Регуляция репликации плазмиды ColE1

Многие клетки прокариот в дополнение к основной хромосоме содержат небольшие внехромосомные ДНК, называемые плазмидами. Плазмиды, размеры которых варьируют от нескольких тысяч до сотен тысяч пар оснований, а число копий на клетку – от одной до нескольких сотен, способны к автономной (независимой от основной хромосомы) репликации и стабильно наследуются в ряду клеточных поколений. Хотя многие плазмиды дают клеткам-хозяевам ощутимые селективные преимущества (устойчивость к антибиотикам, тяжелым металлам и т.п.), большинство из них являются криптическими, т.е. не проявляющимися в видимом фенотипе клеток. Поскольку их существование – это весомая нагрузка на метаболизм клеток-хозяев, остается непонятным смысл их эволюционной стабильности. Несмотря на то что в природных условиях бактериальные клетки, по-видимому, не испытывают давления отбора, направленного на сохранение плазмид внутри клеток, последние с помощью тонких механизмов, регулирующих число их копий в клетках, стабильно сегрегируют между дочерними бактериальными клетками.

Область начала репликации небольшой плазмиды ColE1, несущей гены устойчивости к колицинам, традиционно используется в генной инженерии при конструировании векторных молекул ДНК, которые находят применение для клонирования и экспрессии в клетках E. coli коротких последовательностей нуклеотидов. Именно поэтому целесообразно рассмотреть механизмы контроля репликации плазмиды ColE1.

Инициация репликации плазмиды ColE1. Репликация плазмиды ColE1 происходит в одном направлении (однонаправленная репликация) с использованием репликативного аппарата клетки-хозяина. Сама по себе плазмида не кодирует ни одного фермента, который требовался бы для ее репликации. Область начала репликации содержит два промотора, один из них обеспечивает синтез РНК-праймера (РНК II), необходимого для инициации репликации плазмиды. Синтезированная РНК II, длина которой зависит от типа реплицируемой плазмиды, далее подвергается процессингу с помощью РНКазы H с образованием РНК длиной в 550 нуклеотидов. Эта молекула эффективно используется ДНК-полимеразой I в качестве праймера при синтезе ведущей цепи ДНК. В отсутствие РНКазы H затравкой во время репликации служит 3’-конец РНК II, хотя и с меньшей эффективностью. В клетках, дефектных по РНКазе H и ДНК-полимеразе , инициация репликации ColE1 осуществляется ДНК-полимеразой III с участием РНК II по механизму, подробно рассмотренному выше.

Все три механизма инициации репликации плазмиды основаны на уникальном свойстве РНК II образовывать стабильный ДНК–РНК-гибрид в области начала репликации. Действительно, обычные транскрипты освобождаются из транскрипционного комплекса после завершения транскрипции и отделения РНК-полимеразы от матрицы, чего не происходит с РНК II. Анализ мутантов плазмиды, дефектных по репликации, а также их ревертантов показал, что в стабильном гибриде РНК II с матрицей происходит взаимодействие между G-богатой петлей РНК II, образованной 265 нуклеотидами выше точки инициации репликации (положение –265), и С-богатым участком ДНК, расположенным в окрестностях нуклеотида –20 (рис. I.48,а). Обе эти последовательности оказались консервативными у родственных плазмид pMB1, p15A и KSF1030. Взаимодействия между указанными последовательностями, по-видимому, происходят в тот момент, когда РНК-полимераза еще находится в транскрипционном комплексе и цепи ДНК в окрестностях комплекса расплетены. Равновесие между двумя альтернативными конформациями РНК II является критическим в определении доли молекул РНК, остающейся в ДНК–РНК-гибриде, необходимом для инициации репликации плазмиды. Выбор между двумя альтернативными конформациями РНК II определяется первичной структурой участка, расположенного между нуклеотидами –359 и –380 (последовательность b) (см. рис. I.48,б). Эта последовательность может взаимодействовать с выше расположенной комплементарной последовательностью a (структура ab) или с гомологичной последовательностью g, расположенной ниже (структура bg). После того как РНК-полимераза транскрибирует первые 200 нуклеотидов, образовавшаяся РНК II формирует временную вторичную структуру, для которой характерно наличие трех доменов типа "стебель–петля" (I, II и III). Удлинение РНК II еще на несколько нуклеотидов приводит к разрушению стебля III и образованию стебля IV, который стабилизируется в результате комплементарных взаимодействий между последовательностями a и b. В течение последующей элонгации РНК II у нее возникают две альтернативные возможности формировать свою вторичную структуру. Выбор в пользу той или иной конформации зависит от того, останется ли последовательность b связанной с последовательностью a или же образует новые контакты с g-последовательностью. Переход от комплементарных пар ab к bg сопровождается сильными изменениями конформации РНК II, которые в конечном счете определяют ее способность служить праймером при репликации плазмиды. Молекулы РНК II в конформации ab могут образовывать РНК–ДНК-гибрид, служащий субстратом для РНКазы H, а в конформации bg такой способностью не обладают. Предложенная модель подтверждается, прежде всего, тем, что мутации, делающие предпочтительным образование конформации bg из-за дестабилизации стебля IV, затрудняют функционирование РНК II в качестве праймера и приводят к понижению числа копий плазмиды ColE1 внутри бактериальных клеток. Такие мутантные плазмиды, дефектные по репликации, активизируются в результате супрессорных мутаций, стабилизирующих стебель IV. Таким образом, инициация репликации плазмиды ColE1 зависит от способности РНК II образовывать РНК–ДНК-гибрид вблизи точки начала репликации (ori). При этом на образование гибрида оказывают влияние вторичная и третичная структуры выше расположенной последовательности нуклеотидов предшественника праймера.