Продуктивная инфекция вируса простого герпеса

 

При переходе из латентной в продуктивную форму, вирус вызывает появление лихорадки около губ и носа.

Ранее считали, что рання стадия репликации вируса проходит по схеме Кернса, поздняя – по схеме разматывающегося рулона.

При центрифугировании в градиенте CsCI в присутствии EtBr можно выделить ковалентно-замкнутые кольцевые формы ДНК.

В вирионе ДНК вируса имеет одноцепочечные разрывы, остатки РНК. Видимо, репарация вирусной ДНК осуществляется клеточными системами.

Свидетельство в пользу циркуляризации: появление новых сайтов для рестриктаз.

 

 

Механизм циркуляризации.

 

На концах выступает только по одному нуклеотиду, поэтому потенциал для циклизации есть. Возможно, участвует система рекомбинации клетки. (RCC1 ts мутанты (?)). Однако механизм в деталях неясен.

Репликация вируса осуществляется в ядре. Интересно! При изучении распределения вирусных репликативных белков в ядре с помощью флуоресцентной метки было установлено, что места репликации вирусной ДНК занимают фиксированное положение в ядре.

 

Инициация репликации.

Инициация внутренняя, без разрыва, посредством РНК затравки.

 

В геноме 3 ori: один ori_L в большом сегменте и 2 ori_S в малом сегменте внутри повторов с и с'.

Структура ori.

III I I III

АТ

ori_L

палиндром 20 нт палиндром

 

 

Этот участок трудно клонировать из-за наличия палиндромных последовательностей.

ori_S

III I II

АТ

палиндром 18 нт

 

Палиндромные последовательности служат участками узнавания для OBP.

Примечание: ori_S был клонирован в плазмиду и его способность к репликации изучалась в присутствии различных комбинаций вирусных и клеточных белков.

 

В репликации участвуют 7 вирусных белков.

 

Номенклатура белков HSV.

а) ICPхх (intracellular protein)

б) по положению в геноме: ULхх, USхх.

Мы будем пользоваться в основном второй номенклатурой.

UL9. OBP. Узнает и связывается с ori в виде димера. Взаимодействию способствуют/мешают клеточные транскрипционные факторы: ori фланкирован сайтами связывания SP1 и SP3 (возможно, в районе ori происходит транскрипция, но она не обязательна для репликации). Обладает АТФ-зависимой 3' – 5' хеликазной активностью. Вообщем, белок по своим активностям напоминает Т-Аg SV40.

Предложена вполне правдоподобная модель действияUL9.

UL9, как и Т-Аg SV40, связывается с ori_S в форме димера и фиксирует ДНК. После поворота колец друг относительно друга участок ori_S подплавляется и в ходе структурной перестройки образует крестобразную структуру - ori_S* (при действии UL9 в кольцевая ДНК суперскручивается и одним из способов снятия сверхспиральности – образование крестообразных структур).

		oriS*
	UL9

III I II III I

АТ

III I

 

Принцип действия: фиксация участков ori ДНК в димере и их физическое изменение, приводящее к локальному плавлению ДНК.

Далее белок работает, как хеликаза и с появляющимися участками одноцепочечной ДНК связывается вирусный белок ICP8 (аналог SSB). Кроме этого, ICP8 взаимодействует с UL9 и стимулирует его хеликазную активность.

Обычно в репликации участвовала клеточная хеликаза с активностью 5'-3' (например, DnaB) в данном случае, к расплетенному участку присоединяется комплекс из трех вирусных белков: UL5 (хеликаза 5'-3'), UL52 (праймаза) и UL8 (вспомогательный белок, стабилизирующий РНК-затравку и активирующий некоторые клеточные белки).

Т.о. с помощью вирусных белков осуществляется расплетание ori, стабилизация расплетенного состояния и синтез затравки.

 

Отступление. В молекулярной биологии существует большая путанница в отношении того, что считать белком с четвертичной структурой, а что белковым комплексом, состоящим из самостоятельных белковых цепей. Выяснение этого вопроса ничего значимого не дает. Интересен тот случай, когда одна полипептидная цепь способна выполнять задачи, распределенные между отдельными белками. И важно понимание того, какие задачи решаются теми или иными белками, а не структура белковых комплексов.

Элонгация репликации.

В комплекс привлекается вирусная ДНК полимераза. Она состоит из двух субъединиц: UL30, обладающая каталитическим центром, 3'-5' экзонуклеазной и РНКазаН активностями, и UL42 – фактор процессивности. Ранее изученные нами факторы процессивности представляли собой олигомеры в виде колец способные к скольжению вдоль матрицы ДНК (β-субъединица РНК полимеразы III E.coli, фактор PCNA ДНК полимеразыδ эукариот). Однако вирусный белокUL42 работает в виде мономера, не имеет форму кольца и не способен к скольжению вдоль матрицы ДНК: он просто фиксирует полимеразу на участке ДНК. Но для синтеза ДНК необходимо смещение фермента относительно матрицы, как быть?

Предложено два объяснения механизма работы UL42.

1. UL42 фиксирует ДНК и полимеразу на ядерных структурах (например, цитоскелете) и способствует протаскиванию матрицы через фермент.

2. Во время работы у UL30 происходит смещение отдельных частей полипептидной цепи, эта подвижность передается на UL42 и вызывает акты диссоциации/ассоциации фактора.

Еще один участник процесса репликации клеточная топоизомераза. Фермент снимает сверхспиральность и тем самым не дает запутаться концам линейной ДНК вируса.

 

Соединение фрагментов Оказаки.

ДНК полимераза вируса удаляет РНК-затравки, клеточная лигаза зашивает разрыв.

Мы отметили, что в начале репликации имеется неопределенность с формой ДНК, но вскоре появляются ветвистые конкатемерные молекулы.

 

В ветвистом конкатемере ориентация большого сегмента постоянна, а малого меняется.

Ветвистость и инверсии легко объясняются, если предположить, что имеют место рекомбинация. Вирус герпеса имеет все основные компоненты системы рекомбинации аналогичные системе рекомбинации фага λ.

3' – GTG

 

Считается, что Uc является Рас1 участком, при ее узнавании разрыв вносится в правый DR1. Pac 2 участок находится в Ub и если узнается он, то разрыв вносится в левый DR1.

Уже было упомянуто выше, что левый конец может состоять из нескольких а-элементов (могут появиться в результате рекомбинации), какой из них будет узнан – не важно, важно, чтобы упаковался полный эквивалент генома.

Разрыв делает терминаза вируса, состоящая из двух субъединиц: UL28 (узнает Рас1) и UL15 (обладает АТФ-азной активностью).

 

Странно, что инверсия сохраняется в эволюции.

 

Белком не обязательным для репликации является тимидинкиназа. Фермент проявляет три активности:

а)тимидинкиназа (ТК)(Т – рТ);

б)тимидинмонофосфаткиназа (ТmP) (dT – ddT);

в)дезоксицитидиндикиназа.

В некоторых клетках он не нужен для репликации, но необходим для репликации вируса в нервных ганглиях (установлено по делеции этого гена).

Основой лекарственных средств, применяемых для лечения герпес-инфекции, является ацикловир. Это соединение фосфорилируется тимидинкиназой вируса. В фосфорилированной форме он является аналогом нуклеотида и блокирует синтез ДНК.

 

Вирус Эпштейн-Барр (EBV)

 

Большое количество людей являются носителями этого вируса. В странах Африки вирус вызывает лимфому Берклита, в европе – инфекционный мононуклеоз. Инфекция носит персистентный характер. Вирус находится в клетках в виде плазмиды. Численность плазмид строго контролируется. "Полная гармония с клеткой в S-фазе".

Способы воспроизведения:

 

а)плазмидная репликация

б)литическая репликация

 

Плазмидная репликация.

Осуществляется по схеме Кернса. Большинство генов репрессировано, экспрессируется небольшая часть (причем в разных клетках эти группы отличаются составом). В репликации плазмиды участвует один вирусный белок – EBNA-1 (Epshtein-Barr Nuclear Antigen).

Инициация репликации происходит на участке, называемом oriP (plasmid ori). Его длина около 1700 п.о, внутри на расстоянии 1000 п.н. друг от друга расположены два участка DS (Diad Symmetry) и FR (Family of Repeats).

 

 

FR 1000 п.н. DS

 

 

DS состоит из четырех элементов, связывающих EBNA-1.

FR состоит из 20 прямых повторов длиной по 30 п.о. Каждый содержит сайт связывания EBNA-1 (есть предположение, что это нужно для титрации белка).

Остальные белки, участвующие в репликации – клеточные. Каждая плазмида делится только один раз за клеточный цикл и дочерние клетки получают по одной копии.

ORC (Origin Recognition Complex). С помощью EBNA-1 узнает и связывается с oriP в районе DS. Остается связанным с плазмидой в течение всего цикла репликации.

CDC6 – loader хеликазы. Сdt1 – регулирует активность CDC6. Оба белка присоединяются к ORC в G1фазе. Далее загружается гексамер хеликазы MCM. В S-фазе к расплетенному участку ДНК присоединяется ДНК полимераза α/праймаза.

Контроль количества плазмиды осуществляется CDC6 и Cdt1. CDC6 гиперфосфорилируется в S-фазе и экспортируется из ядра в цитозоль, где разрушается протеасомой. Cdt1 ингибируется геминином. В отсутствие CDC6 и Cdt1

Контроль над распределением плазмид между дочерними клетками осуществляет EBNA-1, связывающийся с участком FR.

 

Литическая репликация.

Другой ori – Orilyt. Плохо изучена.

В репликации принимает участие множество вирусных белков, однако, отсутствует аналог UL9. Неясно как происходит узнавание участка ori, но известно, что ori фланкирован участками для связывания транскрипционных факторов, поэтому, возможно, для инициации репликации необходима транскрипция района ori.