САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЬЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. АКАД. И. П. ПАВЛОВА На правах рукописи НИКОЛАЕНКО Светлана Леонидовна ФУНКЦИОНАЛЬНО-МЕТАБОЛИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ ЛИМФОЦИТОВ ПРИ ВИРУСНЫХ ГЕПАТИТАХ В И С 14. 00. 10 - инфекционные болезни АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Работа выполнена в Санкт-Петербургском Государственном медицинском университете имени академика И.П. Павлова Научный руководитель академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Е.П. Шувалова Официальные оппоненты доктор медицинских наук профессор Т.В. Сологуб доктор медицинских наук С.Л. Мукомолов Ведущее учреждение Научно-исследовательский институт детских инфекций Актуальность темы. Вирусные гепатиты, несмотря на определенные успехи в изучении этиологии, патогенеза, клиники и терапии, остаются проблемой, далекой от своего решения Дунаевский О.А 1993. Подымова С Д, 1993, Учайкин В Ф и др, 1994 Соринсон С Н, 1996, Alberti A et al, 1991 Barbara J A, 1994 Необходимость дальнейшего изучения различных сторон патогенеза вирусных гепатитов возникает вследствие разработки новых методов исследования и возможности верификации гепатитов, ранее расцениваемых. как ни А. ни В Мукомолов С Л и др, 1992, Рахманова А Г и др, 1995, Хазанов А И , 1996 Krogsgaard К et al. 1990, Chang W Y et al, 1992 Наряду с моноинфекциями, в результате общих путей и механизмов заражения, а также строго типоспецифического характера иммунитета, в последнее время наблюдается увеличение частоты ко- и суперинфицирования несколькими вирусами с развитием микст-гепатитов В большей мере это относится к вирусным гепатитам с парентеральным механизмом заражения Соболевская О Л . 1995. Румянцев О.Н. и др 1996, Шувалова ЕП. Антонова Т.В. 1996, Zeidis Y.B. et al, 1992, Liaw G F 1995, Goranova Q et all, 1996 Одной из причин развития затяжного течения вирусного гепатита считают неполноценность ответной реакции организма в связи с нарушением функционирования иммунной системы Соринсон С Н. и др . 1992. Шамшура О Л , Фролов А. В 1994. Баширова Д К. 1996, Собчак Д. М Деречинская Е Л, 1996, Popper Н Paronetto F . 1984 Paterlim P et al. 1993, Manns M P,1996. Большое значение в патогенезе различных заболеваний придается структурно-метаболическом состоянию иммунокомпетентных клеток ИКК, от которого зависит функционирование иммунной системы в целом Ляшенко ЮИ, 1988, 1992, Paronetto F, 1986. Bianchi FB, 1992. Schirmacher P et al. 1993 и, как следствие, течение инфекционного процесса.
Одной из возможных причин несостоятельности лимфоцитов может явиться усиление процессов свободнорадикального окисления в их мембранах и нарушение его регуляции Афонина Г Б , Бордонос В Г, 1990, Пастушенков В Л и др, 1993, Матвейков Г П и др. 1994, Devi M A . Das N P , 1994, Cardier YE et al, 1995, а также изменение внутриклеточного метаболизма, приводящего к нарушению созревания, дифференцировки и функционирования ИКК Робинсон М.В , 1986, 1994, Николаев А И и др , 1989. Габрилович Д И и др . 1991, Гольтяпин Д Б . 1995, Huang С M et al, 1988,LosaGA 1989 Вышеизложенное послужило основанием для выбора направления наших исследований Цель исследования Оценить патогенетическое значение функционально-метаболического состояния лимфоцитов и их мембран при вирусных гепатитах различной этиологии, разработать на этой основе дополнительные критерии оценки тяжести и прогнозирования течения заболевания. Задачи исследования 1. Изучить состояние процессов липопероксидации в мембранах лимфоцитов и в плазме крови по уровню малонового диальдегида в динамике вирусных гепатитов различной этиологии. 2. Изучить состояние антиоксидантной защиты в лимфоцитах по уровню активности ее основного фермента - супероксиддисмутазы и биосинтетическую активность клеток при вирусных гепатитах. 3. Определить состояние внутриклеточного метаболизма лимфоцитов по изменению активности ведущих ферментов основных обменных циклов СДГ, ЛДГ, альфа-ГФДГ, НАД- и НАДФ-оксидазы при остром вирусном гепатите В ОВГВ и гепатите ВС. 4. Определить характер иммунологических сдвигов при ОВГВ по состоянию Т В-клеточного звена иммунитета и неспецифической резистентности. 5. Оценить клиническое и патогенетическое значение состояния лимфоцитов в периферической крови и разработать дополнительные критерии оценки тяжести и прогнозирования течения вирусных гепатитов.
Основные положения, выносимые на защиту.
В работе обосновывается положение о закономерном усилении перекисного окисления липидов ПОЛ мембран лимфоцитов, соответствующее периоду и форме тяжести вирусных гепатитов.
Изменение уровня малонового диальдегида МДА в лимфоцитах имеет количественные различия и разнонаправленный характер в динамике заболевания при гепатитах различной этиологии.
Обсуждается положение о том, что дополнительным фактором. влияющим на функционирование иммунокомпетентных клеток ИКК при вирусных гепатитах, является измененное внутриклеточное метаболическое состояние лимфоцитов, оцениваемое по активности ключевых ферментов основных обменных циклов и содержанию РНК. ДНК и ПДН, Состояние процессов ПОЛ и метаболизм лимфоцитов имеют важное патогенетическое значение, что обосновывает значение их показателей для оценки тяжести и прогнозирования течения вирусных гепатитов.
Научная новизна работы.
Впервые выявлены преимущественно однотипные изменения метаболических процессов и функционирования иммунокомпетентных клеток при ОВГВ и ВГВС. Получены новые данные о зависимости интенсивности ПОЛ в мембранах лимфоцитов и активности СОД от этиологии гепатита. Так, при легкой форме ВГС уровень МДА лимфоцитов в разгар заболевания не повышался и был существенно ниже, чем при ОВГВ и ВГВС. Если при циклической форме ОВГВ наблюдалось компенсаторное усиление активности СОД к периоду реконвалесценции, то у больных гепатитом ВС показатель оставался стабильным на протяжении заболевания. Интенсивность ПОЛ и активность СОД лимфоцитов соответствовали тяжести и периоду вирусного гепатита.
Впервые выявлено достоверное увеличение эндонуклеолиза хроматина лимфоцитов при ОВГВ и усиление биосинтетической активности клеток независимо от тяжести и периода заболевания.
Практическая ценность работы.
Выявленные закономерности изменения показателей МДА, активности СОД лимфоцитов при вирусных гепатитах в зависимости от тяжести и периода заболевания, обосновывают их прогностическое значение, а также возможность использования их определения для оценки тяжести заболевания и полноты выздоровления.
Апробация работы.
Основные положения работы доложены на заседании Санкт-Петербургского отделения Всероссийского научного общества инфекционистов 1997. представлены на 1. 2 и 3 Всероссийской неделе гастроэнтерологов1995, 1996. 1997. По теме диссертации опубликовано 5 работ.
Пути реализации работы.
Результаты исследования внедрены в практику работы Научно-исследовательского института детских инфекций г. Санкт-Петербург и инфекционного отделения вч 22412 ЛенВО, а также в учебном процессе на кафедре инфекционных болезней и эпидемиологии СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова. Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и практических рекомендаций.
Работа изложена на 167 страницах машинописи, из них 132 страницы основного текста, содержит 23 таблицы и 12 рисунков, снабжена указателем литературы, включающим 182 отечественных и 139 иностранных источников. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Под наблюдением находились 166 больных вирусными гепатитами 137 мужчин и 29 женщин. Возраст 86,2 обследованных не превышал 30 лет. В результате серологической верификации ВГ у 99 больных установлен диагноз ОВГВ, у 11 - ВГС, 56 больных имели одновременно маркеры ОВГВ и антитела к HCV ВГВС. Оценка формы тяжести вирусных гепатитов проводилась по общепринятым критериям.
Легкая форма заболевания диагностирована у 23 больных ОВГВ, в том числе в 4 случаях - безжелтушная, средней тяжести - у 58. тяжелая - у 18 больных. В 4 случаях заболевание осложнилось развитием острой печеночной недостаточности ОПН. У 3 из этих больных наблюдалось прогрессирующее течение заболевания, развитие печеночной комы с летальным исходом.
Гепатит ВС в легкой форме переносили 29 больных, в том числе в 3 случаях - безжелтушную, средней тяжести - 21 больной, тяжелую - 6 больных. В 3 случаях тяжелое течение заболевания осложнилось развитием ОПН, в одном из них - печеночной комой и легальным исходом. Все 11 больных ВГС переносили заболевание в легкой форме, безжелтушную - в 4 случаях. Одновременно с общепринятым клинико-лабораторным обследованием в динамике заболевания у 94 больных изучали состояние процессов ПОЛ мембран по уровню малонового диальдегида МДА в лимфоцитах и в плазме крови в тесте с тиобарбитуровой кислотой Андреева Л.И, и др 1988 Пастушенков В. Л. и др 1993. Состояние системы антиоксидантной защиты в лимфоцитах оценивали по степени активности супероксиддисмутазы СОД методом Fndovich J. 1989. Функционально-метаболическую активность лимфоцитов изучали по активности ключевых ферментов основных обменных циклов, сукцинатдегидрогеназа СДГ, лактатдегидрогеназа ЛДГ, альфа-глицерофосфатдегидрогеназа альфа-ГФДГ в цитозольной и митохондриальной изоформах.
НАД-оксидаза и НАДФ-оксидаза методом С.Loida1982. Биосинтетическую активность лимфоцитов оценивали по величине коэффициента альфа К-альфа отражающего соотношение РНКДНК в методе люминесцентного микроспектрального анализа Карнаухов В Н 1978 Выраженность эндонуклеолиза ядерного хроматина характеризовали по уровню продуктов деградации нуклеотидов ПДН, являющихся маркером данного процесса методом Иванника В П. и др.198б. Для оценки иммунного статуса 30 больных ОВГВ исследовали показатели клеточного, гуморального иммунитета и неспецифической резистентности.
Иммунологические исследования проводились на базе НИЛ СПИД и инфекционных заболеваний в ВС РФ ВМА под руководством д.м.н Е.И. Змушко - начальника лаборатории.
Клинико-биохимическое и иммунологическое обследование больных ВГ проводили дважды - в периоды разгара заболевания и ранней реконвалесцснции. Полученные данные сопоставляли с результатами обследования 25 здоровых доноров и подвергли вариационно-статистической обработке в соответствии с общепринятыми методами.
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ У подавляющего большинства больных ОВГВ уже с первых дней желтушного периода выявлено значительное усиление процессов липопероксидации мембран лимфоцитов, о чем свидетельствовало достоверное повышение уровня МДА Так. при норме МДА в лимфоцитах МДАл 1,100,02 нмоль2х106 кл. показатель был увеличен при легкой форме в 1.4 раза 1.540,04 нмоль2х106. Р 0.001. при средней тяжести - в 1,5 раза 1,630,05 нмоль2х106 кл, Р 0,001, при тяжелой- в 1,6-1,8 раза 1,890,12 нмоль2х 106 кл, Р 0,001. Уровень МДА в плазме крови МДАпл изменялся согласованно с показателями МДАл и превышал показатели здоровых лиц в 2,9-3,1 раза при легкой форме 38,92,27 нмольмл, норма - 12,60,52 нмольмл, Р 0,001. в 4,2-4,6 раза при средней тяжести 55,54,29 нмольмл, Р 0,001 и в 7,2-8,0 раза при тяжелой форме ОВГВ 96,58,88 нмольмл, Р 0,001. Таким образом, степень повышения уровня МДА соответствовала форме тяжести заболевания и имела достоверные различия показателя в плазме крови в зависимости от выраженности патологического процесса при всех формах тяжести ВГ Содержание МДАл имело достоверные различия у больных средней тяжести и тяжелой формой заболевания Выявленное нами повышение количества продуктов ПОЛ в плазме крови отражает степень свободнорадикального повреждения мембран гепатоцитов. что является общепризнанным механизмом, обуславливающим выраженность проявления основных синдромов ОВГ цитолитический, интоксикационный и синдром желтухи Дудник Л.Б 1988 Антонова Т.В. и др. 1991, Пак С Г Никитин Е.В, 1991 Левина Л.Д и др 1992. Функционирование ИКК при развитии иммунного ответа сопровождается активацией процессов ПОЛ в мембранах лимфоцитов Ляшенко В.А. и др 1988 и определяет их состояние и эффективность иммунологической защиты Иванова В В. и др 1986 Лебедев К А, Понякина И.Д. 1986 Афонина Г.Б Бордонос В Г 1990. Выявленная корреляция уровня МДАч с формой тяжести ОВГВ отражает усиление процессов липопероксидации в мембранах лимфоцитов, соответствующее напряженности иммунного ответа.
По мере купирования патологического процесса наблюдалось снижение МДАл и МДАпл во всех обследованных группах, за исключением группы больных средней тяжести, где отмечено незначительное увеличение среднего уровня МДАл. Хотя средние значения МДАл и МДАпл в период ранней реконвалес-ценции оказались достоверно выше контрольных значений, в динамике ОВГВ наблюдалась явная тенденция к их нормализации, наиболее демонстративная при тяжелой форме снижение содержания МДАл при легкой форме от 1,540,04 до 1,460,08 нмоль2х106кл при тяжелой форме - от 1,890.12 до 1,550,09 нмоль2х106 кл в плазме крови - при легкой форме от 38,9 2,27 до 21,4 3,96 нмольмл при средней тяжести - от 55.54,29 до 34.43,95 нмольмл при тяжелой форме - от 96,58,88 до 26,23,62 нмольмл.
В группе больных средней тяжести ВГВ среднее значение уровня МДАт в динамике заболевания имело тенденцию к повышению от 1,6310.05 до 1,680,08 нмодь2х106 кл и было связано с тем. что у 31,8 больных наблюдалось увеличение показателя после курса АЛОК, который применялся в качестве дополнительного метода эфферентной терапии у пациентов с отклонениями в нормальном течении восстановительного периода длительная гиперферментемия и антигенемия, расцениваемые многими авторами как критерии затяжной реконвалесценции Соринсон С.Н 1987, 1996, Угрюмова Б.Л. 1941 Шамшура ОЛ. Фролов А.В 1994. Результаты изучения содержания МДА в лимфоцитах в этой группе больных значительно превышали средние 2,020,11 против 1,680,08 нмоль2х106 кл, Р 0,05. Вопреки тому, что многие авторы указывают на усугубление патологического процесса и. как следствие, большую выраженность функциональных нарушений печени и тяжесть клинических проявлений при развитии вирусных гепатитов смешанной этиологии, в частности ВС, мы не выявили существенных различий уровня МДАл и МДАпл на протяжении ОВГВ и гепатита ВС при всех формах тяжести Полученные нами данные свидетельствуют о повышении, в сравнении с показателями здоровых лиц. уровня МДАл в разгар легкой формы гепатита ВС в 1.4-1.5 раза 1,600,05 нмоль2х106 кл, Р 0.001, в 1,6 раза при средней тяжести 1,720,05 нмоль2106 кл. Р 0,001, в 1.6-1,8 раза при тяжелой форме 1,880,14 нмоль2х106кл, P 0,001, Содержание МДАпл изменялись аналогично показателю в лимфоцитах и соответствовали форме тяжести, при легкой форме - в 2,8-3,3 раза 38,94.90 нмольмл.
Р 0.001. при средней тяжести - в 4,1-4,9 раза 57,47,23 нмольмл, Р 0.001. при тяжелой форме - в 5,8-7,3 раза 83.112,5 нмольмл.
Р 0.001. В период угасания основных клинико-биохимических проявлений гепатита ВС отмечалось снижение содержания МДАл и МДАпл, за исключением группы больных легкой формой, где выявлена тенденция к повышению среднего уровня МДАл до 1,630,12 нмоль2х106 кл, что связано с тем, что в данной группе 25 больных обследованы после курса АЛОК, результаты обследования которых достоверно превышали средние в группе 2,460.23 нмоль2х106 кл, Р 0.02. Достоверное снижение МДАл в динамике гепатита ВС выявлено при средней тяжести до 1.390,11 нмоль2х106 кл. Р 0.05. В плазме крови содержание МДА в процессе развития заболевания достоверно снижалось при всех формах тяжести легкая форма - до 24,54,43 нмольмл, Р 0,05, форма средней тяжести - до 24,85,45 нмольмл, Р 0.01 тяжелая форма -до 39,84,18 нмольмл, Р 0,01 и в реконвалесценцию существенно отличалось от показателей здоровых лиц только при тяжелой форме заболевания.
Сходные результаты активности ПОЛ при ОВГВ и гепатите ВС свидетельствуют о близости механизмов патогенеза, что связано с единством путей и механизмов заражения и. возможно, определяющим значением вируса В на состояние лимфоцитов В то же время, согласно литературным данным, при гепатите ВС вирус гепатита С подавляет репликацию HBV, что оказывает влияние на течение микстинфекции Корочкина О.В , Соболевская О.Л 1996
Процессы свободнорадикального окисления в одинаковой мере затрагивают ... Р 0,05, средней тяжести - в 1,8-1,9 раза 9,471,79 ед, РО.05, тяжелой ф... так как от соотношения активности прооксидантных и антиоксидантных сис... 1992, язвенной болезни желудка Яковлев А А, Тарасова Г Н 1995, инфекци... ВС .
ВЫВОДЫ 1 В разгар ОВГВ у большинства обследованных больных выявлено усиление процессов липопероксидации в лимфоцитах и в плазме крови. характеризующееся увеличением уровня вторичного продукта ПОЛ - малонового диальдегида Аналогичные изменения обнаружены у больных гепатитом ВС Степень повышения уровня МДА соответствовала форме тяжести- При тяжелой форме показатель был достоверно выше- чем у больных легкой и средней тяжести. 2. При вирусных гепатитах различной этиологии ОВГВ. ВГС. ВГВС установлены разнонаправленные изменения показателей интенсивности ПОЛ в лимфоцитах.
В разгар легкой формы ОВГВ и ВГВС выявлено достоверное увеличение уровня МДА в лимфоцитах По мере угасания клинических и биохимических признаков гепатита выявлена тенденция к снижению показателя МДА, но у 90,0 больных показатель был выше нормы.
При легкой форме ВГС уровень МДА в разгар заболевания не отличался от нормы, а к периоду реконвалесценции был достоверно повышен. 3. По мере угасания клинико-биохимических проявлений гепатита обнаружено снижение уровня МДА у большинства обследованных больных, значения которого оставались достоверно выше показателей здоровых лиц У больных, обследованных в первые дни после курса АЛОК отмечено на фоне уменьшения активности АлАТ значительное повышение уровня МДА в лимфоцитах. 4 Усиление антиоксидантной защиты в лимфоцитах при ОВГВ характеризуется увеличением активности ее основного фермента - супероксиддисмутазы в разгар легкой и среднетяжелой формы в среднем в 1,4 раза, тяжелой - в 2,3-3,8 раза. В динамике заболевания наблюдается еще большее увеличение активности СОД при нетяжелых формах и, напротив. снижение показателя у больных тяжелой формой ОВГВ, 5 Усиление процессов ПОЛ в лимфоцитах закономерно приводит к усилению эндонуклеолиза, деструкции хроматина и выходу продуктов деградации нуклеотидов в цитозоль клетки.
Это подтверждается стабильно увеличенным содержанием ПДН в лимфоцитах на протяжении ОВГВ при всех формах тяжести, 6. При ОВГВ происходит изменение внутриклеточного метаболизма лимфоцитов, о чем свидетельствует достоверное снижение активности альфа-ГФДГ при формах легкой и средней тяжести и НАДФ-оксидазы при среднетяжелом течении.
При легкой форме ВГВС активность ферментов была аналогична показателям при легкой форме ОВГВ 7 Структурно-функциональные и метаболические изменения в лимфоцитах при ОВГВ, ВГС и ВГВС соответствуют форме тяжести и периоду заболевания и связаны с активацией иммунокомпетентных клеток при гепатитной инфекции, что имеет патогенетическое значение и может служить дополнительным критерием оценки тяжести и прогноза течения заболевания.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ В качестве дополнительного критерия оценки формы тяжести и прогнозирования течения вирусных гепатитов В, ВС с первых дней желтушного периода рекомендуется использовать определение уровня вторичного продукта ПОЛ - малонового диальдегида МДА в лимфоцитах и в плазме крови.
Увеличение показателя МДАл более, чем в 1.6 раза и МДАпл - в 7 и более раз позволяет прогнозировать тяжелое течение заболевания у большинства больных Динамическое наблюдение за активностью СОД в лимфоцитах при ОВГВ позволяет прогнозировать тяжелое течение гепатита при увеличении показателя в разгар в 2,0 и более раз. Выявление функционально-метаболических и структурной сдвигов в лимфоцитах рекомендуется как ранний и чувствительный метод определения состояния иммуннокомпетентнь1х клеток для оценки состояния системы иммунитета в целом, в частности, по показателям уровня МДА, ПДН, Ка, активности СОД. альфа-ГФДГ, ЛДГ и НАДФ-оксидазы, СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1 Иммунобиохимические критерии тяжести и прогноза острого вирусного гепатита ВАктуальные вопросы клиники, диагностики и лечения Тез. докл. научн. конф СПб 1995 С. 313-314. в соавт. с Т.В. Антоновой, И.В. Жицковой.
Н.В. Карицкой, 2. Роль прооксидантной и антиоксидантной систем в патогенезе -вирусного гепатита вРосс. журн. гастроэнтер гепатол. колопрокт 1995. - N3, Т 5, Прилож.
N1 С. 8. в соавт.с Т В.Антоновой, В Б.Барановской. 3. Биоэнергетический метаболизм лимфоцитов при остром вирусном гепатите вросс. журн гастроэнтер гепатод колопрокт. -1996 - N4, Т.6, Прилож.
N3. С. 307 в соавт с Т.В, Антоновой 4 Уровень бетта2-микроглобулина и состояние мембран лимфоцитов в динамике вирусного гепатита ВЖурн. микробиол. -1996 - N6 С 82-83. в соавт. с Т.В, Антоновой.
И.В. Жицковой, М.А Вашуковой 5. Мембранно-метаболические свойства лимфоцитов при остром вирусном гепатите ВМатер. 3-й Российской гастроэнтерологической недели М . 1997 - C.134. в соавт с Т.В. Антоновой.