Электрофоретические методы в отсутствие поддерживающей среды: свободный электрофорез

Свободный электрофорез

Различные методы электрофореза пока широко не используются в качестве зонда структуры. Причина проста: сложные взаимодействия между ионами, растворителями, солями, гелем (если последний присутствует) и внешнее электрическое поле усложняют интерпретацию электрофоретической подвижности. Однако при отсутствии геля, в методе электрофореза в растворе, который мы в дальнейшем будем называть свободным электрофорезом (FFE – от англ. Free-flow electrophoresis), интерпретация данных может быть более однозначной. Развитие аналитического электрофореза в мембранной геометрии и капиллярного электрофореза показало, что метод FFE может эффективно применяться для исследований относительно больших и сильно заряженных биологических макромолекул. FFE также является эффективным методом для разделения макромолекул в потоке. В этом методе переносящий вещество буферный раствор заключается между двумя вертикальными пластинами, находящимися на близком расстоянии друг от друга. Электрическое поле прилагается перпендикулярно переносящему потоку, в то время как раствор образца вводится непрерывно в переносящий буфер в виде узкой полосы. Компоненты образца впоследствии разделяются в электрическом поле в поперечном направлении в соответствии с их электрофоретической подвижностью, и затем отбираются на выходе (рис. 26.2).

 

Рис 26.2. Принцип работы метода FFE. Объяснения в тексте

Этот метод очень хорош для работы с белками и клетками, поскольку в нем не используются органические растворители, высокие концентрации солей или поддерживающие среды.

 

Метод движущейся границы

В электрофоретическом эксперименте на частицу действуют четыре силы (рис. 26.3). Первая это электростатическая сила F₁ = Q E.Вторая – гидродинамическая сила трения F₂ = f_пост u, где f_пост – коэффициент поступательного трения, а u скорость частицы. Третья сила F₃ возникает в результате тенденции макроионов быть окруженными противоионами, в результате чего поток противоионов движется в направлении, противоположном их движению. По этой причине макроионы всегда движутся против потока так, что их скорость по отношению к их непосредственному окружению будет выше, чем таковая в лабораторной системе координат. И наконец, четвертая сила, F_4, возникает при искажении ионной атмосферы (эффект асимметрии поля). Эта сила обусловлена дипольным моментом, который возникает при перераспределении противоионов под воздействием внешнего электрического поля.

F3

F2

F4

F1

Рис. 26.3. Четыре силы, действующие на молекулу в опыте по электрофоретической подвижности

В результате общий заряд Q макромолекулы можно определить из ее подвижности под действием всех четырех сил:

F₂ + F₃ +F₄ = F₁ = f u = Q/E (26.8)

Тогда подвижность равна: μ = u /E = Q/f_эфф , где f_эфф – эффективный коэффициент трения, производимый силами F₂, F₃ и F₄.

Электрофоретический метод движущейся границы наиболее часто применяется для определения общего заряда на ДНК олигонуклеотидах. Скорость перемещения границы фиксируется аппаратурой, приспособленной для измерения аналитического электрофореза и диффузии в реальном режиме времени. Рисунок 26.4 показывает профиль интенсивности поглощения в ячейке при движении границы ДНК олигомеров (pd(A)₂₀·pd(T)₂₀.

Рис. 26.4. Профиль интенсивности в ячейке, показывающей границу олигомера DNA(pd(A)₂₀ pd(T)₂₀, C = 250 мкг·см^-3 в 100 мM KCl, 20 мM Tris, pH 8.0, движущуюся слева направо. Положение мембран, M, обозначено с каждой стороны ячейки. Данные приведены для профилей, полученных через 20, 80, и 150 сек после приложения поля (E = 3.0 В·cм^-1)

 

Из данных, представленных на этом рисунке вычисленная электрофоретическая подвижность μ для (pd(A)₂₀ pd(T)₂₀ оказалась равной 2.99 10^-4 cм²·В^-1·сек^-1 при 20^oC.

Метод стационарного электрофореза

В противоположность свободному электрофорезу, когда граница перемещается свободно, в стационарном электрофорезе макроионы захватываются небольшими камерами, поверхность и дно которых закрыты полупроницаемыми мембранами. Электрическое поле прилагается вдоль полости камеры, так что макроионы скапливаются против одной из мембран. Диффузия образует поток макроионов в направлении противоположном направлению электрического поля. При наступлении стационарного состояния, эти два потока выравниваются в каждой точке и при этом устанавливается градиент концентрации. Таким образом, в стационарном электрофорезе потоки, также как и силы сбалансированы. Распределение концентрации макроионов при этом будет описываться уравнением:

C = C₀ exp [σ(x – x₀)] (26.13)

где C₀ – концентрация в точке x₀ и экспонента σ = QE/f_эффD_эфф включает D_эфф – коэффициент диффузии при наличии электрического поля. Теперь Q = σf_эффD_эфф/E. Предполагая, что уравнение f_эфф = kT/D_эфф применимо для этого случая, получаем:

Q = σ kT/E (26.14)

Уравнение 26.14 обеспечивает простой путь определения эффективного заряда молекулы непосредственно из экспериментальных измерений величин σ, E, и T, в противоположность измерениям подвижности, которые требуют знания f_эфф или D_эфф.

Стационарный концентрационный градиент препарата олигомеров ДНК (pd(A)₂₀ pd(T)₂₀ показан на рисунке 26.5 а. Коэффициент диффузии в отсутствие электрического поля можно получить из значения релаксации равновесного концентрационного градиента (рис. 26.5 б).

Рис. 26.5.а) Зависимость оптического поглощения А₂₆₀от расстояния х для олигомеров ДНК (pd(A)₂₀ pd(T)₂₀ в буфере, содержащем 100 мM KCl, 20 мM Трис-HCl, pH 8.0, после выключения поля. Начальный стационарный градиент (пунктирная линия) был сформирован приложением поля силой 0.12 В·см^-1 в течение более 24 часов. б) Определение коэффициента диффузии для олигомеров ДНК (pd(A)₂₀ pd(T)₂₀. Наклон линии ln(A_2/3 – A_1/3) как функция времени пропорционален π²D·L^-2, где A_2/3 и A_1/3 есть значения оптической плотности при уровнях последней, равной 2/3 и 1/3, соответственно

 

Вычисленное из этих данных значение D оказалось равным 9.6×10^-7 cм²·сек^-1, что находится в хорошем согласии с таковым (10.86×10^-7cм²∙сек^-1), полученным методом динамического рассеяния. Если предположить, что уравнение Эйнштейна fD = kT действительно также и для «одетых» макроионов, находящихся в электрическом поле, то методом стационарного электрофореза можно оценить эффективный электрический заряд макромолекулы. Значение Q, полученное из уравнения 26.14, дает отношение эффективного заряда к формальному заряду Q/40 (для двойной спирали ДНК длиной 20 пар оснований) очень близкое к предсказанному (0.12), в присутствии одновалентных солей без учета поправки на конечную длину макроиона.