Регуляция инициации трансляции

Инициация, т.е. сборка компонентов системы трансляции на 5'-конце мРНК, завершающаяся образованием первой пептидной связи, является важнейшей точкой приложения регуляторных воздействий на уровне трансляции. Эффективность инициации биосинтеза белка изменяется под действием различных гормонов, факторов роста и цитокинов, при изменении доступности питательных веществ и в условиях стрессовых состояний эукариотических клеток. Ключевую роль в этом играют факторы инициации трансляции eIF4E и eIF2.

Участие фактора инициации трансляции eIF4E в регуляции биосинтеза белка. Фактор eIF4E распознает кэп-структуры мРНК в составе многокомпонентного фактора инициации eIF4F, что является необходимым этапом объединения мРНК с 40S субчастицей рибосом (подробнее см. раздел 2.5.2). Фактор eIF4E лимитирует инициацию трансляции. В большинстве клеток он присутствует в количестве 0,01–0,2 молекулы/рибосому, тогда как внутриклеточное содержание других факторов находится в пределах 0,5–3 молекулы/рибосому. Внутриклеточное содержание и активность фактора eIF4E регулируются на уровне транскрипции, посттрансляционно и путем взаимодействия с белками-репрессорами.

Регуляция биосинтеза eIF4E на уровне транскрипции. В ответ на действие сыворотки или факторов роста происходит многократное возрастание внутриклеточного содержания eIF4E-мРНК. Промотор гена этого фактора содержит два сайта связывания фактора транскрипции Myc, которые функционируют в искусственных гибридных генах. В соответствии с этим повышенный уровень экспрессии гена c-myc сопровождается возрастанием внутриклеточного содержания eIF4E-мРНК. Известно, что белок Myc участвует в регуляции пролиферации клеток. Поскольку фактор eIF4E сам по себе является ключевым регулятором роста и деления клеток, полагают, что его ген может быть одной из основных мишеней регуляторного воздействия белка Myc.

Регулируемое фосфорилирование фактора eIF4E. Фософорилированное состояние полипептидной цепи фактора eIF4E коррелирует с повышенной скоростью трансляции. В митозе, характеризуемом низкой скоростью трансляции, уровень фосфорилирования eIF4E минимален. Количество фосфорилированных молекул фактора возрастает в ответ на внеклеточные воздействия гормонами, факторами роста, митогенами и цитокинами, а также в условиях повышенной нагрузки на сердце. У млекопитающих в ответ на все исследованные стимулы фосфорилирование полипептидной цепи происходит в основном в положении S209 (нумерация по полипептиду мышей). Остаток Thr в положении 210 фосфорилируется значительно реже. Поскольку в клетках, трансформированных онкогенами ras и src, наблюдается усиление фосфорилирования eIF4E, полагают, что в этом процессе участвуют MAP(ERK)-киназы (MAPK/ERK). Это участие может быть косвенным, так как в системах in vitro киназы ERK не обладают способностью фосфорилировать eIF4E. Недавно было показано, что общим субстратом протеинкиназ p38MAPK и ERK является протеинкиназа фактора eIF4E, названная MNK1 (MAP kinase interacting kinase 1), которая в активном состоянии фосфорилирована. Поскольку MNK1 эффективно и специфически фосфорилирует фактор eIF4E in vitro по остатку Ser в положении 209, ее рассматривают в качестве основного кандидата, модифицирующего этот фактор и в живой клетке, после активации каскадов реакций с участием киназ ERK и p38 MAPK.

Семейство белков-репрессоров фактора eIF4E. Недавно были обнаружены небольшие белки (молекулярная масса ~12 кДа), названные 4E-BP1, 4E-BP2 и 4E-BP3 (eIF4E-binding proteins 1, 2 and 3), ингибирующие кэп-зависимую трансляцию после прямого взаимодействия с eIF4E. Образование комплекса eIF4E–4E-BP не изменяет сродство фактора к кэп-структуре, однако предотвращает его взаимодействие с eIF4G. Белки-ингибиторы 1, 2 и фактор eIF4G обладают гомологичной последовательностью аминокислот YXXXXLΦ, где X – любая аминокислота, а Φ – алифатический аминокислотный остаток. Эта последовательность необходима для обсуждаемого белок-белкового взаимодействия.

Сродство ингибиторов семейства 4E-BP к фактору eIF4E регулируется через их фосфорилирование. Ингибитор 4E-BP1 был вначале идентифицирован как основной полипептид, фосфорилируемый под действием инсулина. Фосфорилирование полипептидных цепей ингибиторов предотвращает образование белок-белковых комплексов и происходит в присутствии гормонов (инсулин, ангиотензин, гастрин), факторов роста (EGF, PDGF, NGF,IGFI, IGFII), цитокинов (IL-3, GMCSF), митогенов (TPA) и во время аденовирусной инфекции. В то же время в клетках некоторых типов тепловой шок и полиовирусная инфекция сопровождаются снижением уровней фосфорилирования ингибиторов. Все это указывает на прямое участие ингибиторов 4E-BP в регуляции трансляции у эукариот через взаимодействие с фактором eIF4E. По крайней мере, ингибиторы 4E-BP1 и 4E-BP2 являются субстратами протеинкиназы FRAP/mTOR – очень большого белка, принадлежащего к семейству киназ PIK, родственных киназам фосфатидилинозитола. Каскад реакций, завершающихся фосфорилированием этой киназы и, в конечном счете, белковых ингибиторов трансляции, запускается в ответ на вышеупомянутые внеклеточные стимулы киназой PIK3, фосфорилирующей OH-группу фосфоинозитида в положении 3.

Фактор eIF4E в регуляции роста и пролиферации клеток. Как следует из вышеизложенного, фактор eIF4E и его белковые ингибиторы являются специфическими мишенями протеинкиназ, активируемых в ответ на внеклеточные регуляторные воздействия. Это указывает на важную роль фактора в регуляции клеточного цикла. Действительно, микроинъекция eIF4E в покоящиеся фибробласты индуцирует в них синтез ДНК, а антисмысловые РНК к мРНК фактора резко увеличивают время прохождения клеток через G₁/S фазы клеточного цикла.

Сверхэкспрессия гена eIF4E приводит к характерным морфологическим изменениям в клетках HeLa и трансформирует иммортализованные клеточные линии грызунов. При этом происходит подавление апоптоза, индуцируемого в клетках истощением сыворотки. Кроме того, повышение внутриклеточного уровня фактора имеет место в опухолях различного происхождения. Все это делает фактор eIF4E объектом пристального внимания онкологов.

Фактор eIF2 как объект регуляторных воздействий. Как уже упоминалось выше, eIF2 представляет собой гетеротримерный белковый комплекс. Его α-субъединица фосфорилируется тремя известными киназами эукариот: у животных – HRI и PKR, а у дрожжей – GCN2. Фосфорилирование фактора предотвращает обмен GDP на GTP, опосредованный фактором eIF2B, и ингибирует трансляцию. Поскольку фосфорилированная форма eIF2 обладает повышенным сродством к eIF2B, последний становится эффективным конкурентным ингибитором формирования активного комплекса eIF2–GTP–Met-тРНК_i.

В качестве примера изменения эффективности трансляции мРНК через фосфорилирование фактора инициации eIF2 рассмотрим механизм контроля биосинтеза гемоглобина под действием гема. Этот пример интересен также и тем, что объясняет необходимость добавления гема в бесклеточные системы трансляции, получаемые на основе белков ретикулоцитов. Более подробно бесклеточные системы трансляции описаны в разделе 7.5.

Трансляция глобиновой мРНК в бесклеточной системе биосинтеза белка из ретикулоцитов кроликов в отсутствие гемина (окисленной формы гема) сопровождается быстрым прекращением включения аминокислот в растущие полипептидные цепи, т.е. остановкой трансляции. Оказалось, что в отсутствие гемина специфическая протеинкиназа фосфорилирует фактор инициации трансляции eIF2, который в фосфорилированном состоянии прочно взаимодействует с другим фактором инициации eIF2B и в составе комплекса остается в связанном с рибосомами состоянии. В результате трансляция глобиновой мРНК останавливается. Гемин, находящийся в избытке в системе трансляции, взаимодействует с протеинкиназой и инактивирует ее. Протеинкиназа утрачивает способность фосфорилировать фактор eIF2 и, как следствие, блокировать трансляцию.

Координация синтеза глобинов на уровне трансляции происходит и в других случаях. Известно, что в диплоидной клетке человека имеются четыре активных a-глобиновых и лишь два экспрессирующихся b-глобиновых гена. Поскольку правильная сборка молекул гемоглобина предполагает участие эквимолярных количеств полипептидных цепей a- и b-глобина, необходима координация биосинтеза этих белков, которая осуществляется на уровне инициации трансляции. Оказывается, a-глобиновая мРНК конкурирует с b-глобиновой мРНК за факторы инициации трансляции, однако b-глобиновая мРНК обладает большим сродством к факторам, что приводит к более высокой эффективности ее трансляции по сравнению с a-глобиновой мРНК. Предполагается, что в качестве фактора инициации трансляции, ответственного за предпочтительную трансляцию b-глобиновой мРНК, выступает кэп-связывающий белок.

Вышеописанные примеры показывают, как изменяется эффективность инициации трансляции определенных мРНК рибосомами при непосредственном воздействии на факторы инициации. Имеются и другие механизмы регуляции эффективности трансляции и, в конечном счете, регуляции экспрессии генов, реализующие свое действие через изменение эффективности инициации трансляции мРНК. Среди факторов, влияющих на эти механизмы, следует упомянуть, во-первых, разную эффективность ("силу") 5’-концевых областей инициации трансляции TIR (в частности последовательности Шайна–Дальгарно), необходимых для связывания рибосом в процессе образования инициаторного комплекса. Такие последовательности обеспечивают требуемую скорость трансляции соответствующих мРНК (подробнее см. раздел 7.2.6). Во-вторых, регуляция скорости инициации трансляции возможна за счет влияния пространственной структуры 5’-концевого инициаторного района мРНК. Сворачивание этой части мРНК в стабильную пространственную структуру блокирует трансляцию. В-третьих, эффективная регуляция инициации трансляции определенных мРНК достигается за счет специфического взаимодействия инициаторных участков мРНК с белками-регуляторами, которые в данном случае выступают репрессорами инициации трансляции.

Белки, взаимодействующие с мРНК, как регуляторы трансляции. Большинство регуляторных белков, взаимодействующих с 5’-концевыми TIR-последовательностями мРНК прокариот, являются негативными регуляторами трансляции. Классический пример такой регуляции экспрессии генов дают рибосомные белки E. coli – репрессоры собственного синтеза, которые предотвращают взаимодействие 30S субчастиц рибосом со своими мРНК. Оригинальный механизм репрессии использует рибосомный белок S15, который, взаимодействуя с TIR-последовательностью своей мРНК, стабилизирует предсуществующий псевдоузел. В результате SD-область мРНК становится ловушкой для 30S субчастицы рибосом, которая взаимодействует с ней, но не может инициировать синтез белка.

Аналогичные механизмы функционируют и у эукариот. В этом отношении хорошо изучена регуляция трансляции мРНК ферритина, синтазы δ-аминолевулиновой кислоты и субъединицы b сукцинатдегидрогеназы позвоночных животных. 5’UTR мРНК этих белков содержат регуляторный элемент IRE (iron-responsive element), с которым взаимодействует белок IRP (iron-regulatory protein), акцептирующий ионы железа. В отсутствие железа IRP связывается с IRE и блокирует трансляцию мРНК. Сродство IRP к IRE понижается в 50–100 раз, если он находится в комплексе с ионами железа. Этого оказывается достаточно для вовлечения соответствующих мРНК в трансляцию.

Цитоплазматические мРНК, не участвующие в синтезе белка в составе полисом, образуют нетранслируемые мРНП-комплексы. Кроме уже рассмотренных выше регуляторных белков, распознающих определенные последовательности мРНК конкретных видов, два белка обнаруживаются во всех мРНП в большом количестве: поли(А)-связывающий белок PABP (p70) и белок р50 с молекулярной массой ~50 кДа. Роль белка PABP в стабилизации мРНК и инициации трансляции уже обсуждалась. Теперь же целесообразно рассмотреть регуляторные функции белка p50.

Белок p50, ассоциированный с цитоплазматическими мРНП-частицами. В отличие от белка PABP, преимущественно ассоциированного с функционирующими полисомами, белок p50 является основным компонентом как неактивных мРНП, так и участвующих в синтезе белка. Белок p50 ретикулоцитов кроликов обнаруживает до 98% гомологии с факторами транскрипции животных, взаимодействующими с так называемым Y-боксом, цис-действующей регуляторной последовательностью ДНК CTATTGGC/TC/TAA. Факторы этого семейства преимущественно связывают одноцепочечную и апуринизированную ДНК, трехцепочечную H-ДНК и РНК.

Отмечена двойственная роль белка p50 в регуляции трансляции: он может выступать как ингибитор и как активатор биосинтеза белка. При высоком отношении p50/мРНК (5–10 молекул белка на молекулу мРНК) имеет место ингибирование трансляции, при низком (до четырех молекул p50 на молекулу мРНК) – активация. Ингибирующая функция белка обнаружена при депонировании мРНК в ооцитах, а также в условиях сверхэкспрессии p50 в соматических клетках. Возможно, при высоких концентрациях белка происходит освобождение его С-концевых частей от контактов с РНК, приводящее к мультимеризации белка и переходу мРНП в конденсированное состояние.

Альтернативно, белок p50 выступает в качестве фактора трансляции в полисомах, активно синтезирующих белок. Полагают, что в этом случае он может облегчать инициацию трансляции, предотвращая неспецифическое взаимодействие мРНК с факторами трансляции, а также обеспечивая формирование у мРНК оптимальной пространственной структуры. Поскольку у p50 обнаружена РНК-расплетающая активность, он может способствовать сканированию 5’UTR мРНК прединициационным комплексом.

Антисмысловые РНК как регуляторы трансляции. Прокариотические антисмысловые РНК длиной 70–110 нт образуют структуры типа "стебель–петля", в которых стебель защищает эти РНК от деградации, а петля длиной шесть–восемь нт служит для первоначального взаимодействия с мРНК-мишенью. После образования комплексов РНК–РНК наблюдали изменение стабильности мРНК, эффективности процессинга РНК-мишени, терминации транскрипции или инициации их трансляции. Из этого видно, что антисмысловые РНК являются мощными природными модуляторами экспрессии генов у прокариот. Данные о возможном участии природных антисмысловых РНК в регуляции трансляции у эукариот противоречивы.

Короткие ОРС в 5’-концевых лидерных последовательностях РНК как регуляторы трансляции.Около 10% мРНК растений содержат в своих 5’-концевых лидерных последовательностях более одного AUG-кодона. Некоторые из них удаляются с помощью альтернативного сплайсинга. Другие возникают в результате использования РНК-полимеразами альтернативных промоторов при инициации транскрипции соответствующих генов. Присутствие коротких ОРС в лидерных последовательностях мРНК, как правило, сопровождается снижением эффективности трансляции таких матриц. Функционирование этого механизма обнаружено в клетках млекопитающих, растений и дрожжей. Влияние коротких ОРС на трансляцию расположенных ниже последовательностей нуклеотидов мРНК недавно было детально исследовано с использованием искусственных генно-инженерных конструкций, в которых изменяли длину и число потенциальных сайтов инициации трансляции, предшествовавших генам-репортерам. Оказалось, что ингибирующее действие коротких ОРС возрастает с увеличением их длины. Даже одиночный AUG-кодон, снижает уровень трансляции ниже расположенных последовательностей, по крайней мере, в два раза. Короткие ОРС промежуточной длины (~30 кодонов) обладали пятикратным ингибирующим действием, а протяженные ОРС (>100 кодонов) полностью подавляли трансляцию следующих за ними последовательностей. Механизм ингибирующего действия коротких ОРС связан с тем, что они транслируются. Это снижает вероятность инициации трансляции на инициирующих кодонах, расположенных вслед за ними, поскольку процесс реинициации трансляции требует вхождения новых факторов инициации трансляции в инициаторный комплекс, включающий рибосому.

Трансактивация трансляции полицистронных РНК у вирусов.Предшественники геномной РНК вируса мозаики цветной капусты, а также их производные, подвергнутые альтернативному сплайсингу, являются полицистронными мРНК для многих вирусных белков. ОРС сближены друг с другом, и их не разделяют протяженные межцистронные последовательности. Такие РНК содержат внутренние AUG-кодоны, которые неэффективно используются для инициации трансляции в протопластах или трансгенных растениях, однако начинают функционировать в присутствии вирусных генов-трансактиваторов (TAV) (рис. I.40,д). В частности, трансактиваторная функция