Макрофаги перитонеального экссудата как модель фагоцитоза и нарушений фагоцитарной активности

Санкт-Петербургский государственный университет им. акад. И.П.Павлова КАФЕДРА ПАТОФИЗИОЛОГИИ РЕФЕРАТ Макрофаги перитонеального экссудата как модель фагоцитоза и нарушений фагоцитарной активности Выполнил студент Карпов С.А. 305 группы лечебного факультета Преподаватель Степанян М.Л. Санкт-Петербург 2002 Содержание Краткий экскурс в историю 2 Современное состояние учения о фагоцитозе 5 Макрофаги перитонеального экссудата как модель фагоцитоза и нарушений фагоцитарной активности .13 Получение модели .14 Методы регистрации результатов 14 Некоторые моделируемые процессы СНИЖЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ МЫШЕИ В УСЛОВИЯХ СОЧЕТАННОГО ПРИМЕНЕНИЯ СТАФИЛОКОККОВОГО ЭНТЕРОТОКСИНА ТИПА А И ЭНДОТОКСИНА 17 РОФАГОВ 18 УСИЛЕНИЕ С ПОМОЩЬЮ ХИТОЗАНА РЕАКЦИИ КОНТАКТНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МАКРОФАГА С ТИМОЦИТАМИ in vitro 19 АКТИВАЦИЯ ФАГОЦИТАРНЫХ КЛЕТОК И КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА СИНТЕТИЧЕСКИМИ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТАМИ 20 АКТИВАЦИЯ МАКРОФАГОВ ПОД ВЛИЯНИЕМ СИНТЕТИЧЕСКОГО АНТИОКСИДАНТА 22 ФАГОЦИТАРНАЯ АКТИВНОСТЬ МАКРОФАГОВ ПЕРИТОНЕАЛЬНОГО ЭКССУДАТА МЫШЕЙ ДЕЙСТВИИ ПРЕПАРАТОВ ПЛАТИНЫ 23 ИЗУЧЕНИЕ ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ В ОТНОШЕНИИ YERSINIA PESTIS С ДЕФЕКТНЫМИ И ПОЛНОЦЕННЫМИ FRA-ГЕНАМИ 25 ФАГОВ .26 ПЕРИТОНЕАЛЬНЫЕ МАКРОФАГИ КАК МОДЕЛЬ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ АТЕРОГЕННОГО ПОТЕНЦИАЛА СЫВОРОТКИ КРОВИ 29 ВЛИЯНИЕ ГАМК, ГОМК И ГЛУТАМИНОВОИ КИСЛОТЫ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ФАГОЦИТОВ 32 Заключение . 33 Некоторые другие модели изучения фагоцитоза 34 Литература 36 Краткий экскурс в историю Более 100 лет прошло с момента открытия фагоцитарной теории, созданной нашим великим натуралистом, лауреатом Нобелевской премии И. И. Мечниковым.

Открытие, осмысление явления фагоцитоза и формулирование в общих чертах основ фагоцитарной теории было сделано им в декабре 1882 г. В 1883 г. он изложил основы новой фагоцитарной теории в докладе О целебных силах организма в Одессе на VII съезде естествоиспытателей и врачей и опубликовал их в печати.

Были впервые высказаны основные положения фагоцитарной теории, которые И. И. Мечников развивал в последующем на протяжении всей своей жизни.

Хотя сам факт поглощения живыми клетками других частиц был описан многими натуралистами задолго до ученого, однако только он дал блестящее толкование огромной роли фагоцитов в защите организма от болезнетворных микробов.

Много позже к 70-летнему юбилею ученого коллега и друг И. И. Мечникова Эмиль Ру напишет Сегодня, мой друг, Вы наблюдаете доктрину фагоцитоза со спокойным удовлетворением отца, дитя которого сделало хорошую карьеру в мире, но сколько беспокойств оно Вам доставило! Его появление вызвало протесты и сопротивление и в течение двадцати лет Вам пришлось сражаться за него. Доктрина фагоцитоза одна из наиболее плодотворных в биологии она связала явление иммунитета с внутриклеточным пищеварением, она объяснила нам механизм воспаления и атрофии она оживила патологическую анатомию, которая, не будучи в состоянии дать приемлемое объяснение, оставалась чисто описательной Ваша эрудиция такая обширная и верная, что она служит всему миру. И. И. Мечников утверждал, что иммунитет в инфекционных болезнях должен быть приписан активной целлюлярной деятельности.

Среди клеточных элементов фагоциты должны занять первое место.

Чувствительность и подвижность, способность поглощать твердые тела и вырабатывать вещества, могущие разрушать и переваривать микробов - вот главные факторы деятельности фагоцитов.

Если эти свойства в достаточной мере развиты и парализуют патогенное действие микробов, тогда животное от природы иммунно когда фагоциты не обнаруживают наличия всех или одного из этих свойств в достаточной степени, то животное восприимчиво к инфекции. Вместе с тем, если бактериальные продукты вызывают у фагоцитов отрицательный хемотаксис или, если при положительном хемотаксисе фагоциты не поглощают бактерий или поглощают, но не убивают их также развивается смертельная инфекция.

Решение фундаментальных проблем сравнительной эмбриологии и биологии, приведшее к крупнейшим открытиям ученого, позволило И. И. Мечникову установить, что фагоцитоз чрезвычайно распространен в животном мире как на самой низшей ступени животной лестницы, например, у простейших, так и у млекопитающих животных и человека фагоциты представляют собой мезенхимальные клетки. И. И. Мечников был в то же время первым, кто занялся сравнительным изучением явления фагоцитоза.

Внимание ученого было обращено не только на традиционные лабораторные объекты, но и на таких представителей мира животных, как дафнии, морские звезды, крокодилы, обезьяны. Сравнительное изучение фагоцитоза было необходимо И. И. Мечникову для доказательства всеобщности явлений поглощения и разрушения чужеродного материала фагоцитирующими мононуклеарами, широкого распространения в природе изучаемой им формы иммунологической защиты.

Клеточная теория Мечникова сразу наткнулась на сопротивление. Прежде всего она была предложена в то время, когда большинство патологов видели в воспалительной реакции, а также в связанных с ней микрофагах и макрофагах не защитную, а вредоносную реакцию. В то время считали даже, что, хотя фагоцитирующие клетки действительно способны поглощать болезнетворные микроорганизмы, это приводит не к разрушению возбудителя, а к переносу его в другие части тела и распространению болезни.

Также в тот период времени интенсивно развивалась гуморальная теория иммунитета, основы которой были заложены П.Эрлихом. Были открыты антитела и антигены, были выявлены механизмы гуморальной устойчивости организма против некоторых патогенных микроорганизмов и их токсинов дифтерия, столбняк и др Как это ни странно, но два таких открытия не могли некоторое время ужиться вместе.

Позднее в 1888 г. Наттолл нашел в сыворотке нормальных животных вещества, токсичные для некоторых микроорганизмов, и показал, что такие антибактериальные свойства значительно повышаются в результате иммунизации животного. В дальнейшем было обнаружено, что в сыворотке имеются два разных вещества, совместное действие которых приводит к лизису бактерий термостабильный фактор, затем идентифицированный как сывороточные антитела, и термолабильный фактор, названный комплементом, или алексином от греч. aleksein - защищать. Ученик самого Мечникова Борде описал лизис эритроцитов гуморальными антителами и комплементом, и большинство исследователей стали соглашаться с Кохом, что победу одержали гуморалисты. Мечников и его ученики отнюдь не собирались сдаваться.

Были поставлены простые опыты, в которых микробы, помещенные в маленький мешочек из фильтровальной бумаги, защищающий их от фагоцитов, сохраняли свою вирулентность, хотя буквально купались в тканевой жидкости, богатой антителами.

В Англии сэр Элмрот Райт и С. Р. Дуглас попытались примирить различия между этими двумя школами в своих капитальных исследованиях процесса опсонизации от греч. opsonein - делать съедобным. Эти ученые утверждали, что клеточный и гуморальный факторы являются одинаково важными и взаимозависимыми в том отношении, что гуморальные антитела, специфически реагируя со своей мишенью - микроорганизмом, подготавливают его к фагоцитозу макрофагами.

В 1908 г. Шведская академия удостоила Нобелевской премии по медицине совместно Мечникова - основателя клеточного направления и Эрлиха - олицетворявшего гуморалистские идеи того времени. Они были удостоены премии в качестве признания их работ по иммунитету. Заслуга Мечникова состоит не только в создании им гениальной теории. Еще ранее он начал изучать заразные болезни человека и домашних животных вместе со своим учеником Н. Ф. Гамалеей он изучал туберкулез, чуму рогатого скота, искал способы борьбы с вредителями сельского хозяйства.

К 1886 г. относится одно из важнейших событий в истории русской медицины. Летом этого года в Одессе начала работать созданная Мечниковым и его талантливым учеником Н. Ф. Гамалеей первая русская бактериологическая станция. Он создал в России крупнейшую научную школу микробиологов. Выдающиеся ученые Н. Ф. Гамалея, Д. К. Заболотный, Л. А. Тарасевич и многие другие были учениками И. И. Мечникова. Илья Ильич Мечников умер в 1916 году, до конца жизни занимаясь вопросами иммунологии и клеточного иммунитета.

А наука об иммунитете быстро и стремительно развивалась. В этот период было необычайно много работ и ученых, изучавших факторы внутренней защиты организма. Период с 1910 по 1940гг. был периодом серологии. В это время было сформулировано положение о специфичности и о том, что АТ являются естественными, высоковариабельными глобулинами. Большую роль здесь сыграли работы Ландштейнера, который пришел в выводу, что специфичность антител не является абсолютной.

С 1905 появились работы Сarrel, Guthrie по трансплантации органов. В 1930г. К.Ландштейнер открывает группы крови. Работами по фагоцитозу, бактериофагии, вирусам, патогенезу чумы занимается Амадей Боррель. Премия присуждена Ф. Макфарлейну Бернету 1899 - 1985 и Питеру Медавару 1915 - Англия за открытие приобретенной иммунолотической толерантности. Медавар показал, что отторжение чужеродного кожного трансплантата подчиняется всем правилам иммунологической специфичности, и в основе его лежат такие же механизмы, как и при защите от бактериальных и вирусных инфекций.

Последующая работа, которую он провел вместе с рядом учеников, заложила прочную основу для развития трансплантационной иммунобиологии, которая стала важной научной дисциплиной и в дальнейшем обеспечила многие достижения в области клинической трансплантации органов. Бернет опубликовал книгу Образование антител 1941 г Со своим коллегой, Франком Феннером, Бернет утверждал, что способность к иммунологическим реакциям возникает на сравнительно поздних стадиям эмбрионального развития и при этом происходит запоминание существующих маркеров своего у антигенов, присутствующих в данный момент.

Организм в последующем приобретает к ним толерантность и не способен отвечать на них иммунологической реакцией. Все антигены, которые не запомнились, будут восприниматься как не свои и смогут в дальнейшем вызывать иммунологический ответ. Было высказано предположение, что любой антиген, введенный в течение этого критического периода развития, будет затем восприниматься как свой и вызывать толерантность, в результате чего не сможет в дальнейшем активировать иммунную систему.

Эти идеи были далее развиты Бернетом в его клонально-селекционной теории образования антител. Предположения Бернета и Феннера были подвергнуты экспериментальной проверке в исследованиях Медавара, который в 1953 г. на мышах чистых линий получили четкое подтверждение гипотезы Бернета - Феннера, описав феномен, которому Медавар дал название приобретенной иммунологической толерантности. В 1969г. одновременно несколькими авторами Р.Петров, М.Беренбаум, И.Ройт была предложена трехклеточная схема кооперации иммуноцитов в иммунном ответе Т В-лимфоцитов и макрофагов, определившая на многие годы изучение механизмов иммунного ответа, субпопуляционной организации клеток системы иммунитета.

Существенную роль в этих исследованиях сыграли кинематографические методы. Возможность непрерывного динамического изучения микробиологических объектов in vivo и in vitro в условиях, совместимых с их жизнедеятельностью, визуализация невидимых для человеческого глаза электромагнитных излучений, регистрация как быстрых, так и медленных процессов, управление масштабом времени и некоторые другие характерные особенности исследовательской кинематографии открыли большие и во многих отношениях уникальные возможности для изучения взаимодействия клеток.

Представление о фагоцитах за истекшее время подверглось существенной эволюции. В 1970 г. Van Furth и соавт. предложили новую классификацию, выделяющую МФ из РЭС в отдельную систему мононуклеарных фагоцитов.

Исследователи отдали дань уважения И. И. Мечникову, пользовавшемуся термином мононуклеарный фагоцит еще в начале XX века. Фагоцитарная теория не стала, однако, неизменяемой догмой. Непрерывно накопляемые наукой факты изменили и усложнили понимание тех явлений, в которых фагоцитоз казался решающим или единственным фактором.

Можно утверждать, что в наши дни созданное И. И. Мечниковым учение о фагоцитах переживает свое второе рождение, новые факты значительно обогатили его, показав, как это и предсказывал Илья Ильич, огромное общебиологическое значение. Теория И. И. Мечникова явилась мощным индуктором прогресса иммунологии во всем мире, большой вклад в него внесли советские ученые. Однако и сегодня основные положения теории остаются незыблемыми. Первостепенное значение фагоцитарной системы подтверждается созданием в США общества ученых, занимающихся изучением ретикулоэндотелиальной системы РЭС , издается специальный Journal of Reticulo-Endothelial Society. В последующие годы развитие фагоцитарной теории связано с открытием цитокиновой регуляции иммунного ответа и, конечно, изучения влияния цитокинов на клеточный ответ в том числе и макрофагов. На заре этих открытий стоя ли работы таких ученых, как Н.Ерне, Г. Келер, Ц. Милштейн.

В СССР бурный интерес к фагоцитам и связанным с ними процессами наблюдался в 80-е годы. Здесь необходимо отметить работы А.Н.Маянского, изучавшего влияния макрофагов не только в свете их иммунной функции.

Он показал значение клеток РЭС на функционирование таких органов как печень, легкие, желудочно-кишечный тракт. Работы также проводили А.Д. Адо, В.М.Земсков, В.Г.Галактионов, эксперименты по изучению работы МФ в очаге хронического воспаления ставил Серов. Следует сказать, что в 90-е годы интерес к неспецифическому звену иммунитета упал. Отчасти это можно объяснить тем, что все усилия ученых были в основном устремлены к лимфоцитам, но особенно - к цитокинам.

Можно сказать, что сейчас продолжается цитокиновый бум. Однако это ни в коем случае не означает, что актуальность проблемы упала. Фагоцитоз составляет пример того процесса, интерес к которому не может пропасть. Будет открытие новых факторов стимулирующих его активность, будут обнаружены вещества угнетающие РЭС. Будут открытия, уточняющие тонкие механизмы взаимодействия МФ с лимфоцитами, с клетками интерстиция, с антигенными структурами. Особенно это может быть актуально сейчас в связи с проблемой опухолевого роста и СПИДа. Остается надеяться, что в ряду открытий, начатых великим Мечниковым, будут стоять имена русских ученых.

Современное состояние учения о фагоцитозе

Не исключена и другая альтернатива. Подобие моноцитов может быть чисто... Давно обнаружена способность некоторых бактерий тормозить образование ... В наиболее общем виде она сводится к фокусированию клеточных реакций н... Наработка СЗ-опсонинов связана с его каскадной активацией и сочетается... Важен вопрос об отношении фагоцитоза к приобретенному специфическому и...

Макрофаги перитонеального экссудата как модель фагоцитоза и нарушений фагоцитарной активности. В организме человека фагоцитирующую функцию выполняют несколько типов клеток. Прежде всего, это те клетки, которые осуществляют защиту при каких-либо инфекциях и инвазиях - макрофаги, моноциты и нейтрофилы.

В меньшей степени она представлена у эозинофилов и базофилов. Кроме того, общеизвестным является тот факт, что в различных тканях фагоцитирующую функцию берут на себя помимо вездесущих макрофагов специфические клеточные элементы данной ткани, например фиброкласты, остеокласты, клетки микроглии. Также нельзя забывать о том, что к тем немаловажным клеткам, благодаря которым идет специфический иммунный ответ, относятся дендритные клетки, широко представленные в местах, являющихся барьерными в организме.

И хотя их фагоцитирующая функция до конца не доказана, данные о том, что это так, есть. Существуют различные методы изучения фагоцитирующей активности у клеток, перечисленных выше. В данном реферате будут рассмотрены методы изучения тех фагоцитов, у которых фагоцитирующая функция наиболее выражена и которые представляют исключительную важность в иммунной системе человека, а их патология носит тяжелый характер.

Речь идет о макрофагах МФ . Они хорошо поддаются изучению in vivo и in vitro, культивированию моделирование различных процессов на этих клетках получило широкое распространение и дало хорошие результаты. Это обусловлено их крупными размерами, широчайшей распространенностью в организме, активностью метаболических процессов, протекающих в них, разнообразием функций, на них возложенных. В качестве модели, хорошо себя зарекомендовавшей и наиболее часто используемой в опытах по изучению фагоцитов, можно рассмотреть модель перитонеальных макрофагов in vitro.

Широкое распространение данная модель получила по нескольким причинам. Во-первых, она легко воспроизводится. Во-вторых, она позволяет легко регистрировать результаты исследований. В-третьих, данную модель можно получить как у лабораторных животных крысы, мыши, морские свинки, так и у человека. В-четвертых, при проведении опытов на животных можно использовать различные линии животных в т.ч. нокаут-животных и животных с приобретенными искусственно вызываемыми дефектами иммунитета.

В-пятых, при постановке опытов можно индуцировать септическое и асептическое воспаление, можно перед взятием клеток провести различные воздействия, а на модели лишь зарегистрировать результаты т.е. сама реакция проходит in vivo. Можно приводить также и другие причины, но ограничимся этими. Естественно, эта модель не является единственной, предложены и другие, о которых будет упомянуто ниже. Итак, рассмотрение выбранной модели будет происходить следующим образом 1. Варианты получения модели. 2. Возможные Методы регистрации результатов исследования. 3. Различные варианты моделируемых процессов.

Вопросы, касающиеся практического аспекта использования результатов исследования, будут рассматриваться в каждом случае, а не будут выносится в отдельный раздел. I.

Получение модели

Получение модели. Опыты проводят на белых мышах, крысах, морских свинках в редких случаях на кроликах различных линий CC57 W, CBA, WISTAR , C57BL 6 , а также на нелинейных животных.

Выделяют индуцированные и неиндуцированные МФ. В случае, если необходимы интактные МФ, то животным вводят интраперитонеально стерильный 10 раствор пептона или несколько мл стерильного парафинового масла, можно также использовать 2,5 раствор крахмала в физ. растворе. Обычно, через 48 часов наркотизированное животное забивают, перитонеальную полость промывают и перитонеальную жидкость отсасывают. В полученную жидкость добавляют стабилизатор гепарин, глютатион и антибиотики но только не макролидового ряда чаще используют пенициллин, стрептомицин.

Далее жидкость можно центрифугировать и последующей выдержкой, а можно сразу выдерживать в стеклянных кюветах 2 ч. Основной принцип состоит в том, что макрофаги обладают способностью прикрепляться к стеклу или пластику, тогда как другие клетки этой способностью не обладают. После экспозиции саму среду сливают или промывают и готовят новую, не содержащую гепарин.

Полученная таким образом популяция клеток считается, что состоит на 95 из МФ. Далее клетки помещают на специальные среды N199 с питательными веществами и антибиотиками. Сохраняться такие МФ могут не более 48-72 часов при поддержании оптимальной температуры 37 С и ионно-осмотического баланса. В случае, ежели необходимы активированные МФ, то их активацию проводят путем Иммунизации животного введением различных сывороток или мощных антигенов, Индуцированием очага септического воспаления брюшины введение токсина в р-ре пептона, введение взвеси убитых или живых микроорганизмов. Дальнейшие действия совпадают с уже названными. Представляет интерес также выделение человеческих МФ. Обычно, их получают из асцитической жидкости больных с недостаточностью кровообращения III степени.

Затем их осаждают центрифугированием 400g, 10 мин, замораживают при температуре жидкого азота. После размораживания их помещают в специальные чашки со средой и культивируют. Подчас непосредственно МФ полученные из перитонеального экссудата служат лишь для регистрации опыта поставленного над животным in vivo и их культивирование носит только диагностических характер.

II.Регистрация результатов После постановки опытов возникает резонный вопрос, а как обнаружить изменение активности МФ, как определить те изменения, повлиявшие на работу фагоцитирующих клеток. В нашей стране наиболее широко используется несколько методов. i. Для исследования поглотительной фазы фагоцитоза используют различные тест-объекты.

Ими могут служить кроме микробов эритроциты и различные индифферентные частицы латекса, туши, кармина, коллоидного угля, кадмия. Поглотительную активность фагоцитов оценивают прямым визуальным подсчетом поглощенных микробов или других частиц внутри МФ, а также по числу частиц, оставшихся непоглощенными, например частиц латекса, с помощью электронного счетчика частиц, эритроцитов по концентрации гемоглобина спектрофотометрически, эмульгированных частиц масляного красного со спектрометрической регистрацией или меченных флюоресцеинизотиоцианатом микрококков с помощью флюориметра.

Высокая точность и производительность характеризуют метод изучения фагоцитоза флюоресцирующих частиц латекса с помощью автоматического проточного цитофлюо-риметра. При использовании прямого визуального метода рассчитывают фагоцитарный индекс ФИ - процент фагоцитирующих клеток от общего числа, фагоцитарное число ФЧ - среднее количество частиц, захваченных одной клеткой.

Отдельно учитывают результаты через 1 и 3 ч соответственно ФИ1, ФИ3, ФЧ1 и ФЧ3 , а также коэффициент фагоцитарного числа КФЧ отношение ФЧ1 к ФЧ3 - показатель, характеризующий скорость фагоцитоза. Необходимо помнить, что эффективность всех этих показателей зависит от ряда условий, таких как длительность инкубации, формы дна сосуда - круглой и конической в конических пробирках наблюдались более высокие показатели фагоцитоза, что, видимо, обусловлено стимулирующим влиянием короткодистанционного взаимодействия, pH среды, содержания кислорода и углекислоты. ii. Оценка хемотаксиса лейкоцитов осуществляется двумя распространенными методами. Метод Бойдена основан на принципе прохождения лейкоцитов из одной половины камеры со взвесью клеток в другую половину с хемоатрактантом, разделенных между собой мембранным фильтром.

Для изучения хемотаксиса макрофагов применяют фильтры с размером пор соответственно 5- 8 мкм. Имеющиеся разновидности метода Бойдена включают двухфильтровый и радиоизотопный варианты.

Другой метод основан на хемотаксисе под слоем агарозы. В качестве хемоатрактанта чаще используют обработанную зимозаном или липополисахаридом сыворотку, казеин, фильтрат культуры Е. coli или других микроорганизмов, синтетические формилпептиды. Движение клеток при отсутствии хемотаксического стимула дает характеристику случайной двигательной активности спонтанная миграция фагоцитов. Измерение эластичности клеток также можно осуществить в камерах Бойдена. Адгезивные свойства фагоцитов оценивают по прилипаемости на поверхности стекла или в колонках с бусами.

Между способностью к распластыванию макрофагов, оп- ределяемой под фазово-контрастным микроскопом, и фагоцитозом имеется определенная корреляция iii. Для оценки уровня активности МФ используется полярографический метод потребление кислорода , НСТ-тест восстановление нитросинего тетразолия, йодирование переход радиоактивного меченого йода в кислотонерастворимый осадок, окисление глюкозы образование молекул 14СО2 при окислении глюкозы-1-14С . Данные тесты основаны на том, что активация МФ сопровождается кислородзависимым метаболическим взрывом. Классическим из данных методов стал НТС-тест. Дело в том, что активированные фагоциты способны поглощать нитросиний тетразолий НСТ и восстанавливать его в формазан.

НСТ-тест позволяет дифференцировать активированные и интактные фагоциты, но его нельзя считать количественным, так как визуальная оценка результатов субъективна iv. Также для определения бактерицидной способности МФ используется хемолюминесцентный метод, предложенный сравнительно недавно.

Как известно, фагоцитоз нейтрофилами и макрофагами сопровождается генерацией активных форм кислорода О2 Н2О2, ОН индуцирующих явление хемилюминесценции. Последняя пропорциональна интенсивности генерации фагоцитами активных форм кислорода и может служить косвенным критерием их фагоцитарной способности, тем более что образуемые продукты обладают выраженными бактерицидными свойствами.

Метод анализа хемилюминесценции используется в клинике и эксперименте. Среди методов регистрация хемилюминесценции ХЛ является наиболее чувствительным и информативным методом функциональной оценки фагоцитирующих клеток, но вместе с тем и одним из наиболее сложных, не столько в методическом плане, сколько в понимании природы биохимических и физических процессов, которые приводят к излучению света. Механизмы, лежащие в основе ХЛ фагоцитов, сложны и недостаточно изучены. Свечение может возникать в реакции O2 O1 2O2 hV, важную роль могут играть радикалы ОН Анализ различных ингибиторов свечения приводит к мысли, что синглетный кислород, гидроксильный радикал и перекись водорода вовлечены в процесс ХЛ. ХЛ фагоцитирующих клеток значительно усиливается в присутствии люминола или люцигенина.

Предложено много методов регистрации ХЛ фагоцитарных клеток, эти методы можно разделить на 2 основных класса Регистрация собственной ХЛ. Усиление собственной ХЛ фагоцитирующих клеток наблюдается при стимуляции опсонизированным зимозаном, бактериями, частицами латекса.

Собственная ХЛ клеток имеет низкую интенсивность и лежит в широком спектральном диапазоне с максимумом в области 400-500 нм. Регистрация ХЛ требует высокий чувствительности прибора и достаточного количества выделения клеток обычно не менее 106 клеток. Эритроциты, гемоглобин, сыворотка крови ингибируют ХЛ. 2. ХЛ в присутствии люминола. Свечение имеет на 2- 3 порядка большую интенсивность, чем собственная ХЛ. Усиление ХЛ наблюдается при действии зимозана, бактерий, частиц латекса, комплексов антиген - антитело, ионофора кальция, хемотаксических пептидов.

ХЛ может наблюдаться в суспензии как выделенных, клеток, так и клеток в сыворотке крови. Таким образом, хемилюминесцентный метод позволяет проводить быструю количественную оценку фагоцитарной и бактерицидной активности клеток. Он может использоваться при исследовании малых количеств биологического материала крови, или может служить как для оценки состояния клеток, так и для оценки опсонической активности сыворотки и влияния лекарственных препаратов. v. Наиболее точными и быстрыми методами определения фагоцитарной активности лейкоцитов являются радиометрические.

Так, поглотительную способность оценивают по уровню включения изотопа в фагоцитирующие клетки. Для этого используют меченные Сr эритроциты, радиоактивную масляную эмульсию или микробы, меченные 14С-глицином, 3Н-лейцином, 3Н-уридином, или частицы 192Ir. Иногда фагоцитоз оценивают по уменьшению метки 32Р во внеклеточной среде.

Радиометрические методы отличаются быстротой постановки и объективностью оценки результатов. Как правило, в конце инкубации микробов с фагоцитами последние разрушают осмотическим лизисом, замораживанием - оттаиванием или дезоксихолатом натрия, затем добавляют на 30 мин при 37 С 3Н-тимидин и подсчитывают радиоактивность осажденных на фильтре бактерий. С помощью двойной метки определяют одновременно поглотительную и бактерицидную функцию лейкоцитов.

Для этого предварительно метят микробы одним из изотопов 14С-фенилаланин, 14С-ацетат натрия, а затем в конце инкубации разрушают фагоциты и вносят 3Н-тимидин. Радиоактивность первоначально меченых микробов, включенных в фагоциты, будет отражать их поглотительную функцию, а радиоактивность, включенная в микробы, после разрушения фагоцитов будет характеризовать их бактерицидность. Существуют авторадиографические методы оценки завершенности фагоцитоза по включению изотопа в процессе инкубации на стеклах монослоя фагоцитов с микробами. vi. Одним из показателей функциональной активности макрофагов является уровень активности 5-нуклеотидазы.

Активность данного фермента определяют в суспензии не разрушенных МФ по методу Туманян и Кириличевой. Метод отличается простотой и точностью, достоверностью, достаточно часто используется. III.Некоторые моделируемые процессы. СНИЖЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ МЫШЕИ В УСЛОВИЯХ СОЧЕТАННОГО ПРИМЕНЕНИЯ СТАФИЛОКОККОВОГО ЭНТЕРОТОКСИНА ТИПА А И ЭНДОТОКСИНА Механизмы патогенного действия стафилококковых энтеротоксинов СЭ изучены недостаточно.

Известно, что блокада ретикулоэндотелиальной системы РЭС торотрастом повышает чувствительность животных к рвоте, индуцированной СЭ. Это предполагает, что функциональный статус РЭС играет важную роль в ответе организма на энтеротоксин. Данные литературы свидетельствуют и о возможности влияния СЭ на функционирование фагоцитирующих клеток.

Во-первых, введение СЭ обезьянам через желудочный зонд приводит к развитию острого гастроэнтерита с экссудацией нейтрофилов, макрофагов и другими признаками воспаления. Во-вторых, важнейшим свойством СЭ является способность сенсибилизировать животных к летальному действию эндотоксинов грамотрицательных бактерий липополисахарид - ЛПС , что ставит их в один ряд с веществами, вызывающими гиперактивацию РЭС, и также оказывающими сенсибилизирующее действие. Принимая во внимание постоянный контакт организма с условно-патогенными бактериями, а соответственно и с эндотоксинами кишечной микрофлоры, исследование макрофагальных функций, ответственных за элиминацию микроорганизмов в условиях воздействия СЭ и при сочетанием применении их с ЛПС, приобретает особую актуальность.

В связи с этим, задачей опыта явилось изучение основных закономерностей изменения фагоцитарной и бактерицидной функций макрофагов под действием СЭ типа А СЭА и ЛПС. I серию опытов по изучению фагоцитарной и бактерицидной активности проводили с макрофагами, полученными от мышей следующих групп 1-я - через 2 ч после инъекции энтеротоксина, 2-я и 3-я - через 24 ч после введения СЭА и ЛПС в отдельности, 4-я - через 24 ч после введения эндотоксина на фоне СЭА. СЭА вызывал двукратное снижение общего числа клеток уже через 2 ч после инъекции через 24 ч общее количество клеток по-прежнему оставалось пониженным.

Если ЛПС у интактных мышей способствовал увеличению выхода клеток в брюшную полость, то на фоне СЭА их количество не только не возрастало под действием ЛПС, а даже достоверно уменьшалось по сравнению с контролем.

Изучение фагоцитарной и бактерицидной активности макрофагов через 2 ч после введения мышам СЭА выявило их заметное снижение по сравнению с показателями для контрольных животных. Через 24 ч после инъекции СЭА и ЛПС в отдельности наблюдалось усиление фагоцитоза. Выявленные закономерности изменения фагоцитарной функции макрофагов вполне согласуются с данными литературы, посвященными изучению клиренса угля у кроликов после введения стафилококковых знтеротоксинов.

Н. Sugiyama также наблюдал бифазовые изменения фагоцитарной функции РЭС подавление степени клиренса угля через 2ч после инъекции, сменяющееся его увеличением через сутки. Бактерицидная активность макрофагов, полученных через 24 ч после обработки животных отдельно СЭА и ЛПС, также возрастала. В случае же совместного введения указанных токсинов функция поглощения изменялась незначительно, зато степень завершенности фагоцитоза резко снижалась.

Необходимо отметить, что исследование морфологического состава клеток перитонеального экссудата мышей через 24 ч после инъекции СЭА и ЛПС не выявило существенных различий в процентном соотношении макрофагов в опытных группах животных. Поэтому можно утверждать, что выявленные изменения фагоцитарной и бактерицидной функций обусловлены влиянием исследуемых токсинов. Для уточнения характера влияния СЭА и ЛПС на функциональную активность макрофагов следующую серию опытов провели в системе in vitro.

С этой целью резидентные перитоне-альные макрофаги, полученные от интактных животных, инкубировали с токсинами в течение 24 ч. В данном случае функция поглощения изменялась в меньшей степени. Бактерицидная активность, также как и в опытах in vivo, повышалась под действием СЭА и ЛПС в отдельности. При одновременном добавлении токсинов к макрофагам бактерицидная функция увеличивалась, а в условиях, приближающихся к таковым in vivo, т. е. при добавлении ЛПС через 4 ч после СЭА, способность макрофагов убивать Staph. aureus также резко снижалась.

Таким образом, в условиях сочетанного применения СЭА и ЛПС происходит резкое снижение функции завершенного фагоцитоза макрофагов. Тот факт, что в условиях in vitro прослеживаются те же закономерности, что и в системе in vivo, предполагает, что СЭ оказывает непосредственное действие на макрофагальные функции. Учитывая, что фагоцитирующие клетки представляют собой первую линию защиты от чрезвычайно распространенных условно-патогенных микробов, снижение бактерицидных свойств в условиях синергического действия СЭ с эндотоксинами грамотрицательных бактерий в организме может привести к развитию тяжелых септических осложнений.

ОТМЕНА УСИЛИВАЮЩЕГО ФАГОЦИТОЗ ДЕЙСТВИЯ ОПСОНИНОВ С ПОМОЩЬЮ ФРАГМЕНТОВ АНТИТЕЛ ПРОТИВ Fc-РЕЦЕПТОРОВ МАКРОФАГОВ Один из наиболее важных и давно установленных иммунологических феноменов - усиление захвата фагоцитирующими клетками корпускулярных антигенов после их сенсибилизации IgG-антителами - оставался продолжительное время малоизученным.

После выяснения принципов структурной организации молекулы IgG и обнаружения на поверхности фагоцитов и в том числе макрофагов рецепторов для Fc-участка IgG было постулировано, что опсонизирующие антитела обеспечивают усиление захвата корпускулярного антигена благодаря взаимодействию Fc-участка молекулы антитела с Fc-рецептором FcR макрофага. Единственным экспериментальным доказательством в пользу этого был факт отсутствия у Fab-фрагментов опсонизирующих антител способности усиливать захват корпускулярного антигена доказательства вовлечения FcR в процесс захвата опсонизированного корпускулярного антигена. Подобный экспериментальный подход нельзя рассматривать как адекватный для прямого доказательства вовлечения FcR в процесс захвата опсонизированного корпускулярного антигена.

Исходя из сказанного, было решено получить прямые доказательства роли FcR в реализации механизма усиления захвата макрофагами корпускулярного антигена, сенсибилизированного IgG-антителами.

Это было достигнуто при оценке влияния на указанный процесс Fab-фрагментов антител против FcR макрофагов, которые, как было установлено, препятствуют взаимодействию с макрофагами агрегированного IgG. Пре-инкубация перитонеальных макрофагов с Fab-фрагментами анти-FcR-антител полностью отменяла эффект усиления захвата макрофагами опсонизированного антигена. В результате опыта было установлено, что Fab-фрагмент IgG из анти-FcR-сыворотки эффективно блокирует FcR мышиных макрофагов, препятствуя связыванию этими клетками гетерологичного агрегированного IgG. Эти данные хорошо согласуются с фактом блокирования FcR перитонеальных макрофагов бивалентными FаЬ-фрагментами из антиFcR. Эти данные в сочетании с результатами контрольных экспериментов, свидетельствующими об отсутствии способности блокировать FcR Fab-фрагментами IgG из антисыворотки против иммунного преципитата, указывают на возможность использования моновалентных Fab-фраг-ментов aнти-FcR-aнтитeл для изучения функции FcR макрофагов в реализации действия опсонинов.

Следует подчеркнуть, что использование моновалентных фрагментов анти-FcR-антител имеет принципиальное значение при изучении функциональной роли FcR, поскольку в отличие от нерасщепленных антител или бивалентных FаЬ-фрагментов моновалентные Fab-фрагменты неспособны, связавшись с FcR, вызвать при 37 С их латеральное перемещение по цитоплазматической мембране и последующий кэппинг.

Полученные данные свидетельствуют, что преинкубация макрофагов с Fab-фрагментами aнти-FcR-антител полностью отменяет эффект усиления фагоцитоза S.typhimurium взятую как объект проверки эффективности фагоцитоза, обусловленный IgG-антителами кролика против этого микроорганизма. Собственно Fab-фрагменты aнти-FcR-антител не оказывают какого-либо влияния на фагоцитоз несенсибилизированных антителами бактерий.

Если к макрофагам предварительно добавляли Fab-фрагменты антител кролика против иммунного преципитата, образованного яичным альбумином и IgG-антителами кролика против этого антигена, это не оказывало никакого влияния на процесс фагоцитоза сенсибилизированных антителами бактериальных клеток. Таким образом, Fab-фрагменты анти-FcR-aнтител избирательно подавляют фагоцитоз только сенсибилизированных антителами бактерий.

С учетом результатов контрольных экспериментов это служит несомненным доказательством в пользу того, что усиление захвата корпускулярного антигена после его опсонизации IgG-антителами обусловленно взаимодействием Fc-уча-стка опсонизирующих антител с FcR макрофагов.

Обращает на себя внимание тот факт, что макрофаги, предварительно обработанные Fab-фрагментами aнти-FcR-антител, менее эффективно поглощают сенсибилизированные антителами бактериальные клетки, чем несенсибилизированные. Этот результат можно объяснить, исходя из представления, что после сенсибилизации бактерий у части из них происходит стерическое экранирование участка клеточной поверхности, посредством которого микроорганизмы прикрепляются к макрофагам.

Фагоцитоз таких бактериальных клеток осуществляется, по-видимому, после взаимодействия двух молекул антител или более через их Fс-участки с несколькими FcR на цитоплазматической мембране макрофага. Если указанное предположение справедливо, захват этой части сенсибилизированных бактериальных клеток будет невозможен после блокирования FcR с помощью Fab-фрагментов aнти-FcR-антител. Полученные в настоящей работе данные открывают новые подходы для регуляции процесса иммунного фагоцитоза, что может иметь существенное значение для детального анализа роли этого процесса при различных патологических состояниях.

УСИЛЕНИЕ С ПОМОЩЬЮ ХИТОЗАНА РЕАКЦИИ КОНТАКТНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МАКРОФАГА С ТИМОЦИТАМИ in vitro

Основные усилия в данном направлении связаны с получением конъюгатов в... При поиске эффективного носителя, который мог бы быть использован при ... В этой же серии опытов решался вопрос об интенсивности взаимодействия ... Как и в предыдущей серии опытов, оптимальная доза, усиливавшая эффект ... Возможно, эффект усиления контактного взаимодействия связан с электрос...

АКТИВАЦИЯ ФАГОЦИТАРНЫХ КЛЕТОК И КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА СИНТЕТИЧЕСКИМИ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТАМИ

Методика исследований была следующей мышам гибридам CBAXC57BL 6 внутри... Дозозависимым оказался ответ клетки, выявляемый по генерации кислородн... Дальнейшее увеличение дозы не сопровождалось повышением действия на кл... Формирование трансплантационного иммунитета изучали у животных, которы... Результаты свидетельствовали, что все 3 препарата вызывали усиление тр...

АКТИВАЦИЯ МАКРОФАГОВ ПОД ВЛИЯНИЕМ СИНТЕТИЧЕСКОГО АНТИОКСИДАНТА

У МФ описана собственная система антиоксидантной защиты, включающая су... Однако на фоне дефекта бактерицидности МФ, индуцированного предварител... Введение оксоплатины и циклоплатама неиммунным мышам вызывало подавлен... Предполагается, что при объяснении подобного явления нельзя оставить б... Исиной в лаборатории И.

ИЗУЧЕНИЕ ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ В ОТНОШЕНИИ YERSINIA PESTIS С ДЕФЕКТНЫМИ И ПОЛНОЦЕННЫМИ FRA-ГЕНАМИ

Это еще требует уточнения. Цель работы - определение вклада фракции I ... Необходима дальнейшая работа по идентификации этих компонентов. МФ инт... Действие последних частично или полностью в присутствии фракции I нейт... pestis по fra-генам и отсутствие фракции I обусловливают более выражен... Учитывая высокую степень гетерогенности опухолевой популяции и усилени...

ПЕРИТОНЕАЛЬНЫЕ МАКРОФАГИ КАК МОДЕЛЬ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ АТЕРОГЕННОГО ПОТЕНЦИАЛА СЫВОРОТКИ КРОВИ

Эти данные позволяют считать, что для определения атеро-генности сывор... обладали атерогенными свойствами. те же липиды, которые при инкубации включают в себя ГМК интимы аорты. ... Иммунизацию проводили 5 взвесью эритроцитов барана в количестве 1 мл н... Показатели активности фермента при введении интактным мышам глутаминов...

Некоторые другие модели изучения фагоцитоза

Модель на фагоцитах сыворотки крови. Конечно, в этом случае объектом н... Также путем внутрисосудистого введения различных веществ можно получит... Ш Очень оригинальная модель была разработана в лаборатории иммунологии... Авторы продемонстрировали связанное с родовой деятельностью увеличение... Попытались выявить связь между наличием родовой деятельности на разных...

Литература

Литература . 1. Д.И. Маянский, Клетка Купфера и система мононуклеарных фагоцитов, Москва, 1983 2. Методы изучения in vitro клеточного иммунитета, под ред. Блума и Глэйда, Москва,1974 3. И.И.Мечников, Лекции по сравнительной патологии воспаления, Москва, 1947 4. Терапевтический архив, 1990, Т62, N11 5. Вопросы медицинской химии, 1988, Т34, Вып.1 6. Лабораторное дело,1984, N5 7. Лабораторное дело,1985, N1 8. Лабораторное дело,1992, N2 9. Лабораторное дело,1989, N4 10. Иммунология, 1983, N1 11. Иммунология, 1983, N2 12. Иммунология, 1987, N6 13. Иммунология, 1989, N4 14. Иммунология, 1999, N1 15. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1988, N1 16. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1989,N11 17. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1990,N1 18. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины,2000, Т129, N6 19. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины,1999, Т127, N4 20. Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии 1990,N5 21. Архив патологии, 1994, Т56, N1 22. Медицинская иммунология, 2001, Т3, N3 23. Экспериментальная и клиническая медицина, 1989, Т29, N3 24. Экспериментальная и клиническая медицина, 1989, Т29, N6 25. Цитология, 1992, Т34,N7 Макрофаги Свободные Резидентные Перитонеальные Печеночные Легочные Активация - не только повышение активности и усиление метаболизма, цитотоксичности, но и увеличение числа вовлеченных в процесс клеток.

Макрофаги Активированные 5 Интактные 95 Активация Специфическая Неспецифическая с помощью Тх1 и АТ разл. фарм. препараты, ЛПС, токсины Модель на перитонеальных МФ Среда 199 пит.в-ва, а б, T 37 Регистрация данных 1. Прямой визуальный подсчет 2. Оценка хемотаксиса методом Бойдена 3. НТС-тест 4. Хемилюминесценция 5. Радиометрия 6. Ферментативные методы 7. Иммунологические методы Цитотоксичность БЦЖ, Циклофосфамид Активация ИЛ-1, ФНО, Ростовые факторы, PG E2 Атипичные клетки не чувствительны к данным агентам Опыт с хитозаном Макрофаг Т-лимфоцит Усиление контактного взаимодействия тимоцитов с макрофагами ИЛ-2, ИФ? Активация МФ.