрещивании, большинство бактерий содержит также другие хромосомные элементы, называемые плазмидами. Они представляют собой кольцевые молекулы ДНК, обладают свойствами репликона: могут реплицироваться с помощью ферментов клетки бактерии независимо от основной хромосомы. Маленькие плазмиды включают 10-30 тыс. пар оснований, и в клетке имеется их от 10 до 100 копии. Большие плазмиды содержат до 100 тыс. пар оснований, но в клетке они представлены одной – двумя копиями.

Контрольные вопросы: 1. В чем преимущества микроорганизмов как объектов генетических исследований? 2.Понятие о генотипе и фенотипе бактерий. 3. Чем отличаются вирусы от бактерий? 4. Назовите отличия в генетической организации прокариот и эукариот. 5. Какими путями передается генетическая информация у бактерий. 6. Что такое сексдукция?

 

 

Лекция 11

Тема: Генетическая инженерия

Вопросы:

1. Получение и клонирование генов.

2. Векторы. Рекомбинантные молекулы ДНК.

3. Введение в клетку рекомбинантных ДНК и синтез чужеродного белка. 4. Соматическая гибридизация.

5. Использование достижений генной инженерии в животноводстве.

1. Получение и клонирование генов. Генетическая инженерия является новой отраслью молекулярной биологии, которая разрабатывает способы создания лабораторным путём генетических структур и получение наследственно изменённых организмов. Возникновение г. и. связано с прогрессом в развитии генетики, биохимии, микробиологии, молекулярной биологии. Это понятие более широкое,т.к. включает клеточную энзимологию по сравнению с генной инженерией.

Генная инженерия решает задачи: 1. Получение генов путём их синтеза или выделения из клеток. 2. Получение рекомбинантных молекул ДНК. 3. Копирование или размножения выделенных или синтезированных генов или генетических структур. 4. Введение в клетку генов или генетических структур и синтез чужеродного белка.

Получение генов: 1 Химическим путём. 2. Ферментативным путём 3. С помощью трансдуцирующих фагов. Впервые в 1969 г. в Америке Корано с сотр. Синтезировали ген аланиновой тРНК дрожжей химическим путём. Ген включал 77 пар нуклеотидов,соединённых в определенной последовательности ( лигазой) из фрагментов длиной 5-12 нуклеотидов. При введении в кишечную палочку или без клеточную среду ген не работал, т. к. не включал регуляторных элементов (промотора и терминальных концов). В 1976 г. по той же методике они синтезировали отрезок ДНК кишечной палочки, включавший ген супрессорной тирозиновой тРНК протяжённостью в 126 пар нуклеотидов с примыкающими к нему промотором -52 и терминатором – 21 парой нуклеотидов. К концам отрезка присоединили тетрануклеотиды ААТТ и ТТАА. При введении в кишечную палочку ген работал. Однако,этот путь трудоёмок и сложен, им синтезируют только короткие гены.

Ферментативный способ. В 1970 г. Темин, Балтимор, Мазутани обнаружили фермент обратную транскриптазу – ревертазу. В 1972 г. было открыто, что с помощью ревертазы некоторые онкогенные вирусы могут синтезировать ДНК, используя в качестве матрицы РНК. Затем установили, что матрицами для образования копий ДНК могут служить не только РНК онкогенных вирусов, но и др. РНК, даже синтетические полирибонуклеотиды. Это открыло принципиальные возможности ферментативного синтеза любых генов, используя их РНК копии. Под ферментативным синтезом имеют в виду транскрибирование комплементарной нити ДНК на молекуле РНК в пробирке.

Синтез генов с помощъю трансдуцирующих фагов. В конце 40- х годов прошлого века Чаргафф и Хотчкис показали, что ДНК содержит в небольшом количестве, так называемые минорные основания (5 – метилцитозин, 6 – метиламинопурин), их примерно 0,1% от всех оснований в кишечной палочке. Минорные основания образуются в результате метилирования ( добавления CH₃) цитозина и аденина после завершения репликации. С помощью метилазы бактерия метит ДНК созревших в ней фагов. Если в бактерию проникает фаг без прометилированных участков, то ферменты бактерии рвут ДНК фага на части и она становится не активной. Предполагалось, что эти ферменты узнают ту же последовательность нуклеотидов в ДНК, что и метилаза. Было выяснено, что такими ферментами являются рестриктирующие эндонуклеазы ( рестриктазы). Было выяснено, что участок ДНК который узнаёт эндонуклеаза включает специфическую последовательность из 4-6-8 пар оснований – палиндром- последовательность которая считывается одинаково в обоих направлениях, начиная с 3' конца каждой цепи. Например, рестриктаза E. co .R 1 узнаёт последовательность Г'ААТТ'Ц и режет её симметрично. Если ДНК была кольцевая, то становится линейной. Если на однонитевом участке, разрезанной ДНК, концы имеют последовательность АААА или ТТТТ, то такие концы называют липкими и они без дополнительной обработки с помощью ДНК –лигазы могут замкнуть разрезанную ДНК снова в кольцо. К настоящему времени открыто более 150 рестриктаз, которые позволяют разрезать молекулу ДНК на любые участки (гены) и снова сшивать её. Открытие ревертаз и рестриктаз, которые взаимно дополнили друг друга, послужило важнейшим событием в развитии молекулярной биологии. Биологи 70-е г. назвали эпохой двух Р. Г. Темин и Д. Балтимор в 1975г. за ревертазу, а А. Арбор, Г. Натанс, К. Смит за рестриктазу в 1979г. получили Нобелевские премии. Указанные ферменты позволили использовать индуцирующие фаги в качестве векторов для создания рекомбинантных молекул ДНК.

2. Векторы. Рекомбинантные молекулы ДНК. Рекомбинантные ДНК – это молекула ДНК искусственно полученная путём объединения фрагментов ДНК различного происхождения, как природных так и синтетических. Целью является включение определённых последовательностей ДНК в вектор для их репликации в клетке хозяина. Молекулы ДНК, способные акцептировать чужеродную ДНК и обеспечивающие её репликацию, а может быть и экспрессию называются векторными молекулами. При обычном введении ДНК в клетку, она подвергается атаке ферментов клетки, которые разлагают её до нуклеотидов. В некоторых случаях она «выживает» в клетке, но в процессе деления она не наследуется и теряется. Для того чтобы рекомбинантная ДНК стала составной частью генетического аппарата клетки, она должна встроится в её генетический аппарат и реплицироватся за её счёт или реплицироваться самостоятельно. Векторы – это устройства для доставки чужих генов в клетки различных организмов, т.е. осуществлять введение в клетку дополнительной генетической информации. К векторам предъявляются требования:

- он должен иметь область чувствительную к определённой рестриктазе, которая разрезает вектор, как правило в одном участке, превращая его кольцевую молекулу в линейную, к которой пришивают ген или гены, затем снова замыкают её в кольцо и рекомбинантную ДНК вводят в клетку;

- вектор должен реплицироватся в клетке;

- в составе вектора должен быть маркёрный ген, который после проникновения вектора в клетку, придаёт ей фенотип, свидетельствующий о присутствии вектора, т.е. вектор должен иметь селективный признак. ( в присутствии гена β - лактамазы бактериальная клетка приобретает устойчивость к пенициллину, и на среде с пенициллином образует колонии клеток , несущих данный ген, обычные клетки на данной среде погибают. Эффективными векторами являются плазмиды – Coli E1, фаги- λ, SV 40 и др.

3. Введение в клетку рекомбинантных молекул ДНК и синтез чужеродного белка. Основным методом введения рекомбинантных молекул в клетки кишечной палочки и др. бактерий является метод трансформации. Для осуществления трансформации разработаны специальные приёмы( высокотемпературное воздействие, обработка CaCl₂ и др). После транформации отбирают клетки с рекомбинантной ДНК путём: тестирования на резистентность к определенным антибиотикам; использования иммунологических тестов или выявления белка- продукта клонированного гена; гибридизации с зондом ДНК, комплементарным участку нужного гена. В качестве вектора используют космиды ( векторная плазмида, содержащая cos – сайт ДНК фага лямбда).

Этапы клонирования генов состоят из: рестриктазного разрезаеия ДНК, выделенной из организма, содержащего нужный ген; обработки теми же рестриктазами, которые использовались для разрезания ДНК; смешивания двух образцов ДНК и сшивание фрагментов ДНК- лигазой фага Т- 4; трансформации сшитыми молекулами клеток – хозяев; амплификации рекомбинантной ДНК в трансформированных клетках; отбора клеток с рекомбинантными ДНК вектора для клонирования, который может реплицироватся в клетке хозяина.

4. Соматическая гибридизация. Одно из направлений генетической инженерии. Сущность заключается в соединении лишённых оболочки соматических клеток или их частей с разными хромосомными наборами, т.е. далёких систематически форм ( человека и мыши и др.). Впервые гибриды среди соматических клеток в 1960г. обнаружил Ж. Барский. В культуре клеток двух линий мышей он выявил третий тип клеток, которые содержали хромосомы обеих исходных линий, по морфологическим и биохимическим свойствам клетки занимали промежуточное положение между признаками исходных линий. Спонтанное слияние соматических клеток происходит крайне редко, был найден вирус Сендай ( по фамилии автора), который способствует слиянию клеток. При слиянии двух клеток образуются клетки с двумя ядрами, после митотического деления формируются две одноядерные клетки с набором хромосом исходных родительских форм. Таким путём получают на только клоны гибридных клеток, но и целые растения (гибрид табака и петуньи ). Гибридные клетки могут размножаться длительное время, но межвидовая несовместимость проявляется и при соматической гибридизации, с течением времени в культуре клеток появляются клоны, которые утрачивают хромосомы второго вида, так у гибридных клеток человека и мыши через 100 последовательных делений утрачиваются хромосомы человека.

Использование соматической гибридизации: гибридомная технология получения моноклональных антител, которую разработали в 1975 г. лауреаты нобелевской премии Г. Келлер и К. Мильштейн.

Моноклональные антитела – это иммуноглобулины, синтезируемые одним клоном клеток. Моноклональное антитело связывается только с одной антигенной детерминантой на молекуле антигена.

Гибридомная технология – слияние с помощью полиэтиленгликоля лимфоцитов селезёнки предварительно иммунизированных определенным антигеном организмов с миэломными ( раковыми) клетками, способными к бесконечной пролиферации. Гибридные клетки селекционируют в среде ГАТ ( среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тидимин). Неслившиеся лимфоциты погибают в любой тканевой культуре. Миэломные клетки на этой среде так же погибают,т. к. они были дефектны по ГГФТ (гипоксантин-гуанозин- фосфорибозилтрансферазе). Отбирают клоны клеток, синтезирующие необходимые антитела, которые можно хранить в замороженном состоянии длительное время. Таким образом гибридомы представляют собой бессмертные клоны клеток, синтезирующие моноклональные антитела. Их используют в качестве диагностических средств против болезней.В терапии моноклональные антитела можно соединять с лекарством,благодаря специфичности антител они доносят это вещество непосредственно к раковым клеткам или патогенным микроорганизмам, что позволяет значительно повысить эффективность лечения. Используют моноклональные антитела против H – Y антигена для определения пола у крупного рогатого скота на предимплантационной стадии развтия, а так же стандартизации методов типирования тканей при трансплантации органов, при изучении клеточных мембран ( так были изучены антигены Т- лимфоцитов). Для построения антигенных карт вирусов, возбудителей болезней.Использование генной инженерии в животноводстве. Перспективно клональное размножение животных клеток для генетических манипуляций, но, в отличие от растительных клеток, взрослый организм из них вырастить нельзя, их используют для получения вакцин, интерферона, для изучения токсичности препаратов. В животноводстве важное направление генной инженерии связано с манипуляцией ранними эмбрионами на основе трансплантации.

Трансплантация- метод ускоренного воспроизводства высокопродуктивных животных путём переноса одного или нескольких эмбрионов от высокоценных животных менее ценным. Технология трансплантации включает: гормональное вызывание суперовуляции; использование быков,оцененных по качеству потомства; извлечение и оценку качества эмбрионов, сохранение и пересадку или криоконсервирование эмбрионов для дальнейшей пересадки. Трансплантацию используют в следующих целях: быстрого создания высокопродуктивных стад устойчивых к болезням; получения идентичных животных путем разделения ранних эмбрионов; сохранения мутантных генов малых популяций и генофонда пород; получение потомков от бесплодных, но генетически ценных по генотипу животных; выявление вредных рецессивных генов и хромосомных аномалий; повышение устойчивости животных к болезням; борьба с болезнями путём замены импорта животных на импорт криоконсервированных эмбрионов; определение пола эмбриона и получение животных определенного пола; межвидовые пересадки; получение химерных животных.

На основе трансплантации , методами эмбриогенетической инженерии в животноводстве получают: трансгенных, химерных животных, осуществляют клонирование и генную терапию.

Трансгенные животные – это животные в геном которых с использованием методов генной инженерии перенесена чужеродная ДНК. Трансгеноз – искусственный перенос генов (или ДНК) из бактериальных клеток в эукариотическую клетку (организм) с помощью трансдуцирующих фагов.

Методология получения трансгенных животных с заданными признаками состоит в следующем: клонированный ген вводят в ядро оплодотворённой яйцеклетки; инокулированные оплодотворённые яйцеклетки имплантируют в реципиентнуюженскую особь; отбирают потомков, развившихся из имплантированных яйцеклеток , которые имеют клонированный ген во всех клетках; скрещивают животных, несущих клонированный ген в клетках зародышевой линии. Трансгенные животные могут быть получены с использованием ретровирусных векторов, методом микроинъекций ДНК, путём использования модифицированных эмбриональных стволовых клеток.Метод микроинъекций ДНК. Для получения трансгенных животных таким методом необходимо: вызвать гиперовуляцию у самок ( используют сыворотку жерёбых кобыл, а потом хорионический гонадотропин человека); скрестить самок с гиперовуляцией с самцами и вымыть у них оплодотворённые яйцеклетки; провести микроинъекцию ДНК в оплодотворённые яйцеклетки; оплодотворённые яйцеклетки ввести « суррогатным матерям». Следующий этап – идентификация трансгенных животных с помощью блот – гибридизации по Саузерену методом ПЦР. Скрещивая трансгенных животных получают трансгенную гомозиготную линию. Однако при использовании этого метода получают всего лишь около 5% жизнеспособных трансгенных животных. При этом ДНК может интегрироваться в разные места генома, у некоторых животных трансген не эспрессируется.

Метод модификации эмбриональных стволовых клеток. У мышей клетки, взятые на стадии бластоцисты, могут дифференцироваться в любую ткань. Эти клетки называются эмбриональными стволовыми клетками ( ЕS) . Эти клетки у мышей ( стадия бластоцисты) можно генетически модифицировать, встроив в них функциональный трансген. Потом ES – клетки микроинъецируют в бластоцисту реципиента, которую имплантируют в матку « суррогатных» матерей. Трансгенные птицы: Из бластодермы выделяют клетки, трансфицируют их нужным трансгеном и вводят в подзародышевую область облучённой ( лучами рентгена) бластодермы. Получают некоторое количество особей, несущих трансфекцию в клетках зародышевой линии. Последние могут стать родоначальниками трансгенных линий. Трансгенных кур можно использовать для получения высокогомозиготных линий по устойчивости к вирусным инфекциям, кокцидиозу, с высокой конверсией корма, с низким уровнем жира и холестерина в яйце и т. д. Трансгенные овцы, козы и свиньи. Одной изважных задач моекулярной биотехнологии является создание трансгенных животных –« биореакторов» для получения нужных белковых продутов, в т. ч. для медицины. Были созданы трансгенные овцы и козы, способные секретировать в молоке белки человека. Имеются овцы с повышенной скоростью роста шерсти ( кДНК овечьего инсулиноподобного фактора роста 1 поместили под контроль мышиного промотора гена кератина с высоким содержанием серы, в результате наблюдалась гиперэспрессия кДНК). В геном свиньи введена генетическая конструкция: регуляторная область гена β - глобина человека, два гена α₁ - глобина человека и один ген β^А - глобина человека. У трансгенных свиней в клетках крови синтезировался в большом количестве человеческий гемоглобин, после очистки его можно использовать для замены крови. От трансгенных овец и коз получают молоко с α₁ - антитрипсином человека, фракционируют белки молока и выделяют чистый ААТ белок человека. Однако получение трансгенных животных пока мало эффективно, только у 5% животных экспрссируется ген человека, из них половина самок,человеческий белок секретируется у малого количества животных. Для повышения эффективности трансгенных животных необходимо клонировать. Особенно перспективно можно использовать трансгенных коров для получения с молоком нужного продукта в необходимых количествах, например человеческого инсулина, белка С, использующегося для предотвращения тромбообразования, фактора IX ( фактора Кристмаса) каскадного механизма свёртывания крови.который необходим больным гемофилией людям.

Химерные животные. Химера – организм, включающий клетки, ткани и органы разных организмов. Польский эмбриолог А. Тарковский разработал метод получения химер ( аллофенных животных) путём слияния различающихся по генотипу эмбрионов (агрегационный метод), английский эмбриолог Р. Гарднер предложил инъекционный метод, предусматривапющий внесение в эмбрионы клеток от другого организма. Мозаицизм у химер наблюдается только в одном поколении, а их потомки не являются мозаиками. Получены межвидовые химеры овцы ( 2n= 54) и козы (2n=60), получен теленок – химера из четырёх половинок двух разных 5- дневных эмбрионов. Масть у телёнка была как у швицкой и голштинской пород, что служит доказательством химеризма. Изучение химер позволит проследить процесс реализации генома в фенотипе животных. Эффективность- в эксперименте из 24570 овоцитов было получено только два телёнка.

Клонирование млекопитающих. Клонирование – совокупность методов, использующихся для получения клонов, путём пересадки ядер соматических клеток в оплодотворённое яйцо с удалённым пронуклеусом, что указывает на плюрипотентность дифференцированных клеток. В 1997 г. Уилмут с сотр. Клонировали овцу Долли методом переноса ядра эпителиальной клетки молочной железы от 6 - летней овцематки породы финский дорсет. Выращивая в культуре клетки, индуцировали их переход в стадию G₁ (критическую). От овцематки шотландской черноголовой породы были взяты яйцеклетки, из которых удалили ядра. В энуклеированные яйцеклетки инъэцировали ядра и воздействовали жэлектрическим разрядом. В культуре клеток или в яйцеводе, с наложенной лигатурой, их культивировали 7 дней, а потом эмбрионы в стадии бластоцисты имплантировали в «суррогатную мать). В эксперименте из 434 яйцеклеток была получена только одна овца Долли, генетически идентичная донору породы финский дорсет. Клонирование животных путём переноса тотипотентных дифференцированных клеток иногда ведёт к снижению жизнеспособности. Не всегда клоны являются точной копией донора из –за изменений наследственного материала и влияния условий внешней среды, варьирует живая масса, темперамент и др.

Генная терапия. Генная терапия направлена на коррекцию генетических дефектов только соматических клеток, поэтому такую процедуру необходимо проводить в каждом поколении. Генная терапия ex vivo предусматривает: получение клеток от больного; исправление генетического дефекта с помощью переноса нужного гена в изолированные клетки; отбор и размножение генетически « исправленных» клеток; инфузия или трансплантация таких клеток пациенту. Генная терапия in vivo предусматривает доставку « терапевтического» гена в клетки ткани пациента. Для этих целей используют вирусные системы доставки: ретровирусные векторы, аденовирусные векторы, векторы на основе аденоассоциированных вирусов, векторы на основе вируса простого герпеса.

Не вирусные системы доставки генов в клетки пациентов: прямое введение путем инъекции ДНК- конструкции в клетки- ткани мишени, в дальнейшем возможно использование в качестве вектора искусственных хромосом, содержащих теломеры, центромеру и точки инициации репликации; использование небольших олигонуклеотидов, способных гибридизироваться с мРНК или специфическим геном, снижая уровень транскрипции или трансляции и уменьшая количество синтезируемого белка (при раке, воспалении, вирусных и паразитарных инфекциях), когда наблюдается гиперфункция нормального белка.

«Антисмысловые» мРНК, которые могут использоваться в качестве лекарственных средств, связываются с мРНК и подавляют трансляцию кодируемого ею белка. Возможно использование и «антисмысловых» олигонуклеотидов как лекарственных средств для лечения вирусных инфекций, малярии, или частично подавляют экспрессию генов наследственных болезней. Разрабатываются подходы к коррекции генетических дефектов в мутантном гене на нужную пару.

Контрольные вопросы: 1.Что такое генетическая инженерия? 2.Какими методами синтезируют гены? 3. Что такое вектор в генной инженерии? 4. Что такое рекомбинантная молекула ДНК, с какой целью они создаются ? 5. Какими путями вводятся рекомбинантные ДНК в клетку? 6. С какой целью создаются трансгенные животные? 7 Что такое химеры? 8. В чём сущность клонирования и генной терапии

 

 

Лекция 13

Тема: Мутационная изменчивость.

Вопросы :

1.Теория мутаций.

2. Типы мутаций и их проявление ( классификация мутаций, генные, хромосомные, геномные мутации).

3. Индуцированный мутагенез и его использование

4. Роль репарирующих систем в мутагенезе.

Теория мутаций. Удвоение генетических структур ( репликация) происходит с удивительной точностью, что приводит к постоянству видов. Однако если бы это происходило всегда, то не было бы генетической изменчивости, не было бы эволюции. В действительности стабильность генетического материала при репликации не абсолютна, действуют факторы внешней среды, которые приводят к его изменению. Генетически стойкие изменения в генах и хромосомах называют мутациями. Процесс возникновения, развития и проявления мутаций называется мутагенезом. Измененный организм – мутантом. Впервые скачкообразные изменения наследственных форм было выявлено русским ботаником С.И.Коржинским, который обосновал мутационную теорию эволюции в своём труде « Гетерогенезис и эволюция , 1899г.).

Мутационную теорию сформулировал Гуго Де Фриз, который ввёл понятие мутация. Основные положения его теории мутаций: мутации возникают внезапно, как дискретные изменения признака; новые формы стабильны; в отличие от ненаследственных изменений мутации не образуют непрерывных рядов не группируются вокруг какого- либо среднего типа. Они являются качественными изменениями; мутации проявляются по разному, могут быть как полезными, так и вредными; вероятность обнаружения мутаций зависит от размера выборки исследуемых особей; сходные мутации могут возникать неоднократно. Г. ДЕ фриз ошибался, полагая, что мутации могут сразу давать начало новым видам. минуя естественный отбор. Экспериментальное подтверждение скачкообразности наследственных изменений получил В. Иоганнсен, изучая количественные признаки в чистых линиях фасоли.

3.Классификация мутаций. Мутации классифицируют: по отношению к направлению эволюции; по характеру выражения признака; по локализации в клетке; по степени вовлечения генома в мутационный процесс; по характеру источника вызывания мутаций; по локализации в организме; по уровню проявления в системе клетки и организма; по направлению мутирования в отношении исходных форм. Основной классификацией считают классификацию по степени вовлечения генома в мутационный процесс в которой выделяют: генные, хромосомные и геномные мутации.

Генные мутации. Генными или точковыми мутациями называют изменения структуры молекулы ДНК на участке определённого гена ( в определённом локусе), в результате которых из существующего аллеля образуется новый. Механизм генной мутации можно свести к нескольким главным случаям: замещение одного пурина или пиримидина из пары другим ( транзиция); замещение пурина пиримидином и наоборот ( трансверсия); утрата или приобретение новой нуклеотидной пары (делеции или вставки). Единицей мутации служит нуклеотид. Ген ( структурный ген), напротив, обозначается как сумма нуклеотидных пар, контролирующих синтез определённого белка. В этом случае ген не является единицей функции, мутации и рекомбинации ( Иоганнсен, 1903). Безнер (1955) разграничил эти понятия, обозначив их как: цистрон -единица функции, мутон – ед. мутации и рекон- ед. рекомбинации. Старое понятие ген больше соответствует цистрону, мутон – одному, а рекон одному или нескольким нуклеотидам. В зависимости от от того мутируют ли внутри гена одинаковые или разные нуклеотиды, говорят о гомологичных или гетерологичных аллелях. Внутригенная рекомбинация возможна между гетероаллелными мутантами. Несмотря на эти чёткие различия мы будем, из практических соображений, использовать термин «ген» в общем смысле. Для транзиции существует две возможности, для трансверсии – 4. По стереохимическим причинам транзиции встречаются чаще чем трансверсии. Указанные мутации приводят к усилению, ослаблению или полной утрате функции гена. При делециях или вставках в большинстве случаев происходит утрата функциональной активности гена, поскольку с точки локализации мутации и до конца гена считывание оснований происходит ошибочно, а в случае нонсенс кодо на образование полипептидной цепи прекращается. Наряду с транзициями и трансверсиями различают инверсии (поворот на 180⁰ ) и транспозиции- перенос пар оснований на новое место. Генные мутации,как правило, рецессивны, за исключением Х – хромосомы у гетерогаметных особей. Фенотипическое проявление мутации зависит от того на каком участке произошла вставка или выпадение нуклеотидов. Если вблизи промотора, то транскрибируется сильно измененная иРНК, транслируется испорченная полипептидная цепь белка и белковая молекула не выполняет свои функции- инактивируется. Если мутация затрагивает конечный участок, это не приводит к инактивации молекулы, но влияет на качество белка и приводит к изменению признака или свойства. По характеру влияния на транскрипцию и трансляцию выделяют: миссенс – мутации ( транзиции, трансверсии). В результате изменяется физиологическая роль белка, что создаёт фон для естественного отбора; нонсенс- мутации- внутри гена появляются терминирующие кодоны, что приводит к прекращению трансляции; сдвиг рамки считывания- возникает при появлении внутри гена вставок и делеций, что приводит к изменению смыслового состава гена. Многие качественные признаки обусловлены спонтанными генными мутациями (летальные факторы, наследственные аномалии). Они характеризуются простым менделеевским типом наследования. Генные мутации могут возникать как в одном, так и в нескольких генных локусах хромосомы. В этом случае возникают новые аллели данного гена, происходит мутационное изменение фенотипического проявления признака, возникает множественный аллелизм. Например, глобин- замена одной из 300 аминокислот обуславливает новый тип гемоглобина, которых около 300. Множественный аллелизм определяют методом определения критерия аллелизма: если при скрещивании двух мутантов F ₁ в F₂ расщепление 3 : 1- множественный аллелизм, 9 : 7 мутировали разные гены.

Хромосомные мутации. Изменения кариотипа могут быть количественными, структурными и одновременно и теми и другими.

Структурные мутации хромосом ( аберрации ). Эта группа мутаций связана с изменениями формы, размеров хромосом, порядка расположения генов ( изменение групп сцепления ), утратой или добавкой отдельных фрагментов и т. д. Характер хромосомной перестройки во многом зависит от состояния хромосомы в момент воздействия мутагенного фактора. Если хромосома находится в состоянии одной нити ( G₁, анафаза и телофаза митоза), то в последующий период ( S) она удваивается и аберрация сохраняется в обеих хроматидах ( хромосомные аберрации). Если мутаген действует на хромосому, находящуюся в состоянии одной нити (S, G₂ интерфазы, профазы и метафазы митоза) аберрация может произойти в одной хроматиде, в этом случае возникают хроматидные перестройки. Установлено несколько типов структурных мутаций хромосом:

Межхромосомные аберрации – транслокации – перемещение отдельных фрагментов хромосом из одного участка в другой, обмен фрагментами между разными хромосомами, слияние хромосом. При взаимных обменах фрагментами между гомологичными и не гомологичными хромосомами возникают реципрокные транслокации. Если целое плечо одной хромосомы присоединяется к концам другой хромосомы, то образуется тандемная транслокация. Слияние двух акроцентрических хромосом в области ценромер формирует транслокацию Робертсоновского типа. При этом образуются мета или субметацентрические хромосомы. Различают 3 варианта возникновения тРт: реципрокный- большая часть плеча одной хромосомы присоединяется к короткому плечу другой хромосомы; разрыв центромер двух хромосом; разрыв коротких плеч двух хромосом и объединение длинных плеч с обеими центромерами. Транслокации не изменяют число генов в данном генотипе и не всегда проявляются в фенотипе, но у особей гетерозиготных по транслокации нарушается конъюгация гомологичных хромосом и образуются не жизненные гаметы. Транслокации широко распространены среди животных. С ними связывают интерсексуальность, недоразвитие гонад, пороки развития, бесплодие. У КРС описаны 17 различных сочетаний тРт, чаще 1⁄ 29, которая зарегистрирована у 30 пород. У мышей отмечен положительный эффект тРт, мыши быстрее находили выход из лабиринта, это объясняется конкретным эффектом положения гена.

Внутри хромосомные аберрации ( делеции, дефишенси, дупликации, инверсии, фрагментации).

Делеции (Dl) – выпадение участка хромосомы в средней её части, содержащий комплекс генов.

Дефишенси – выпадение концевого участка хромосомы – концевая нехватка. Если делеция или дефишенси захватывают небольшой участок это приводит к изменению признака ( жёлтое тело и белые глаза у дрозофилы) Крупные делеции летальны. Крупная делеция (Dl 21) у человека вызывает тяжёлую форму белокровия.

Дупликации (Dp) – удвоение участка хромосомы, которые возникают в результате неравного кроссинговера, или как следствие амплификации генов. ОбычноDp не оказывают сильного влияния на фенотип особи, но увеличение дозы гена может вызвать изменение признака ( Bar – полосковидные глаза у дрозофилы).

Инверсии ( In) – переворот фрагмента хромосомы на 180 ^{0 .} Различают пара и перицентрические инверсии, последние в перевернутом фрагменте содержат центромеру. Материал хромосомы при In не изменяется, но в мейозе, в следствии аномальной конъюгации хромосом возможно возникновение до 50% неполноценных гамет, что приводит к стерильности; In подавляет кроссинговер, что содействует снижению уровня генетической рекомбинации, вызывает значительные изменения положения генов, что может привести к летальному исходу при их гомозиготном состоянии; способствует дифференцировке видов, их обособлению в процессе эволюции.

Фрагментация ( F) – происходит в результате разрыва хромосом или хроматид в нескольких местах одновременно, и образования отдельных фрагментов с потерей тех из них, которые не содержат центромеры. Как правило F приводит к летальному исходу.

Кольцевые хромосомы возникают при наличии двух дефишенси ( концевых нехваток).

Изохромосомы возникают когда в противоположность нормальному делению хроматид в длину, происходит горизонтальное поперечное деление хромосомы в центромере с последующим слиянием гомологичных плеч в новую хромосому – изохромосому, проксимальные и дистальные концы которой идентичны по составу генов.

Геномные мутации или мутации плоидности.

Наряду со структурными могут быть и количественные изменения хромосом. Геномными называют мутации, при которых происходят количественные сдвиги в хромосомном наборе клетки независимо от того, идет ли речь об изменеии числа хромосомных наборов или числа отдельных хромосом. Все количественные отклонения от нормы в гаплофазе или диплофазе объединяют понятием гетероплоидии, в противоположность гомоплоидии (исходная ситуация). Гетероплоидия встречается в форме эуплоидии или анеуплоидии.

Эуплоидии. Эуплоидными считаются клетки или особи, имеющие полные наборы хромосом одинаковые во всех клетках, а так же те, в которых отмечается увеличение численности хромосомных наборов в целое число раз. Число хромосом в гаплофазе, т.е. наименьшее гаплоидное число хромосом каждого полиплоидного ряда называется основным ( n или х у Бакая). К эуплоидиям относят гапло, поли, аллоплоидию ( гапло, ди, три, тетраплоиды), т.е. когда хромосомный набор представлен целым числом раз.

Гаплоидия. Гаплоидные формы возникают в результате нарушения процесса оплодотворения, когда в этом процессе не участвует мужская гамета ( истинный партеногенез), либо эта гамета генетически неактивна (гиногенез), при элиминации материнского хромосомного набора развивается зигота с отцовским набором (андрогенез). У истинно гаплоидных животных развитие во всех случаях быстро останавливается, часто на первых стадиях дробления, в этих случаях часты случаи недоразвития и уродств.

Полиплоидия – геномные мутации обусловленные, кратным гаплоидному,изме