Сорбенты гель-фильтрации

Сорбенты гель-фильтрации.

Поскольку практическая часть нашей работы связана с гель-фильтрацией, остановимся кратко на материалах, с помощью которых происходит процесс разделения. В гель-фильтрации используются в качестве сорбентов как материалы природного происхождения, модифицированные и обработанные соответствующим образом основа как правило целлюлоза или агароза, так и разнообразные синтетические материалы гели на основе поливинилацетата, полиакриламида. Также используют вещества неорганического происхождения- пористые сткла и пористый силикагель.

По отношению к растворителю гели разделяют на гидрофильные и гидрофобные. Гидрофильные гели активно взаимодействуют с водой, впитывая е, при этом они набухают. Гидрофильность им придают гидрофильные группы, находящиеся на поверхности гранул геля например OH NH2 и некоторые другие. Гидрофобные гели не взаимодействуют с водой не набухают, зато могут хорошо набухать в органических растворителях. Гидрофильные гели могут быть превращены в гидрофобные, для этого их нужно обработать реагентом, который реагирует с поверхностными группами, меняя их природу.

Также ещ гели делят на универсальные и специального назначения. Универсальные гели отличаются широким распределением пор по размеру, разделение на них может дать первичную, но очень ценную информацию. Также гели подразделяют на мягкие, полужсткие и жсткие все либо гидрофильные либо нет. Мягкие гели как правило органические вещества, характеризуются высокой эффективностью, их фактор мкости VвнVсп равен 3. Полужсткие гели получают полимеризацией, они обладают высокой проницаемостью, средней мкостью, мало увеличивают свой объм при набухании. Жсткие- это как правило неорганические вещества, не способные набухать их фактор мкости в среднем 0.8-0.9. Теперь кратко рассмотрим наиболее распространнные гели. Полидекстрановые гели. Полидекстрановые гели типа сефадекс.

Представляют собой довольно крупные молекулы пространственно разветвлнного декстрана. Хранится и перевозится в сухом виде. Окисление кислородом приводит к появлению новых карбоксильных групп, что в свою очередь становится причиной сорбции молекул вещества в неподвижной фазе. По ионообменному механизму, это недопустимо при гель фильтрации, поэтому водные элюенты следует деаэрировать.

Сильные окислители разрушают необратимо сефадексы. Данный сорбент не растворяется в органических растворителях. Остатки борной кислоты могут образовывать комплексы с декстраном, что предполагает не использовать борную кислоту и е соли при хроматографическом процессе.

Во влажном состоянии при нейтральном pH сефадексы можно стерилизовать при Т 1100С. В сухом виде выдерживает Т 1200С. Сефадексы фирмы Pharmacia имеют маркировку G, номер означает пористость матрицы, то есть номер по сути своей описывает количество воды в мл которое связывает 10 грамм сухого геля, По размерам сферических гранул различают следующие категории Coarse 100 300 mkm Medium 50 150 mkm Fine 20 80 mkm Super fine 10 40 mkm. В аналитическом варианте колоночной хроматографии использзуют Fine и Super fine Medium для препаративных опытов Coarse для фракционирования свободным объемом.

Аналогичные матрицы из сефадексы выпускает фирма Reanal Г 10 - Г-200 и др. фирмы. Сефакрилы представляют собой декстран, сшитый N,N метиленбисакриламидом. Они поставляются уже набухшими, в виде густой водной суспензии. Главным е достоинством по сравнению с сефадексой это более высокая жесткость частиц, что позволяет вести хроматографический процесс при более больших скоростях.

Сефакрилы более химически стойки по сравнению с сефадексами. что дат вести регенерацию колонок с этим сорбентом путм длительной промывки 0.2 Н NaOH. В других свойствах данный сорбент похож на сефадексу. Основным производителем сефакрила является фирма Pharmacia. Выпускают 5 е типов с маркой S от S-200 до S-1000 все категории Super fine. Гели агарозы Сефароза представляет собой гель агарозы. Поставляется в виде суспензии, которую нельзя подсушивать. Гели е довольно жесткие, но менее чем у сефакрил.

Гранулы сефарозы очень хрупкие и е нельзя использовать при Т выше 400С. Рабочий диапазон pH 4 9. Е разрушают детергенты и 6М раствор гуанидинхлорида. Стерилизацию колонок с сефарозой ведут диэтилпирокарбонатом. В присутствии солей даже умеренное подкисление приводит к сужению пор и увеличению поверхности сорбции. Сефакрилы фирмы Pharmasia имеют тип В с номером, показывающим процентное содержание агарозы, Гель агарозы, сшитый дибромпропанолом, имеет тип GL, Аналогичные матрицы из сефарозы выпускает фирма Bio-Rad Labs биогели серии А, фирма LKB ультрогели серии А и др Полиакриловые гели Представляют собой акриламид, прошитый N,N метиленбисакриламидом.

Хранится и перевозится в сухом виде. Пористость геля определяется концентрацией полиакриламида. Рабочий диапазон pН 3 8. Это нейтральный, гидрофильный гель для работы с водными растворителями. При кипячении в водных растворах буферов при рН около 7 уже происходит гидролиз амидов.

Химически менее стоек, чем сефадекс. Колонки на его основе медленнее, чем соответственные из сефадексы. Выдерживает меньшее давление, чем сефадекс. Основной производитель фирма Bio-Rad Labs биогели серии Р и категории Fine. Аналогичные сорбенты выпускают фирмы LKB ультрогели серии АсА и др. фирмы. РАСТВОРИТЕЛИ. Как уже было сказано подвижная фаза имеет большое значение в хроматографическом процессе. Она влияет как на кинетику процесса В.Э.Т.Т так и на термодинамику процесса, например, изменяя состав подвижной фазы можно менять коэффициент удерживания в 1000-10000 раз. Однако на практике используют значения к от 1 до 20. Влияние на кинетику и термодинамику связано с тем, что подвижная фаза играет двоякую функцию.

С одной стороны подвижная фаза выполняет транспортную функцию, и здесь ее химические свойства роли не играют, имеют значения лишь физические вязкость, летучесть и д.р. в этом плане растворитель влияет главным образом на кинетические характеристики разделения.

С другой стороны молекулы растворителя участвуют в системе термодинамических равновесий установлении сорбционного равновесия, они взаимодействуют с сорбатами, сорбентами, и здесь уже имеют значение химические свойства растворителя кислотность, основность, а также его физико-химические характеристики дип. момент. Получается так, что взаимодействие сорбатов с растворителем не менее важно, чем взаимодействие с сорбентом. Таким образом природа растворителя может влиять на термодинамику процесса.к. Необходимо помнить о том, что в ряде случаев молекулы растворителя способны к прочной сорбции, что коренным образом отражается на свойствах сорбента.

Также необходимо помнить о том, что растворитель не должен содержать взвешенных примесей, оседая в колонке они могут резко нарушить пропускную способность колонки, создавая дополнительное сопротивление потоку, меняя свойства колонки, что ведт к невоспроизводимым результатам, поэтому необходимо фильтровать растворители через фильтры с размером пор около 0.5 мкм. Также особо важно для метода В.Э.Ж.Х чтобы растворитель был тщательно дегазирован, особенно это касается легко летучих растворителей, так как при перепадах давления могут возникнуть пузыри пара, что также не в лучшую сторону изменит ход процесса, и будет приводить к невоспроизводимым результатам. Образование пара заставляет применять более высококипящие жидкости t больше 60, но они как правило более вязкие, что приводит к применению более высоких давлений.

В качестве ориентира следует указать величину вязкости порядка 1,5 сП, тогда скорость движения подвижной фазы 0.4 мс, Р200 атм. Если все таки нужен растворитель с большей вязкостью, то можно термостатировать колонку при t60. Необходимо также помнить о согласовании свойств растворителя и метода детектирования. Так если применяют УФ детектор, то растворитель должен быть прозрачным для его света, это же относиться и к ИК детекторам.

Также нужно особо тщательно следить за химической чистотой растворителя.

Применительно к рефрактометрическим детекторам следует нужно сказать, что лучше использовать растворитель с минимальным коэффициентом преломления, тогда разность показателей преломления будет наибольшей, что приведет к большей точности анализа Однако, вернемся к рассмотрению свойств растворителя. Как уже было сказано растворитель участвует в установлении равновесия в колонке, константы взаимодействий с участием растворителя определяют определяют элюирующую способность данной подвижной фазы. Под элюирующей способностью понимают способность вымывания разделяемых веществ, сорбированных в колонке.

Растворители с низкой элюирующей способностью не вымывают вещества из колонки, или вымывают их через длительный интервал времени, растворители с высокой элюирующей способностью вымывают компоненты почти мгновенно и не разделяя. Подбор конкретного растворителя как правило производиться методом проб и ошибок, из-за отсутсвия четкой теории растворов.

Понятно также, что элюирующая способность может относиться только к какому-то конкретному веществу растворитель хорошо вымывающий одно вещество плохо вымывает другое, или элюирует его слишком быстро. Несмотря на отсутствие четкой теории растворов, необходимый растворитель можно предсказать на основе его физико химических констант, для этого существуют специальные таблицы, содержащие информацию о важнейших растворителях. Как уже было сказано есть растворители, которые не вымывают веществ из колонки, такие растворители называют транспортными, если таким растворителем разбавить сильно активный растворитель, то его элюирующая способность снизиться.

Последнее время все чаще используют не индивидуальные вещества, а именно смеси, особенно при хроматографировании многокомпонентных систем. Однако есть правило, согласно которому при разделении смеси из n компонентов используют смесь из n растворителей, при этом 1 из них является транспортным, а остальные n-1 активные элюенты.

Использование смесей из большего числа компонентов не приводит к лучшим результатам. Зачастую к растворителям делают добавки в количестве 0.1-2 модификаторы, они позволяют значительно улучшить хроматографический процесс. Можно найти много путей действия модификаторов в каждом конкретном случае, например, это может быть связывание наиболее активных центров на сорбенте, и как следствие стабилизации термодинамики процесса. Модификаторы могут также использоваться для создания определенного pH среды, наиболее благоприятного для протекания разделения.

В качестве модификаторов обычно используют неорганические соли, буферные добавки и т.п в случае гель-фильтрации вкачестве модификатора могут выступать соли NaCl, которые подавляют ионообменную активность сорбента, которая в данном виде хроматографии является лишней, также при хроматографии белков солевые и буферные добавки создают условия для растворения белков. Особое внимание следует уделить градиентному элюированию, при котором состав подвижной фазы меняется со временем в процессе элюирования.

Обычно это позволяет улучшить процесс, повысить разрешающую способность колонки, уменьшить ширину пиков, увеличить их высоту. Как уже было сказано выбор растворителя задача не решаемая теоретически. Однако к настоящему времени получены некоторые практические наработки по выбору растворителя и вида хроматографии. ПРЕПАРАТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ. Целью нашей курсовой работы является оптимизация условий очистки вакцины против вируса клещевого энцефалита от низкомолекулярных сопутствующих веществ.

Очистка производится методом гель-фильтрации. Производство вакцины подразумевает большие объмы веществ, много большие, чем те, с которыми приходится работать в лаборатории. Это накладывает на процесс определнные особенности, и обуславливает отделение препаративной хроматографии от аналитической. Одной из важных особенностей препаративной жидкостной хроматографии является работа со значительно большими количествами вещества - до 0.1г. на 1г. насадки, и количество очищенного материала в единицу времени может достигать 100г и выше. Надо также сказать, что выделение очистка веществ методом жидкостной хроматографии на сегоднейший день является сравнительно дорогой операцией.

Поэтому при разработке методики важно учитывать такие факторы, как эффективность разделения, время проведения разделения включая время подготовки процесса. Часто, стараясь сэкономить на одном уменьшить время разделения, увеличивая количество образца, можно сильно проиграть на другом - качестве разделения, тогда конечный выделенный продукт может содержать слишком большой процент примесей, что сведт на нет все труды и затраты по разделению.

Исходя из этих соображений ясно, насколько важно найти ту золотую середину в условиях, чтобы сохранять эффективность очистки и проводить разделение наиболее дшево. При препаративном разделении часто приходится сталкиваться с такими понятиями, как перегрузка колонки.

Перегрузка -это такая нагрузка, которая больше не позволяет выделять продукт с требуемой чистотой или степенью извлечения. Эксперимент вс ещ является лучшим путм определения оптимальной нагрузки. Вообще величина нагрузки в большинстве случаев от параметров, которые влияют на число теоретических тарелок. Также методом проб и ошибок было установлено, что для фиксированного размера образца более сложные разделения требуют значительно большего отношения массы насадки к массе образца. Структура и свойства молекул, характер их взаимодействия с подвижной и неподвижной фазами в присутсвии других компонентов образца, геометрия колонки, структура и свойства сорбента, наряду с другими аспектами являются критическими для определения оптимального размера образца, при котором достигается максимальная эффективность и практичность разделения в препаративной хроматографии.

В 3 приводятся данные, рекомендуемой нагрузки масса сорбента на 1 грамм образца в зависимости от Селективность ijСложность РазделенияЖ.Х методМасса адсорбента на 1 г. образца 2.0ЛгкоеОткрытые колонки1520 1.5СреднееВозможно на открытых колонках50-500До500 1.3СложноеНа грани возможности Т.С.Х.До 500500-5000 1.3Очень сложноеТолько В.Э.Ж Х для силикагелевых сорбентов В препаративной жидкостной хроматографии размер теоретической тарелки зависит от количества и концентрации образца, введнного в слой. Понятно, что чем ближе сродство 2-х разделяемых веществ к каждой из фаз, тем труднее их разделить, нужно больше актов сорбции-десорбции. Достигнуть требуемого разделения в таком случае можно уменьшив размер образца, либо увеличить число теоретических тарелок собственную эффективность колонки.

Есть несколько способов увеличения эффективности колонки a.уменьшить размер частиц в колонке тех же размеров b.увеличить эффективную длину колонки одним из следующих путей 1. заполнить более длинную колонку, 2. соединить несколько колонок последовательно, 3. использовать циркуляцию При увеличении длины колонки увеличивается время разделения и затраты растворителей, но с другой стороны можно брать большие объмы образцов.

Максимальная нагрузка сильно зависит от, при малом нельзя взять большую нагрузку, так как пики сильно сольются, при большом можно значительно увеличить нагрузку, так в 3 приводятся данные о том, что при увеличении от 1.05 до 1.2 нагрузка может быть увеличена в 15 раз, либо при той же нагрузке можно уменьшить длину колонки, сократив затраты на насадку, растворитель и сэкономив время, что выгоднее нужно решать в каждом конкретном случае Нагрузка и эффективность.

При увеличении нагрузки падает эффективность число теоретических тарелок вначале медленно, а затем с линейной скоростью.

Однако в ряде случаев скорость потери эффективности вс-же может быть меньше скорости скорости увеличения нагрузки, таким образом если коэфициент разделения достаточно высок, можно смело увеличивать нагрузку до определнного уровня. Также следует отметить, что измеряемая эффективность для той же массы образца выше в случае более концентрированных растворов 3. Интересно отметить, что колонки, заполненные частицами большего диаметра изначально менее эффективны, но при увеличении нагрузки она остатся почти постояноой 3.Таким образом при ведении трудных разделений простых смесей лучше использовать более длинные колонки с крупными частицами сорбента.

Нагрузка и время удерживания. В оптимальном случае время разделения дожно быть минимальным, однако с ростом нагрузки эффектвность разделения можно поддерживать на должном уровне только снизив скорость проведения анализа увеличив время, либо провести разделение в несколько примов, что также приведт к увеличению времени. Однако в большинсве случаев условия можно оптимизировать таким образом, что селективность станет значительно высокой 1.3, тогда можно уменьшить время разделения, проводить процесс с большей скоростью, а если a 2 то с предельно возможной. Вообще возможности современной препаративной хроматографии позволяют проводить разделение в том же масштабе времени, что и аналитическое разделение.