Специфічною ознакою спадкових хвороб є те, що їх причиною являються зміни ДНК. ДНК-діагностика, як технологія, яка направлена на виявлення причини хвороби, є більш адекватним, об’єктивним та інформативним методом у діагностики спадкової патології.
ДНК залишається практично не змінною протягом життя організму, починаючи з моменту запліднення яйцеклітини, що дозволяє проводити дослідження на любої стадії розвитку організму.
Молекулярно-генетичні методи - велика і різноманітна група методів, які призначені для виявлення ушкоджень у структурі ділянки ДНК (алеля, гена, регіону хромосоми) аж до розшифровки первинної послідовності основаній.
В основі цих методів лежать генно-інженерні маніпуляції з ДНК і РНК. Вихідним етапом усіх молекулярно-генетичних методів є одержання зразків ДНК. Джерелом геномной ДНК можуть бути будь-які клітини з ядром. На практиці частіше використовують лейкоцити, хоріон, амниотичні клітини, культури фібробластів. Можливість проведення молекулярно-генетичного аналізу з невеликою кількістю біологічного матеріалу є методичною перевагою методів даної групи.
У багатьох випадках для успішної діагностики хвороби досить досліджувати невеликий фрагмент генома. Виділення таких фрагментів стало можливим завдяки відкриттю ферментів - рестриктаз, що розрізають молекулу ДНК на фрагменти в строго визначених місцях.
Застосування цих ферментів в експерименті дає можливість одержати відносно короткі фрагменти ДНК, у яких легко можна визначити послідовність нуклеотидів.
Таким чином, за допомогою ДНК-діагностики можливо розв’язати наступні питання:
- підтвердження клінічного діагнозу чи диференційна діагностика у хворого;
- пре симптоматична діагностика – коли клінічні риси хвороби з пізньою маніфестацією відсутні;
- пренатальна діагностика по ДНК матеріалу від плоду (ворсини хоріону, клітини амніотичної рідини, кров плоду);
- преімплантаційна діагностика по ДНК клітин що дробляться у яйцеклітині, яка була запліднена in vitro.
Для клінічних цілей використовують аналіз ДНК людини, РНК, хромосом, білків, ферментів чи метаболітів для виявлення пов’язаннях з спадковою патологією генотипів, мутацій, фенотипів, чи каріотипів у клінічних цілях.
Розрізняють пряму і непряму ДНК-діагностику моногенных спадкових хвороб.
При прямій діагностиці предметом аналізу є мутації гена. У ДНК-діагностиці на теперішній час використовуються різноманітні прямі методи. Найбільше просто виявляються мутації, що змінюють довжину ампліфікованих фрагментів ДНК, що виявляються при электрофоретичному аналізі.
Для виявлення точкових мутацій, невеликих делецій і інверсій у досліджуваних генах використовують методи, за допомогою яких можна проаналізувати унікальну послідовність ДНК. Прикладом може служити метод секвенування - визначення нуклеотидної послідовності ДНК. Будь-які типи мутацій можуть бути виявлені шляхом прямого секвенування мутантної ДНК. Для деяких генів, що мають невеликі розміри, цей метод з успіхом застосовується як основний метод сканування мутацій. Головна перевага прямих методів діагностики - майже 100 % ефективність.
Непряме виявлення мутацій застосовується в тих випадках, коли нуклеотидна послідовність гена ще не відома, але мається представлення про положення гена на генетичній карті. Непряма ДНК-діагностика зводиться до аналізу поліморфних генетичних маркерів у хворих і здорових членів родини.
Маркери повинні бути розташовані у тому хромосомному регіоні, де і ген хвороби. Такими маркерами можуть бути ділянки ДНК, що існують у популяції в декількох алельних варіантах. Відмінності можуть бути по складу нуклеотидів, по числу дінуклеотидніх повторів. На основі варіабельністі маркерних ділянок ДНК можна диференціювати материнське чи батьківське походження конкретного варіанта маркера, якій зчеплен з геном хвороби.
Завдяки аналізу поліморфних генетичних маркерів можна визначити і простежити в поколіннях хромосому, що несе патологічний ген. Технічні прийоми до непрямій діагностиці ті ж, що й у прямій діагностиці (одержання ДНК, єлектрофорез і інші). Головний недолік непрямих методів діагностики - обов'язкове попереднє вивчення генотипу як мінімум одного ураженого родича.
На теперішній час активно розробляються діагностичні методики та окремі компоненти тест-систем для ДНК- аналізу мутантних генів, що спричинюють розвиток найбільш поширених в Україні моногенних спадкових захворювань (муковісцидоз, фенілкетонурія, спінальна м'язова атрофія, м'язова дистрофія Дюшена, синдром ламкої Х-хромосоми, гемофілія А, хорея Гентінгтона, спадковий гемохроматоз, мотосенсорна нейропатія Шарко-Марі-Тута, макулодістрофія Штаргардта), спадкову схильність до масових патологій (онкологічних, сердцево-судинних, ендокринних) та генетично обумовлені форми чоловічого (азооспермія, олігоспермія) і жіночого (передчасне виснаження яєчників) безпліддя.
Молекулярна діагностика можлива для наступних хвороб:
· Атаксія Фрідрейха
· Адреногенітальний синдром
· Хвороба Вердніга-Гофмана
· ß-таласемія
· Хвороба Леш-Ніхана
· Хвороба Віллебранда
· Хвороба Хантера
· Гемофілія А
· Гемофілія В
· Дефіцит СоА дегідрогенази
· Дефіцит α-1 антитрипсину
· Муковісцидоз
· Міодистрофія Дюшена-Беккера
· Міотонічна дистрофія
· Гепато-лентикулярна дегенерація
· Синдром ламкої Х-хромосоми
· Спінально-бульбарна м’язева атрофія
· Сімейна гіперхолестеринемія
· Схильність до інсулінозалежного діабету
· Фенілкетонурія
· Хорея Гентінгтона
· Прогресуюча м’язова дистрофія Ландузі-Дежерина
· Мукополісахаридози
· Гангліозидози
· Лейкодистрофії
Тест-системи можуть бути використані для генетичного тестування, яке проводиться під час пренатальної діагностики, пресимптоматичної діагностики, для уточнення діагнозу та селективного і масового скринінгу гетерозиготних носіїв в групах високого ризику та в загальній популяції. Результати генетичного тестування є необхідною передумовою профілактики та прецизійного лікування, з метою покращення стану генофонду України та поліпшення демографічної ситуації
Граф логічної структури теми
„Цитогенетичні, біохімічні та молекулярно-генетичні методи діагностики спадкової патології”
ЗМІСТОВИЙ МОДУЛЬ 3.