Диагностика заболеваний

В процессе диагностики и исследования генетических механизмов наследственных заболеваний человека возникают две тесно связанные друг с другом задачи. На первом этапе исследований в ДНК из клинических образцов пытаются обнаружить уже описанные в литературе мутации, ассоциированные с конкретным наследственным заболеванием. На наличие такой мутации в геномной ДНК пациента указывает диагноз наследственного заболевания, поставленный на основании симптомов болезни. В то же время необнаружение известных мутаций в его геномной ДНК не может считаться доказательством отсутствия у него соответствующего заболевания, поскольку оно может вызываться новыми мутациями в том же самом или других генах, функционально связанных с первым. Поэтому в таких случаях на втором этапе исследования этиологии заболевания следует воспользоваться методами, позволяющими обнаруживать неизвестные мутации.

Методы обнаружения новых неизвестных мутаций. Если раньше точковые мутации, а также микроделеции и вставки обнаруживали преимущественно прямым секвенированием клонированных фрагментов ДНК, то в последнее время преобладающими становятся методы анализа продуктов ПЦР. При этом наиболее часто используются четыре ниже приведенных метода.

Прямое секвенирование продуктов ПЦР является очень эффективным и чувствительным методом выявления мутаций. Принято считать, что с помощью прямого секвенирования одноцепочечных и двухцепочечных продуктов ПЦР стандартными методами можно обнаруживать до 99% мутаций при минимальном количестве ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Метод позволяет не только точно локализовать мутацию в исследуемой последовательности нуклеотидов, но и определить ее тип и возможный механизм возникновения с учетом контекста окружающих ее нуклеотидов.

Электрофорез продуктов ПЦР в денатурирующем градиентном геле (denaturing gradient gel electrophoresis – DGGE). Последовательность нуклеотидов в двухцепочечных фрагментах ДНК определяет особенности плавления этих фрагментов в денатурирующих условиях. Отсюда следует, что мутации (в том числе и одиночные замены нуклеотидов) могут изменять температуру плавления (денатурации) локальных участков ДНК, называемых доменами, которые содержат эти мутации. Совокупность доменов плавления определенного участка ДНК образует профиль плавления. Домены ДНК в зависимости от последовательности их нуклеотидов в условиях постоянной температуры будут плавиться при определенных концентрациях денатурирующего агента. В результате положение фрагментов в геле по завершении электрофореза будет зависеть от профилей их плавления и, в конечном счете, от нуклеотидной последовательности доменов плавления. Наличие мутации увеличивает или понижает температуру плавления соответствующего домена. Следовательно, фрагмент ДНК, содержащий мутацию, плавится при более низкой (или более высокой) концентрации денатурирующего агента в геле и двигается медленнее (или быстрее) при электрофорезе по сравнению с аналогичным фрагментом ДНК дикого типа.

Присутствие ошибочно спаренных нуклеотидов (mismatches), как правило, увеличивает разницу в температурах плавления мутантных фрагментов ДНК и фрагментов ДНК дикого типа. С учетом этого факта можно увеличить чувствительность обсуждаемого метода путем сравнения электрофоретических подвижностей фрагментов ДНК дикого типа и гетеродуплексов, образованных фрагментом исследуемой ДНК и соответствующим фрагментом ДНК дикого типа. На практике получение гетеродуплексов продуктов ПЦР не занимает много времени. Для этого достаточно смешать анализируемые продукты в эквимолярных отношениях в определенных ионных условиях, денатурировать их повышением температуры и медленно охладить.

С появлением метода ПЦР получение фрагментов ДНК определенной длины, полностью идентичных анализируемому участку ДНК, стало простой задачей. Для повышения разрешающей способности электрофореза в денатурирующем градиентном геле один из праймеров при проведении ПЦР выбирают таким образом, чтобы его GC-состав был максимально возможным. Это предотвращает преждевременную полную денатурацию и расхождение цепей продуктов ПЦР во время электрофореза, так как противоположные цепи денатурирующих фрагментов ДНК будут более продолжительное время связаны друг с другом GC-богатыми последовательностями праймеров.

Полагают, что метод электрофоретического разделения фрагментов ДНК в гелях с градиентом денатурирующих агентов позволяет обнаруживать до 95% мутаций. Однако несмотря на высокую эффективность, этот метод не дает возможности точно локализовать мутации в анализируемых участках ДНК.

Методы, основанные на обнаружении ошибочно спаренных нуклеотидов. Азотистые основания ДНК содержат реакционноспособные кето- и аминогруппы, которые можно легко модифицировать химическими методами. Основания, находящиеся в составе канонической двойной спирали ДНК, в большей степени защищены водородными связями от действия модифицирующих агентов, чем ошибочно спаренные основания в гетеродуплексах. Поэтому последние можно избирательно модифицировать химически.

В настоящее время используют в основном два подхода к обнаружению мутаций с помощью химических модификаций ошибочно спаренных оснований в гетеродуплексах. В одном из них модификации подвергаются ошибочно спаренные остатки цитозина или тимидина с использованием соответственно гидроксиламина или четырехокиси осмия. После удаления из цепей анализируемых фрагментов ДНК неспаренных пиримидинов и расщепления депиримидинизированных остатков рибозы по фосфодиэфирным связям пиперидином образовавшиеся фрагменты ДНК исследуют с помощью электрофореза, что позволяет локализовать места расщепления цепей ДНК и соответственно положение мутантных нуклеотидов. Комбинированное использование этих методов дает возможность находить все теоретически возможные сочетания мутантных нуклеотидов.

При втором подходе используют водорастворимый карбодиимид для модификации ошибочно спаренных остатков G и Т. ДНК-полимераза прекращает элонгацию строящейся цепи ДНК вблизи модифицированного основания. В результате образуется укороченный гомогенный продукт реакции в виде вновь синтезированного фрагмента ДНК. Поэтому модифицированное основание (а следовательно, и мутация) может быть обнаружено посредством удлинения праймера Taq-полимеразой в присутствии радиоактивно меченных дезоксирибонуклеозидтрифосфатов с последующим электрофоретическим определением размеров меченого продукта реакции. Принято считать, что эффективность выявления мутаций с использованием химических модификаций ошибочно спаренных нуклеотидов приближается к 95%.

Обнаружение мутаций путем оценки конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК (single-stranded conformation polymorphism – SSCP). Отдельные цепи денатурированных фрагментов ДНК обладают способностью образовывать вторичную структуру, особенности которой зависят от последовательности нуклеотидов в этих фрагментах. Конформация одноцепочечных фрагментов ДНК, образовавшаяся во время их рефолдинга (сворачивания после тепловой денатурации исходного двухцепочечного фрагмента и быстрого охлаждения, во время которого большинство фрагментов остается в одноцепочечной форме), оказывает влияние на электрофоретическую подвижность фрагментов. Наличие в анализируемом фрагменте ДНК, в том числе и в продукте ПЦР, одной или нескольких мутаций приводит к формированию специфической вторичной структуры у цепей анализируемого фрагмента ДНК, образовавшихся в процессе его денатурации с последующим рефолдингом, и эта структура будет отличаться от структуры фрагментов ДНК дикого типа, что легко обнаруживается по изменению электрофоретической подвижности фрагментов. Метод оценки конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК прост в постановке и позволяет выявлять до 80% мутаций. Этот метод, однако, не дает возможности точно локализовать мутации.

Еще один недавно разработанный метод поиска мутаций был назван анализом гетеродуплексов. Установлено, что наличие в двухцепочечном фрагменте ДНК неспаренных оснований (даже одной пары) изменяет конформацию такого гетеродуплекса, и это проявляется в изменении электрофоретической подвижности фрагмента при проведении гель-электрофореза в определенных условиях. Несмотря на свою простоту, метод также позволяет находить до 80% мутаций.

Все методы, описанные в этом разделе, приобрели особую значимость с развитием метода ПЦР, который достаточно просто позволяет амплифицировать конкретные участки геномной ДНК, получать препаративные количества гомогенной по размерам двухцепочечной ДНК и быстро создавать гетеродуплексы. Несмотря на такое широкое распространение ПЦР, в заключение раздела о методах обнаружения неизвестных мутаций целесообразно упомянуть старый, но эффективный метод выявления мутаций, приводящих к полиморфизму длин рестрикционных фрагментов ДНК (ПДРФ) (restriction fragments length polymorphism – RFLP), непосредственно в геномной ДНК. Наличие сайтов рестрикции в геномной ДНК и их взаимное расположение однозначно определяются последовательностью нуклеотидов исследуемой ДНК, поскольку сам сайт рестрикции – не что иное, как строго определенная последовательность нуклеотидов ДНК, узнаваемая и расщепляемая рестриктазами. Следовательно, любая мутация, изменяющая последовательность нуклеотидов сайта рестрикции, уничтожает этот сайт.

Полное расщепление анализируемой геномной ДНК отдельными рестриктазами приводит к образованию определенного набора фрагментов ДНК, число и размеры которых соответствуют расположению сайтов рестрикции. Гибридизация по Саузерну позволяет определять размеры и взаимное расположение рестрикционных фрагментов ДНК после их электрофоретического разделения (подробности см. в разделе 7.5). При наличии мутации в одном из сайтов рестрикции этот сайт остается нерасщепленным после завершения рестрикции, что приводит к слиянию соседних рестрикционных фрагментов ДНК, разделяемых мутантным сайтом, и образованию фрагмента ДНК большего размера. В результате длина рестрикционных фрагментов ДНК, содержащих мутантные сайты, может меняться (становится полиморфной), что четко выявляется при сравнении ДНК из разных источников методом ПДРФ.

Метод ПДРФ широко используется в генетических исследованиях популяций, поскольку наличие в геноме исследуемого организма рестрикционного фрагмента ДНК определенной длины является прекрасным генетическим маркером и одновременно фенотипическим признаком, тесно связанным с генотипом организма. Это позволяет легко следить за распространением такого маркера в популяциях, за передачей его от родителей к потомству при скрещиваниях и использовать для построения генетических карт исследуемых организмов классические генетические методы. ПДРФ-маркеры благодаря их четкой принадлежности определенным генетическим локусам не уступают по информативности распространенным биохимическим маркерам и во многих случаях оказываются удобнее сложных фенотипических признаков (таких, как цвет глаз, окраска волос или шерсти, форма цветков и листьев), определяемых многими генными локусами.

Методы обнаружения известных мутаций. Все рассмотренные выше методы поиска новых мутаций с успехом используются и для идентификации известных мутаций в исследуемой ДНК. Тем не менее, для выявления уже описанных в литературе мутаций, приводящих к отдельным патологическим состояниям организма (например серповидно-клеточной анемии или нарушениям в системе свертывания крови), бывает удобнее использовать некоторые специфические методы, четыре из которых будут рассмотрены ниже.