Векторы для переноса ДНК в клетки животных и растений

Все основные принципы, используемые при конструировании бактериальных векторов, применимы и для получения векторов эукариотических клеток. Как и в случае бактерий, эукариотический вектор представляет собой небольшую молекулу ДНК, способную автономно реплицироваться в клетках животных. Помимо последовательностей нуклеотидов, обеспечивающих репликацию, эукариотические векторы могут содержать гены, используемые в качестве селектируемых маркеров, а также один или несколько уникальных сайтов рестрикции, по которым производится встраивание клонируемых последовательностей нуклеотидов ДНК. Поскольку непосредственное клонирование рекомбинантных ДНК в клетках животных было бы дорогостоящей и малоэффективной процедурой, эукариотические векторы используют, как правило, для получения экспрессии уже клонированных последовательностей нуклеотидов в клетках животных и растений, а сам процесс клонирования проводят в бактериях. Следовательно, эукариотические векторы, помимо всего прочего, должны быть челночными векторами. Для экспрессии в клетках рекомбинантные ДНК помещают под контроль регуляторных элементов, узнаваемых и используемых ферментативными системами эукариотических клеток.

В отличие от бактерий в клетках эукариот внехромосомные, автономно реплицирующиеся генетические элементы типа бактериальных плазмид встречаются редко. Поэтому при конструировании векторов, способных реплицироваться и осуществлять экспрессию в клетках животных, чаще всего используют регуляторные генетические элементы вирусов животных или, в зависимости от задач, эукариотических генов домашнего хозяйства, а также генов, для которых характерна тканеспецифическая экспрессия.

Экспрессирующий вектор pKSV-10. Структура теоретически возможного эукариотического вектора для экспрессии клонированных генов в клетках животных представлена на рис. II.12, из которого видно, что эукариотический вектор сохраняет все основные генетические элементы бактериальных векторов. Это, прежде всего, репликатор (область начала репликации ori), распознаваемый репликативными системами эукариотической клетки. В роли репликатора чаще всего используют соответствующие последовательности нуклеотидов вирусов животных (например вируса SV40 или вируса Эпштейна–Барр). Особенностью функционирования такого репликатора является потребность в вирусных белках для инициации репликации. Так, в случае SV40 – это T-антиген, тогда как у вируса Эпштейна-Барр – белок EBNA (Epstein-Barr nuclear antigen). Для того чтобы репликация векторов, в которых использованы вирусные репликаторы, осуществлялась без вируса-помощника, получили специальные линии клеток, которые стабильно продуцируют соответствующие вирусные белки. Например, в клетках линии COS синтезируется T-антиген вируса SV40, а клетки линии Hep-EBNA-2 экспрессируют ген EBNA.