Сложные методы окраски основаны на особенностях физико-химического строения микробной клетки. Сущность этих методов заключается в воздействии на мазок двух красящих веществ, из которых одно является основной, главной краской, а другое дополнительной - контраст. После воздействия первой краской мазок обесцвечивают и только после этого подвергают дополнительной окраске. В качестве обесцвечивающих веществ может быть применен целый ряд химических реагентов (кислоты, щелочи, спирт, ацетон и др.). Обмывание мазка простой водой также является в какой-то степени чисто механическим процессом обесцвечивания, но для этого необходимо продолжительное время; кроме того, обесцвечивание получается неполное. По отношению к обесцвечивающим веществам можно разбить микробов на группы легко и трудно обесцвечиваемых, Не все виды микробов одинаково относятся к обесцвечивающим реагентам; некоторые являются кислото - и спиртоустойчивыми, другие только кислотоустойчивы. Наконец, некоторые, как, например, споры, энергично противостоящие воздействию всех обесцвечивающих веществ, относятся к группе краскоустойчивых.
Сложные методы окраски имеют важное дифференциально-диагностическое значение для характеристики изучаемого микроба.
Окраска по Граму
1. На фиксированный мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги пропитанной 1%-ым спиртовым раствором генцианвиолета. Наносят на бумажку 2-3 капли воды. Окрашивают 2-3 минуты.
2. Бумажку снимают и, не промывая препарата водой, наносят раствор Люголя на 2 минуты.
3. Сливают раствор Люголя и препарат обрабатывают 96%-ным этиловым спиртом в течение 20-30 секунд.
4. Тщательно промывают мазок водой.
5. Окрашивают мазок фуксином Пфейффера в течение 2-3 минут.
6. Препарат промывают водой.
7. Высушивают и микроскопируют.
Грамположительные микроорганизмы окрашиваются в фиолетовый цвет, а грамотрицательные - в розовый.
Этот метод позволяет все микроорганизмы дифференцировать на две группы: грамположительные (гр+) и грамотрицательные (гр–).
Сущность окраски по Граму состоит в том, что отношение к краскам зависит от химического состава клетки и структурных особенностей клеточной стенки (наличие муреина и частично липида). В составе клеточной стенки грамположительных микроорганизмов большое количество муреина, воздействие этиловым спиртом вызывает разбухание муреина, что приводит к уменьшению диаметра пор и снижению проницаемости клеточной стенки. Поэтому не происходит вымывания красителя и обесцвечивания микробной клетки. В клеточной стенке грамотрицательных микроорганизмов муреиновый слой меньших размеров, диаметр пор больше и спирт легко проходит через клеточную стенку, вымывая краситель. Микробная клетка принимает цвет дополнительного красителя (красный). Кроме того, в поверхностном слое грамположительных микроорганизмов находиться магниевая соль рибонулеиновой кислоты, которая в присутствии йода в кислой среде образует прочное соединение с основными красителями. Это так же препятствует обесцвечиванию их спиртом.
Пример: Escherichia coli (кишечная палочка) и Salmonella cholerae suis (возбудитель сальмонеллеза свиней) - грамотрицательные и окрашиваются в розово-красный цвет. Listeria monocitogenes (возбудитель листериоза), Streptococcus ecqui (возбудитель мыта) - грамположительные и окрашиваются генцианвиолетом в фиолетовый цвет.
Окраска кислотоустойчивых микроорганизмов
В природе существует группа микроорганизмов, устойчивых к действию кислот, щелочей и спиртов. Они относятся к роду Mycobacterium (возбудители туберкулеза, паратуберкулеза крупного рогатого скота, проказы человека). Химическая структура цитоплазмы и клеточной оболочки микроорганизмов данной группы отличается содержанием значительного количества жировосковых веществ, в частности стеариновых кислот (в том числе фтионовой кислоты до 40%), поэтому проникновение красителя в клетку затруднено. Для их окраски используют протравливание (нагревание мазка с красителем над пламенем). Окрасившись, они прочно удерживают краску и не обесцвечиваются кратковременным действием кислоты.
Окраска по Циль-Нильсену
1.Фиксированный на пламени мазок покрывают полоской фильтровальной бумаги, наливают на нее карболовый раствор фуксина и подогревают; при появлении паров прекращают нагревание и оставляют краску на препарате еще на несколько минут (2-3 минуты). Дав препарату остыть, удаляют пинцетом бумажку и обмывают мазок водой.
2.Обесцвечивают препарат 5-10 % водным раствором серной кислоты в течение 3-5 секунд (до желтоватого оттенка мазка). Вместо серной кислоты можно применить 5 % раствор азотной или 3 % раствор соляной кислоты.
3.Мазок тщательно промывают водой.
4.Споласкивают 96°спиртом.
5.Снова промывают водой.
6.Докрашивают в течение 3-5 минут леффлеровской метиленовой синькой или водным раствором 1: 1000 малахитовой зелени или метиловой зелени.
7.Краску смывают водой и препарат высушивают.
Микроскопическая картина: туберкулезные палочки - рубиново красные, остальные, за исключением возбудителя паратуберкулеза, кислото - и спиртоустойчивых сапрофитов, - синие.
Для обесцвечивания мазков при окраске по Циль-Нильсену вместо растворов кислот и спирта особо рекомендуется применение солянокислого алкоголя (соляной кислоты - 3 мл+96° спирта - 97 мл) до слабо заметного розоватого оттенка препарата. После этого мазок ополаскивают водой и докрашивают метиленовой синькой и т. д. по основной прописи. Указанным методом достигается одновременное испытание бацилл на кислото - и спиртоустойчивость. Среди видов кислотоустойчивых сапрофитов встречаются спиртоподатливые разновидности, палочки же туберкулеза и паратуберкулеза всегда кислото - и спиртоустойчивы.