Сутью электрофореза является перемещение заряженных частиц, растворенных или суспендированных в электролите. Исторически, развитие метода электрофореза пошло по двум направлениям. В первом, названном свободным электрофорезом, для разделения использовались среды без геля. До недавнего времени этот метод широко не применялся как структурный метод, поскольку сложные взаимодействия между заряженными молекулами, растворителем, подвижными солями и внешним электрическим полем очень затрудняли интерпретацию полученных данных.
Другое направление объединяло различные электрофоретические методы в поддерживающей среде из различных носителей. Двумерный электрофорез в полиакриламидном геле обеспечивает самое высокое разрешение в белковом анализе и, следовательно, является основным методом в «протеомике». Метод капиллярного электрофореза (CE – от англ. Capillary electrophoresis) получает все большее применение как аналитический метод в различных областях исследований. Привлекательной чертой этого метода является короткое время анализа, высокая разрешающая способность, возможность работы в реальном режиме времени и автоматическое введение образца в минимальном (мкл) объеме.
Появился также новый метод для разделения макромолекул, капиллярная электрохроматография (CEC – от англ. Capillary electrochromatography), который является гибридом методов высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC – от англ. High performance liquid chromatography) и капиллярного фореза. Метод CEC сочетает лучшие свойства каждого из них. Как в HPLC он делит незаряженные частицы, также как в методе CE он обеспечивает высокоэффективное разделение заряженных частиц без использования насосов высокого давления.
В этой Лекции мы сначала обсудим метод свободного электрофореза в растворе. Недавние инновации в этом методе вселяют надежду на его использование для разделения относительно больших и сильно заряженных биологических макромолекул. Затем мы вернемся к обсуждению различных типов оборудования для электрофоретического разделения макромолекул, уделив особое внимание капиллярному электрофорезу и их применению для решения различных аналитических проблем.
Имеется три способа получения информации о структуре частиц, находящихся в электрическом поле (Таблица 26.1). Первый базируется на измерении их подвижности в постоянном электрическом поле. Абсолютное значение электрофоретической подвижности может быть измерено по перемещению электрофоретической границы, т.е. методом свободного электрофореза. Этот метод подобен методу скоростной седиментации.
Второй, базируется на электрофоретическом прохождении тонкого слоя или зоны макромолекулярного раствора через среду. Среда действует по принципу молекулярного сита и обеспечивает стабильность против конвекции. Процесс подобен таковому при делении методом зонального центрифугирования в градиенте сахарозы.
Третий базируется на измерении ориентации, которая возникает, когда молекулы, имеющие асимметричное распределение заряда, помещаются в переменное электрическое поле. Вращающий момент стремится ориентировать молекулу по направлению поля. Ориентация частиц под влиянием электрического поля называется эффектом Керра.
Таблица 26.1. Современные методы электрофореза
| Экспериментальный метод | Условия эксперимента | Вычисляемые параметры | Аналогия с гидродинамическими методами |
| Подвижная электрофоретическая граница | Свободный электрофорез | Электрофоретическая подвижность | Скоростная седиментация |
| Одномерный капиллярный электрофорез | Свободный электрофорез | Электрофоретическая подвижность | Скоростная седиментация |
| Равновесный электрофорез | Аналитический электрофорез в пространстве, ограниченный мембраной | Коэффициент диффузии, заряд | Диффузия с использованием ультрацентрифужной ячейки, формирующей границу |
| Изоэлектрофокусировка в геле | Градиент pH | Изоэлектрическая точка, в которой подвижность молекул равна нулю | Равновесное центрифугирование в градиенте плотности |
| Зональный одномерный электрофорез в геле | Додецил сульфат натрия (SDS) | Разделение в соответствии с фрикционными свойствами (массой) | Равновесное центрифугирование в градиенте плотности |
| Зональный двумерный электрофорез в геле | Градиент pH (первое направление)+SDS (второе направление) | Разделение в соответствии с зарядом (первое направление) и фрикционными свойствами (масса) (второе направление) | Равновесное центрифугирование в градиенте плотности |
В таблице 26.1 представлены методы электрофореза, используемые в настоящее время в научных исследованиях (колонка 1). В ней приведены также условия эксперимента (колонка 2), вычисляемые параметры (колонка 3) и аналогичные явления, встречающиеся в гидродинамике (четвертая колонка).