ДНК-зависимые РНК-полимеразы

В соответствии с субъединичным составом РНК-полимеразы подразделяются на две группы. К первой группе относятся ферменты, состоящие только из одной субъединицы, среди них – РНК-полимеразы митохондрий и небольших бактериофагов, например SP6 и T7. Эти РНК-полимеразы транскрибируют небольшое число генов простых геномов, и для их функционирования не требуется сложных регуляторных воздействий. Вторую группу составляют сложно устроенные РНК-полимеразы бактерий и эукариот, которые представляют собой многосубъединичные белковые комплексы, транскрибирующие сотни и тысячи различных генов. Такие ферменты во время своего функционирования реагируют на многочисленные регуляторные сигналы, поступающие от регуляторных последовательностей нуклеотидов и белковых факторов. Не исключено, что общепринятое разделение РНК-полимераз по структурно-функциональному признаку является упрощением. Имеются данные, указывающие на то, что и просто устроенные фаговые РНК-полимеразы функционируют in vivo в комплексе с другими белками бактериальных клеток, которые могут существенно изменять их ферментативные свойства.

РНК-полимераза E. coli. Наиболее изученной из бактериальных ферментов является РНК-полимераза E. coli. Она осуществляет транскрипцию всех бактериальных генов. Фермент состоит из пяти субъединиц: b‘- (молекулярная масса 165 кДа), b- (155 кДа), двух a- (35 кДа каждая) и s- (чаще всего 70 кДа (s⁷⁰)). Комплекс из четырех субъединиц bb‘aa, часто обозначаемый буквой Е (enzyme), образует так называемый минимальный (кор-) фермент E. coli, который способен осуществлять все основные этапы транскрипции, за исключением правильной инициации (см. ниже). Для инициации транскрипции требуется присутствие определенной регуляторной s-субъединицы, необходимой для распознавания РНК-полимеразой промоторов бактериальных генов, определяющей специфичность взаимодействия РНК-полимеразы с промоторами и, возможно, последующую изомеризацию комплекса РНК-полимераза–промотор, необходимую для начала синтеза РНК. Полный фермент, включающий s⁷⁰-субъединицу, часто называют холоферментом и обозначают Еs⁷⁰. РНК-полимераза Еs⁷⁰ способна транскрибировать большинство (но не все) генов E. coli. В частности, для транскрипции генов теплового шока, оперонов gln или nif требуется включение в состав полного фермента другой регуляторной субъединицы – s⁵⁴ (молекулярная масса 54 кДа) вместо s⁷⁰ с образованием фермента Es⁵⁴. В настоящее время описано до десяти различных s-факторов, объединение которых с минимальным ферментом дает возможность образующимся холоферментам узнавать разные промоторы. Все четыре субъединицы кор-фермента обеспечивают контакт РНК-полимеразы с промоторами. При этом b‘-субъединица участвует в связывании фермента с ДНК, b-субъединица образует каталитический активный центр, а a-субъединицы обеспечивают правильное взаимодействие фермента с промоторами. Утверждения, заключенные в двух последних предложениях, нужно воспринимать с известной долей скепсиса. Данные такого рода обычно получают с использованием ферментов, у которых под действием мутаций изменены конкретные субъединицы, и если, например, мутация в гене a-субъединицы нарушает связывание РНК-полимеразы с ДНК, делаются соответствующие выводы. Такая методология (впрочем, одна из самых плодотворных среди существующих), к сожалению, напоминает известный способ локализации органа слуха у тараканов путем обрывания ног – поскольку тараканы без ног не реагируют на звуки убеганием, делается вывод, что они воспринимают звуковые сигналы ногами. Любая мутантная субъединица в составе олигомерного фермента может изменять его общую конформацию и придавать ферменту самые неожиданные свойства. Более прямым методом определения мест контакта макромолекул при белок–белковых и белково–нуклеиновых взаимодействиях является метод поперечных сшивок с использованием бифункциональных химических агентов. Такие химические соединения образуют ковалентные связи (поперечные сшивки) между близкорасположенными реакционноспособными группами. Однако сам факт наличия контакта между макромолекулами еще нельзя однозначно интерпретировать в пользу его функциональной значимости.

В отличие от эубактерий, которые, как уже упоминалось выше, при транскрипции различных наборов генов используют разные s-факторы, эукариоты для достижения тех же целей прибегают к другой стратегии – специализации молекул РНК-полимераз. В ядрах эукариот обнаружены по меньшей мере три специализированные формы РНК-полимераз. РНК-полимераза I осуществляет транскрипцию генов рибосомных РНК (рРНК), синтезируя в ядрышках предшественники 18S и 28S рРНК; РНК-полимераза II участвует в образовании мРНК, а РНК-полимераза III транскрибирует гены транспортных (тРНК), 5S и других низкомолекулярных РНК. Каждый из этих ферментов представляет собой многосубъединичный белковый комплекс, состоящий из двух больших (120–220 кДа) и 5–13 малых (10–100 кДа) субъединиц. Несколько малых субъединиц являются общими для разных форм РНК-полимераз. Большие же субъединицы гомологичны своими аминокислотными последовательностями участкам b- и b^’-субъединиц эубактерий, что, возможно, отражает фундаментальное сходство в структуре и функционировании активных центров этих ферментов. Более того, аминокислотные последовательности a-субъединиц бактериальных РНК-полимераз, необходимые для их взаимодействия с большими субъединицами минимального фермента, имеют гомологи в третьей по размеру большой субъединице РНК-полимеразы II, а также в субъединице, общей у РНК-полимераз I и III. Несколько небольших субъединиц эукариотических РНК-полимераз, не имеющих аналогов у бактериальных ферментов, являются общими для всех РНК-полимераз, что может указывать на их одинаковые функции в транскрипции, осуществляемой соответствующими ферментами, и на их возможное участие в координации функционирования разных РНК-полимераз.

РНК-полимераза I эукариот (Pol I).Как и большинство других высокомолекулярных полипептидов, большие субъединицы РНК-полимераз содержат хорошо различимые структурные и функциональные домены: дискретные участки полипептидных цепей, несущие конкретную функциональную нагрузку. Клонирование генов соответствующих субъединиц и определение их первичной структуры позволили выявить эволюционно консервативные участки полипептидных цепей и провести мутационный анализ функциональной значимости их отдельных доменов. Для этой цели в