Клещевой энцефалит

Клещевой энцефалит. синонимы таежный энцефалит, дальневосточный менингоэнцефалит, клещевой энцефаломиелит, русский весенне-летний энцефалит, tick-borne encepalitis - вирусное, природно-очаговое характерное только для определенных территорий заболевание с преимущественным поражением центральной нервной системы ЦНС. Разносчиками инфекции являются иксодовые клещи, вирус передается при укусе больного клеща.

Инфекция также поражает и животных - грызунов, домашний скот, обезьян, некоторых птиц. Возбудитель инфекции - это вирусы семейства Flaviviridae. Выделяют два принципиально важных географических, клинических и еских варианта вируса и заболевания.

Дальневосточный, самый тяжелый вариант клещевого энцефалита, а также европейский вариант клещевого энцефалита. Сам вирус клещевого энцефалита был впервые выделен в 1949 г. В настоящее время инфекция регистрируется в Австрии, Германии, Польше, Чехословакии, Финляндии, прибалтийских государствах, европейской и дальневосточной части России, Италии, Швейцарии.

Максимальные показатели заболеваемости отмечаются в России и Австрии. За неполный 1999 г. в России было зарегистрировано более 7000 случаев заболевания, что на 30 выше показателей 1998 г. Наибольшему риску подвержены лица, деятельность которых связана с пребыванием в лесу - работники леспромхозов, геологоразведочных партий, строители автомобильных и железных дорог, нефте- и газопроводов, линий электропередач, топографы, охотники, туристы. В последние годы отмечается преобладание среди заболевших горожан.

В числе больных до 75 составляют горожане, заразившиеся в пригородных лесах, на садовых и огородных участках. Экстренная профилактика то есть профилактика после укуса клеща может быть проведена с помощью иммуноглобулинов. В России доступны два отечественных препарата из лошадиной и человеческой сыворотки и один импортный - FSME-Bulin пр-ва Immuno AG, Австрия. Вакцины. Принципиально все вакцины для профилактики клещевого энцефалита представляют собой выращенные на куриных эмбрионах, инактивированные формалином вирусы, сорбированные на адъюванте вещество для усиления иммунного ответа - гидроокиси алюминия.

В качестве дополнительных, стабилизирующих компонентов применяют желатин или альбумин. На настоящий момент в России доступны четыре вакцины культуральная вакцина пр-во НПО Вирион , Томск. Показана для вакцинации детей с 4-х лет и взрослых до 65 лет. Курс вакцинации состоит из трех доз по схеме 0-1-4. Альтернативная схема для быстрой защиты состоит из двух доз с интервалом 1-2 месяца, причем последняя доза вводится не позднее, чем за 2 недели до входа в природный очаг инфекции.

Объем вводимой дозы для детей до 6 лет составляет 0,5 мл, для всех остальных - 1 мл. Выпускается в ампулах по 2 мл. Вакцина обладает самым обширным списком противопоказаний, включающим острый туберкулез и ревматизм, заболевания ЦНС, сердечно-сосудистой системы, почек, печени аллергические расстройства, эндокринные заболевания сахарный диабет и др онкологические заболевания, болезни крови, беременность. концентрированная культуральная вакцина пр-во Института полиомиелита и вирусных энцефалитов, Москва, Россия штамм Софьин. От первой отличается тем, что может применяться с возраста 18 лет. Курс вакцинации состоит из двух доз с интервалом 5-7 месяцев.

Первую ревакцинацию делают одной дозой вакцины через 1-2 года, вторую и последующие через три года. Противопоказания - активный туберкулез, перенесенная в предыдущие 6 месяцев менингококковая инфекция и вирусный гепатит наследственные и активные заболевания нервной системы, эпилепсия, пищевая аллергия, бронхиальная астма, заболевания соединительной ткани напр. ревматизм, болезни крови, перенесенный инфаркт и инсульт, болезни эндокринной системы, злокачественные новообразования, беременность.

FSME-Immun-Inject пр-ва Immuno AG, Австрия в составе компании Baxter, США. Выпускается в виде шприц-доз, объем дозы - 0,5 мл для всех возрастов. Очень короткий список противопоказаний - острые или обострения хронических заболевания, аллергия на компоненты вакцины.

Беременность и лактация не являются противопоказанием. Защищает от обоих вариантов инфекции - европейского и дальневосточного. Курс вакцинации состоит из 2 доз, которые вводятся c интервалом от 2 недель до 1 месяца после такой вакцинации защищенными являются 95 привитых первая ревакцинация проводится через 9-13 месяцев после введения второй дозы повторная ревакцинация проводятся через 3 года от момента введения третьей дозы. Может вводиться одновременно с иммуноглобулином.

Не имеет возрастных ограничений. Из двух импортных вакцин, доступных в России, обладает большей распространенностью и более широким опытом применения. Энцепур пр-ва Chiron Behring, Германия, вирусный штамм К23. От предыдущей отличается наличием дополнительной схемы вакцинации - три дозы по схеме 0-1-3 недель. Второе отличие - несколько большее число побочных реакций в связи с присутствием в составе вакцины желатина.

Все перечисленные вакцины обладают высокой иммуногенной активностью. Через две недели после введения последней дозы первичного курса вакцинации иммунитетом обладают от 90 до 97 привитых. Среди побочных реакций преобладают реакции в месте инъекции покраснение, уплотнение, болезненность их отмечают около 8 привитых первой дозой вакцины, с последующими дозами вакцины число побочных реакций снижается. Температурные реакции встречаются у 5 вакцинированных. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ. При производстве вакцины против вируса клещевого энцефалита важное значение имеет очистка готового продукта на последних стадиях производства.

Суть очистки в том, чтобы отделить белки вакцины от низкомолекулярных веществ, которые вводятся на разных стадиях производства вакцины с целью отделить вирус от клеточных оболочек, дезактивировать вирус. В качестве этих низкомолекулярных веществ могут выступать антибиотики канамицин, неомицин, а также тритон TX-100. В масштабах лабораторной практики эта задача не является сложной. Можно взять небольшой объм пробы и провести успешное отделение высокомолекулярной компоненты от низкомолекулярной.

Однако, нас интересует препаративное разделение в промышленных масштабах. В этом случае необходимо учитывать и такие факторы как быстрота проведения разделения, количества, выделяемые при разделении, сложность и стоимость проведения разделения, естественно качество выделяемого образца чистота, должно быть неизменно высоким. Очевидно, разделение будет более дешвым, если разделять возможно большие порции вещества проводить очистку больших доз вакцины, при наибольших скоростях, с максимальными концентрациями.

Но при этом возможно размывание зон пиков и придтся либо отбрасывать часть вещества, либо мириться с примесями, также не следует забывать о разбавлении препарата при гель-фильтрации. Вообще как указывается в 3 , основным недостатком гель-фильтрации в препаративном разделении является низкое отношение объма пор к общему объму колонки, для нынешнего поколения сорбентов. В связи с этим, часто возникает необходимость применения последовательного подключения большого числа колонок с соответсвующим ростом затрат.

Целью нашей работы стала оптимизация процесса очистки вакцины от низкомолекулярных веществ. Исследования проводились на модельных смесях, содержащих в качестве белковой части альбумин 1мгмл, в качестве низкомолекулярного вещества анальгин 1мгмл. Применение альбумина обусловлено тем, что это сравнительно лгкий белок 50000, и обладает способностью сорбировать на себе низкомолекулярные вещества.

Таким образом добившись разделения этой смеси, можно рассчитывать на то, что разделится и реальная смесь. Для исследования нами были приготовлены два раствора первый содержал только анальгин, второй анальгин и альбумин. Раствор готовился на основе 0.02М фосфатного буфера pH7.2, также оба раствора содержали 0.15М NaCl для предотвращения ионообменных процессов в колонке и для улучшения растворимости белка. Для приготовления растворов анальгин был взят из продажной таблетки, альбумин из продажного препарата 10 раствор.

Для приготовления растворов сперва был приготовлен фосфатный буфер с добавкой соли. Буфер готовился смешением рассчтных количеств Na2HPO4 и NaH2PO4 , также при растворении была добавлена соль. После чего раствор разделили на 2 части в одну добавили аликвоту содержащую анальгин, в другую аликвота, содержащая анальгин и альбумин. Для приготовления растворов использовалась бидистиллированная вода, растворы перед введением в колонку фильтровали.

Сначала нами было проверено влияет ли объм вводимой пробы на местоположение пика. Для этого был взят раствор, не содержащий альбумина. В колонку гель-фильтрации вводили в первом опыте 5 мл. раствора, во втором 30 мл. раствора. Время выхода начало появления анальгина по детектору в обоих случаях было одинаково и составляло 14 мин. Затем нами была проведена гель-фильтрация модельных смесей, также при разных объмах проб 5, 20, 30 мл. результаты в виде таблицы Таблица 1 V пробы Мл. Tвых анальгинаtвых альбуминаШирина пика альбуминаПримечание.5148.57Не перекрыв.20148.511Перекрыв.30158.513Пере крыв время минимума на хроматограмме.

Таким образом видно, что объм больше 30 мл увеличивать нельзя так как уже при этом объме пики частично перекрываются. Для более детального изучения разделения при объме пробы 30 мл, было принято решение собрать и проанализировать фракции, начиная с 8.75 минуты. Сначала была собрана фракция в интервале 8.75-14.0 минут 31.5 мл, затем с 14.0 минуты собирали фракции по 3 мл меняли пробирки через 30 сек Анализ всех фракций проводили на ионообменной колонке MONO Q объм пробы 100 мкл. Анализировали последовательно основную фракцию и фракции из 5-ти пробирок. При этом производили оценку относительной концентрации альбумина по высоте пика, за единицу была принята концентрация в основной фракции 8.75-14.00 мин. Формула для расчта Cihihосн, где hi- высота пика альбумина в i-пробирке hосн- высота пика в основной фракции Анализ проводился с целью определить оптимальное время для остановки отбора фракции альбумина.

Поэтому также нами рассчитывалась концентрация альбумина на текущий момент времени т.е. если бы фракции собирались в одну пробирку, при этом также концентрация в основной пробирке была принята за 1, и общий объм фракции.

Также нами было посчитано относительное количество вещества в фракции, как iCотн. V. Cотн. 31.513ni Ci 31.53n V 31.53n где n- номер пробирки.

Тогда процент выведенного альбумина будет отнотн5 , в расчте на то что с 5 пробиркой выходит весь альбумин вообще это так и есть см. табл. Результаты в виде таблицы Таблица 2. пробиркиИнтервал t минCi CотнV млКол-во веществавыд. Альбумина0 основн.8.75-14.001001.00031.531.50084.70 114-14.5850.98734.534.05091.53214.5-1570 0.96437.536.15097.17315-15.5260.91240.53 6.93999.29415.5-1680.85443.537.14999.865 16-16.52.40.80046.537.200100 Таким образом мы можем сделать вывод о том, что сбор высокомолекулярной фракции можно прекратить на 3 пробирке на 15.5 минуте, объм фракции при этом составит 40.5 мл при неизменной скорости потока 6 млмин.

Тогда потери альбумина составят 0.71, при этом концентрация белка в этой фракции будет 0.735 мгмл 10.99293040.5, вместо исходной 1 мгмл. Также было проверено можно ли отделить тритон TX-100 от альбумина в данной системе. В результате оказалось, что тритон слабо удерживается на данной колонке, притом время появления тритона также не зависит от объма вводимого образца.

Разница между пиками на хроматограмме слишком мала, чтобы можно было проводить препаративное разделение. Эти результаты можно объяснить тем, что молекула тритона слишком велика, образует ассоциаты с молекулами воды, другими молекулами, что ведт к плохому проникновению в поры сорбента, и как следствие плохому удерживанию. Возможно стоит сменить сорбент, использовать другую марку с другими характеристиками. Подводя итог нашей работы следует сказать, что нами была разработана методика очистки вакцины от некоторых низкомолекулярных веществ, чтобы воплотить эту методику на практике нужно лишь провести масштабирование до нужных масштабов.

Суть масштабирования может быть в том что будет увеличен внутренний диаметр колонки, может быть увеличена скорость, либо концентрация исходного образца,