Репликация Т-четных и Т-нечетных фагов

 

Репликация с участием конкатемерных молекул. Инициация репликации внутренняя.

 

Фаг Т7.

Геном 40 000 п.н. на

R

L

концах прямые повторы 160 п.н.

 

Особенность фага в том, что гены организованы в оперон и транскрипция идет в одном направлении. Левая часть (обозначена как 1) траскрибируется клеточной полимеразой, правая (большая) – вирусной.

 

 

Причина в том, что фаг вводит ДНК в клетку в две стадии. На первой стадии вводится небольшой участок ДНК, который транскрибируется клеточной РНК-полимеразой. С этих траскриптов синтезируются фаговые белки, которые способствуют вхождению в клетку остальной части ДНК.

 

1,1 А и 1,1 В – промоторы генов, здесь же находится ori. Это необычный участок, когда РНК-полимераза открывает промотор, она синтезирует РНК длиной 10 п.н. и сваливается. Структура участка такова, что гетеродуплекс РНК-ДНК стабильнее, чем ДНК-ДНК, поэтому РНК остается и служит затравкой для вирусной ДНК-полимеразы. Но репликация вирусной ДНК двусторонняя, откуда взять вторую затравку?

ДНК полимераза Т7. Продукт гена V. Масса 84 кДа. Помимо полимеразной активности обладает рибонуклеозидредуктазной. Фактором процессивности служит клеточный тиоредоксин (!), фаговый тиоредоксин в репликации не участвует. Если домен, связывающий тиоредоксин вставить в ДНКазу I, то процессивность этого фермента в присутствии тиоредоксина увеличивается. Объяснение (не от лектора!): тиоредоксин индуцирует конформационные изменения в молекуле полимеразы, в результате которых полипептидная цепь крепче обхватывает ДНК и в таком состоянии ей труднее соскочить с ДНК.

Отступление: измерение процессивности полимеразы: в качестве матрицы используют меченую одноцепочечную ДНК затем реакционную смесь разводят немеченной матрицей, продукты разделяют электрофорезом и следят за подвижностью меченой ДНК. Если фермент непроцессивный – подвижность фрагмента большая, если процессивный – низкая из-за наличия длинной второй цепи ДНК.

Хеликаза (5'-3')/праймаза. Продукт гена IV. Способен к олигомеризации, образует гексамеры и стабильный комплекс с полимеразой (разведение реакционной смеси не влияет на процессивность и длину фрагментов Оказаки). Затруднение в том, что праймаза движется в одном направлении, а хеликаза – в другом. Объяснение – модель трубы. Существует также предположение, что при этом одни субъединицы гексамера могут работать как праймаза, другие как хеликаза. "Трубу " наблюдали в микроскоп!

Ген IV имеет два промотора. С одного синтезируется полный продукт, с другого – белок с укороченным N-концом, этот укороченный продукт обладает только хеликазной активностью.

Клеточные праймазы имеют довольно широкую специфичность, вирусная же имеет еще более широкую специфичность (на грани с неспецифичностью).