ПЕРИТОНЕАЛЬНЫЕ МАКРОФАГИ КАК МОДЕЛЬ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ АТЕРОГЕННОГО ПОТЕНЦИАЛА СЫВОРОТКИ КРОВИ. Накопление липидов в гладкомышечных клетках ГМК и макрофагах интимы аорты является характерной чертой атеросклероза человека и экспериментальных животных.
Было показано, что сыворотки крови больных ишемической болезнью сердца ИБС с ангиографи-чески подтвержденным коронарным атеросклерозом в отличие от сывороток крови здоровых лиц обладают способностью вызывать накопление липидов в культивируемых клетках интимы аорты человека. Это свойство было названо атерогенностью, поскольку накопление липидов сопровождалось другими атеросклеротическими проявлениями на клеточном уровне - усилением пролиферативной активности и синтеза внеклеточного матрикса.
Однако связь между атерогенностью и атеросклерозом окончательно не выяснена. Исследования по этой проблеме основаны на первичном культивировании субэндотелиальных клеток интимы аорты человека. Сложность работы обусловлена необходимостью постоянного обеспечения стерильным аутопсийным материалом, а также высокой стоимостью выделения и культивирования клеток.
Ранее было показано, что способностью аккумулировать внутриклеточно холестерин при культивировании с атерогенной сывороткой обладают ГМК аорты человека и мононуклеарные клетки периферической крови. Эти данные позволяют считать, что для определения атеро-генности сыворотки крови могут быть использованы не только субэндотелиальные клетки интимы аорты. Целью работы было определение возможности использования легкодоступных перитонеальных макрофагов для определения атерогенности сыворотки крови.
Кровь для исследований бы взята у больных ИБС, подтвержденной при коронарной ангиографии, и здоровых доноров. ГМК были выделены из аорты мужчин, взятой в асептических условиях спустя 24 ч после внезапной смерти, ступившей от инфаркта миокарда. Человеческие перитонеальные макрофаги были выделены из асцитической жидкости больных недостаточностью кровообращения. Мышиные перитонеальные МФ получены от нестимулированных мышей. Влияние сыворотки крови здоровых доноров и больных ИБС на уровень холестерина в клетках Тип клеток Контроль, мкг Уровень холестерина в клетках, контрольных величин на 1 мг белка здоровые доноры больные ИБС ГМК интимы аорты 59 5 110 7 370 43 67 4 118 13 179 10 32 3 95 8 264 31 44 4 108 3 284 28 медии аорты Мышиные макрофаги Человеческие макрофаги В таблице приведено содержание общего холестерина в ГМК интимы и медии аорты человека, в перитонеальных мышиных и человеческих макрофагах, инкубированных 24 ч в присутствии 20 сывороток крови здоровых доноров и больных ИБС. Видно, что инкубация клеток в 20 сыворотке крови здоровых доноров не приводит к статистически значимому повышению уровня холестерина в клетках, а инкубация в 20 сыворотке крови больных ИБС вызывает достоверное повышение содержания внутриклеточного холестерина как в ГМК, так и в перитонеальных макрофагах.
Таким образом, так же, как ГМК интимы и медии аорты, перитонеальные макрофаги мышей и человека могут быть использованы для оценки атерогенного потенциала сыворотки крови.
Кроме того, накопление холестерина в макрофагах происходит в 1,5-2,5 раза быстрее, чем в ГМК. Оба эти факта, а также более легкий способ получения культуры макрофагов позволяют считать, что эти клетки могут быть использованы для оценки атерогенного потенциала сыворотки крови значительно чаще, чем ГМК. При культивировании мышиных, человеческих макрофагов и ГМК с 10 атерогенными и 10 неатерогенными сыворотками крови установлена прямая корреляционная связь между аккумуляцией холестерина в макрофагах и в ГМК интимы аорты. Кроме того, аккумуляция холестерина в человеческих и мышиных макрофагах находится в прямой зависимости от концентрации сыворотки рис 1 и времени культивирования рис 1А . При культивировании макрофагов с сывороткой здоровых лиц такого эффекта не выявлено.
Во время инкубации человеческих и мышиных макрофагов с сыворотками крови больных ИБС выявлено повышение содержания в клетке свободного холестерина и триглицеридов в 1,5- 2 раза, эфиров холестерина в 2,5-3 раза. При этом. уровень фосфолипидов не изменялся.
В группе здоровых доноров только у 22 28 из 80 человек сыворотки крови вызывали аккумуляцию холестерина в культуре клеток.
В группе больных ИБС у 83 человек сыворотки крови вызывали достоверное повышение уровня общего холестерина в макрофагах, т. е. обладали атерогенными свойствами. Не выявлено корреляции между атерогенностью крови больных ИБС и содержанием в сыворотке общего холестерина, триглицеридов, апо-А1, апо-В и ХС ЛПВП. Полученные данные свидетельствуют о наличии прямой корреляции между аккумуляцией липидов в ГМК и макрофагах, а также о том, что способность выявлять атерогенность сыворотки крови.
При использовании перитонеальных макрофагов не отличается от данных, полученных ранее при использовании ГМК интимы аорты. Во время культивирования перитонеальные макрофаги аккумулируют свободный и эстерифицированный холестерин, триглицериды, т. е. те же липиды, которые при инкубации включают в себя ГМК интимы аорты.
Использование ГМК затруднено из-за сложностей получения асептического материала в достаточном для работы объеме. Человеческие и особенно мышиные макрофаги лишены этих недостатков. Эти факты доказывают, что культура перитонеальных макрофагов вместе с культурой ГМК интимы аорты может быть использована как тест-система для оценки атерогенного потенциала сыворотки крови. Макрофаги, возможно, являются одним из главных клеточных акцепторов липидов в сосудистой стенке.
Давно уже было показано наличие макрофагов, насыщенных липидами, в атеросклеротических бляшках. Экспериментальные работы, в которых использовалась культура клеток, выявили способность макрофагов интенсивно накапливать эфиры холестерина при инкубации с химически модифицированными липопротеидами. Использование культуры макрофагов позволит продолжить изучение природы атерогенности сыворотки крови больных ИБС и ее роли в патогенезе атеросклероза. Рис. 1 Связь между накоплением холестерина в клетках и концентрацией сыворотки По оси абсцисс - концентрация сыворотки в по оси ординат - содержание холестерина в мкг на 1 мг белка в человеческих а и мышиных б макрофагах 2 - культивирование в сыворотках здоровыхдоноров,3,4- больных ИБС. Рис.1А Связь между накоплением холестерина в клетках и временем инкубации. По оси абсцисс-время инкубации в ч. Остальные обозначения те же, что и на рис 1 ВЛИЯНИЕ ГАМК, ГОМК И ГЛУТАМИНОВОИ КИСЛОТЫ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ФАГОЦИТОВ За последние годы проводится интенсивное изучение роли нейроактивных аминокислот в иммунологических процессах.
Это связано с широким использованием данных аминокислот в неврологической и психиатрической практике, однако одновременно с их прямыми эффектами получены данные об их влиянии на иммунологические процессы.
Получены данные о влиянии гамма-аминомасляной ГАМК , гамма-оксимасляной ГОМК и глутаминовой кислот на количество антителообразующих, розеткообразующих клеток и другие показатели иммунитета.
Опыты проводились в двух сериях в I серии на интактных мышах изучалось влияние нейроактивных аминокислот на функциональное состояние МФ и нейтрофилов. Во II серии влияние тех же веществ на состояние фагоцитов изучалось на фоне предварительной иммунизации животных. Иммунизацию проводили 5 взвесью эритроцитов барана в количестве 1 мл на 3-й день после введения препарата. Контрольную группу составляли интактные мыши, получавшие физиологический раствор контроль I , и животные, получавшие физиологический раствор и иммунизированные эритроциты барана контроль II . Введение интактным животным I серия нейроактивных аминокислот сопровождалось существенными сдвигами активности кислой фосфатазы в МФ и нейтрофильных лейкоцитах. Необходимо отметить, что изменение активности в изученных группах носило разнонаправленный характер.
Так, в условиях введения ГАМК активность фермента в МФ и лейкоцитах крови повышалась по сравнению с контрольной группой в 1,7 раза, при введении же ГОМК происходило достоверное снижение активности кислой фосфатазы лишь в МФ. Показатели активности фермента при введении интактным мышам глутаминовой кислоты не отличались от таковых контрольной группы.
Изучение влияния биологически активных веществ на фоне предварительной иммунизации эритроцитами барана во всех опытных группах II серии выявило существенное понижение активности кислой фосфотазы в нейтрофильных лейкоцитах. Относительно низкие показатели активности в изучаемых клетках крови были зарегистрированы при введении ГОМК и глутаминовой кислоты, которые были ниже соответственно в 2 и 1,4 раза контрольного уровня.
Активность изучаемого фермента в МФ опытных групп II серии не отличалась от таковой в контроле, за исключением группы, в которой на фоне иммунизации вводили ГОМК, где содержание кислой фосфатазы понижалось почти в 2 раза. В серии проведенных цитологических исследований было установлено, что нейроактивные аминокислоты в испытуемых дозах не вызывают в клетках фагоцитарного ряда дистрофических и деструктивных изменений.
Так, ни в одной изучаемой группе I серии не было выявлено признаков распада, фрагментации и лизиса цитоплазмической и ядерной мембран, пикноза и рексиса ядер. В то же время в группах, где вводили ГАМК и ГОМК, ядра моноцитов выглядели гипертрофированными и гипохромными, цитоплазма-умеренно вакуолизированной. Не исключено, что нейроактивные аминокислоты в биологически допустимых дозах не оказывают цитотоксического влияния на моноциты и нейтрофильные лейкоциты в крови интактных мышей.
Однако существенные сдвиги в активности основного маркёра лизосом-кислой фосфатазы наводят на мысль, что изучаемые биологически активные вещества, не оказывая непосредственного токсического действия на клеточную мембрану, вызывают все-таки дестабилизацию внутриклеточных мембранных структур, и, в первую очередь, лизосомальных. Принимая во внимание то обстоятельство, что активность лизосомальных ферментов во многом зависит от функционального состояния мембран, а точнее-от степени её проницаемости, была проведена специальная серия экспериментов по изучению проницаемости лизосомальных мембран при помощи прижизненного флюорохромирования фагоцитов акридиновым оранжевым АО . Результаты исследований с применением АО показали, что изменение тинкториальных свойств клеток-мишеней наблюдалось при введении в организм мышей всех исследуемых нейроактивиых аминокислот.
При введении ГАМК, ГОМК и глутаминовой кислоты период полураспада Т 1 2 заметно сокращается, а при экспозиции Т а, в течение которого происходит поэтапное изменение тинкторнальных свойств составных компонентов клеток цитоплазма, ядро, участки локализации лизосом, количество фагоцитов с зеленой флюоресценцией ядер в опытных группах I серии достоверно снижалось.
Аналогичная направленность четко прослеживалась во всех опытных группах II серии. Резюмируя вышеизложенное, можно заключить, что нейроактивные аминокислоты оказывают существенное влияние на активность кислой фосфатазы в фагоцитах. Особо следует отметить, что полученный эффект в группах введения ГАМК и ГОМК был диаметрально противоположным этот факт прослеживается наиболее четко в тех случаях, когда в качестве объекта изучения активности кислой фосфатазы выступали МФ. Введение же ГАМК и глутаминовой кислоты на фоне предварительной иммунизации не отражалось на активности кислой фосфатазы в МФ, в то время как в нейтрофильных лейкоцитах все изучаемые нейроактивные аминокислоты вызывали достоверное понижение активности фермента.
Эксперименты с применением в качестве индикатора проницаемости лизосомальных мембран АО показали, что нейроактнвные аминокислоты, не обладая цитодеструктивным действием па клетки-мишени, вызывают дестабилизацию лизосомальных мембран, направленную в сторону увеличения их проницаемости.
Сопоставление показателей проницаемости лизосомальных мембран животных I и II серий показывает, что для повышения проницаемости под влиянием нейроактивных аминокислот формирование гуморального иммунитета является условием необязательным.
Таким образом, нейроактивные аминокислоты оказывают избирательное влияние на морфофункциональное состояние лизосомального аппарата фагоцитов. Это подтверждается полученными данными о проницаемости лизосомальных мембран в отношении токсического красителя и количественного определения активности основного маркера лизосом - кислой фосфотазы. IV. Заключение Приведенная лишь малая часть экспериментов по моделированию различных воздействий, говорит в пользу того, что процессы нарушений или изменения фагоцитирующей активности очень удобно изучать путем постановки опытов на перитонеальных МФ. Можно сказать, что данная модель давно стала базовой для проверки разнообразных химических и фармакологических препаратов в качестве агентов, воздействующих на клеточное звено иммунитета для изучения процессов взаимодействия инфекционных агентов с фагоцитами.
Также она используется для изучения не только фагоцитарной функции - но и наоборот, различных процессов, связанных с самими инфекционными агентами.
Можно упомянуть, что проводятся исследования по изучению фагоцитов перитонеального экссудата у генетически диабетических мышей, у генетически иммунодепрессивных крыс и т.д. Конечно те данные, которые получают исследователи достаточно относительны, ведь несмотря на высокое качество проводимых опытов, они все же проводятся in vitro, что неизменно накладывает свой отпечаток - клетки здесь лишены той гаммы цитокиновых воздействий, которая присутствует в живом организме, они не взаимодействуют со стромальными компонентами и другими клетками.
Достоинством метода является его простота, доступность и, что немаловажно, наглядность, а также высокая скорость получения результатов и широкие возможности по постановке регистрационных реакций. Однако, как видно, этим в современной патологии мы не можем ограничиться. Поэтому в современных научных и клинических исследованиях применяют и другие методы и модели.
О некоторых из них кратко будет рассказано ниже.