Связь протеолиза с временной регуляцией синтеза РНК.

 

На примере α-вирусов хороша заметна роль протеолиза в регуляции репликации вируса. От степени процессированности полипротеина неструктурных белков зависит какой РНК продукт будет преобладать в инфицированной клетке.

1234 преимущественно синтезируются (-) РНК.

1 23 4 преимущественно синтезируются (+) геномные РНК и какая-то часть (-) РНК

1 234 преимущественно синтезируются (+) геномные РНК и субгеномная РНК.

Разрезание полипротеина осуществляет белок NS2. Отщепление белка NS4 происходит при in trans протеолизе, когда взаимодействуют две молекулы полипротеина.

 

Вырезание белка NS1 происходит in cis и, причем медленно. NS2 и NS3 разделяются быстро в in trans протеолизной реакции.

Процессинг полипротеина смоделирован in vitro. Показано также, что процессинг осуществляется в репликативных комплексах и ассоциирован с мембраной. Из клеток можно выделить пузырьки, содержащие полипротеин на разной стадии процессинга, в которых репликация находится на разных стадиях.

 

Синтез (-) цепи.

 

Видимо, синтез (-) РНК происходит на циркуляризованной (+) РНК. Образование кольца возможно благодаря взаимодействию PABP, связанного с 3’полиА, с eIF4G – фактора инициации трансляции, связанного с кэпом.

В 3’ области имеется также консервативная последовательность длиной 19 нт, ее достаточно для инициации синтеза (-) РНК при наличии полиА-хвоста. Можно удалить полиА-хвост, но он все равно восстановится с помощью клеточной полиА-полимеразы по механизму реитерации полимеризации. Можно удалить консервативный элемент и вирус все равно выживает, тогда на его 3’-конце обнаруживаются AU-богатые последовательности.

Известно также, что в клетках гиперинфицированных вирусом появляются дефектные геномы, имеющие делеции протяженных участков генома. Такие дефектные вирусы могут реплицироваться в присутствии вируса-помощника. Следовательно, они имеют все необходимые для репликации регуляторные элементы. У этих РНК была определена структура. Выяснилось, что 5’-конец этих РНК содержит шпилечную структуру (150-200 нт). Далее находятся две несовершенные шпильки, функция которых не ясна.

 

Синтез субгеномной РНК.

 

Если (-)цепь всегда находится в дуплексе с (+) цепью РНК, то как инициировать синтез субгеномной РНК? Существует гипотеза о том, что синтез происходит с высвобождением цепи, но у этой гипотезы нет экспериментального подтверждения.

Фактом является наличие промотора для синтеза субгеномной РНК, фланкированный структурами. С использованием этого промотора сконструированы векторы для генной терапии.

В конструкте структурные гены, находящиеся под этим промотором, замещаются на ген нужного белка, например CAT. Можно одновременно вводить в клетку субгеномную РНК, кодирующую капсидные белки, при этом лишив вируса цитотоксичности. В такой системе между обоими РНК будет конкуренция за упаковку в капсид.

Одной из проблем использования РНК-векторов α-вирусов является рекомбинация.

 

 

В настоящее время, вирусы объединяют в группу claster C вирусов. Они характеризуются только отличиями в капсидных белках. Отличия обясняются тем, что в природе вирусные геномы рекомбинируют. Поэтому по частичному сиквенсу генома вируса сложно определить таксономическое положение вируса. В эту группу входят EEEV (α вирус), Simbis и WEEV, рекомбинант геномов EEEV и Simbis, от первого получены гены неструктурных белков, а от второго – гены структурных белков.

 

α вирусы растений.

 

Геном представлен одноцепочечной (+)РНК. РНК имеет 5’-конце кэп, на 3’-конце может находиться полиА, гетерополимер или тРНК-подобная структура.

 

Cap PolyA Cap Heteropolymer Cap tRNA-like structur

 

 

В геноме закодированы белки NS1 и NS2, а также аналог NS4.

 

тРНК подобная структура узнается CTP/ATP-тРНК нуклеотидил трансферазой, которая добавляет А к СС:

СС ССА

Матрица, имеющая на 3’-конце А, более эффективно используется в репликации. Синтез (-) цепи начинается с G.

 

тРНК подобная структура РНК узнается определенной аминоацил-тРНК синтетазой. Например, РНК вируса табачной мозаики (TMW) узнает гистидиновая аа-тРНК-синтетаза, РНК вируса мозаики костра – тирозиновая, а РНК вируса желтой мозаики турнепса – валиновая аа-тРНК-синтетаза. Часто первой N-концевой аминокислотой становится соответствующая аминокислота. Зачем это нужно? Может так сложилось эволюционно? Нарушение способности РНК вируса акцептировать аминокислоту приводит к подавлению ее трансляции. тРНК-подобная структура, возможно участвует в переключении между репликацией и трансляцией РНК.

 

Синтез (-) цепи.

На примере вируса мозаики костра. Это трехкомпонентный вирус, т.е. при транскрипции образуется три мРНК. Третья РНК имеет субгеномный промотор.

Синтез (-) цепи инициируется в две стадии. На 3’-конце имеется шпилька, которая связывает РНК-полимеразу. Положение этой шпильки можно изменять, тогда инициация синтеза будет происходит в том месте, где находится шпилька. Синтез РНК начинается на участках СССА и может начаться также на внутренних ССС. Инициация происходит предпочтительно на тех участках, которые находятся вблизи шпильки.