Молекулярно–генетичні методи діагностики.

Специфічною ознакою спадкових хвороб є те, що їх причиною являються зміни ДНК. ДНК-діагностика, як технологія, яка направлена на виявлення причини хвороби, є більш адекватним, об’єктивним та інформативним методом у діагностики спадкової патології.

ДНК залишається практично не змінною протягом життя організму, починаючи з моменту запліднення яйцеклітини, що дозволяє проводити дослідження на любої стадії розвитку організму.

Молекулярно-генетичні методи - велика і різноманітна група методів, які призначені для виявлення ушкоджень у структурі ділянки ДНК (алеля, гена, регіону хромосоми) аж до розшифровки первинної послідовності основаній.

В основі цих методів лежать генно-інженерні маніпуляції з ДНК і РНК. Вихідним етапом усіх молекулярно-генетичних методів є одержання зразків ДНК. Джерелом геномной ДНК можуть бути будь-які клітини з ядром. На практиці частіше використовують лейкоцити, хоріон, амниотичні клітини, культури фібробластів. Можливість проведення молекулярно-генетичного аналізу з невеликою кількістю біологічного матеріалу є методичною перевагою методів даної групи.

У багатьох випадках для успішної діагностики хвороби досить досліджувати невеликий фрагмент генома. Виділення таких фрагментів стало можливим завдяки відкриттю ферментів - рестриктаз, що розрізають молекулу ДНК на фрагменти в строго визначених місцях.

Застосування цих ферментів в експерименті дає можливість одержати відносно короткі фрагменти ДНК, у яких легко можна визначити послідовність нуклеотидів.

 

Таким чином, за допомогою ДНК-діагностики можливо розв’язати наступні питання:

- підтвердження клінічного діагнозу чи диференційна діагностика у хворого;

- пре симптоматична діагностика – коли клінічні риси хвороби з пізньою маніфестацією відсутні;

- пренатальна діагностика по ДНК матеріалу від плоду (ворсини хоріону, клітини амніотичної рідини, кров плоду);

- преімплантаційна діагностика по ДНК клітин що дробляться у яйцеклітині, яка була запліднена in vitro.

Для клінічних цілей використовують аналіз ДНК людини, РНК, хромосом, білків, ферментів чи метаболітів для виявлення пов’язаннях з спадковою патологією генотипів, мутацій, фенотипів, чи каріотипів у клінічних цілях.

 

Розрізняють пряму і непряму ДНК-діагностику моногенных спадкових хвороб.

 

При прямій діагностиці предметом аналізу є мутації гена. У ДНК-діагностиці на теперішній час використовуються різноманітні прямі методи. Найбільше просто виявляються мутації, що змінюють довжину ампліфікованих фрагментів ДНК, що виявляються при электрофоретичному аналізі.

Для виявлення точкових мутацій, невеликих делецій і інверсій у досліджуваних генах використовують методи, за допомогою яких можна проаналізувати унікальну послідовність ДНК. Прикладом може служити метод секвенування - визначення нуклеотидної послідовності ДНК. Будь-які типи мутацій можуть бути виявлені шляхом прямого секвенування мутантної ДНК. Для деяких генів, що мають невеликі розміри, цей метод з успіхом застосовується як основний метод сканування мутацій. Головна перевага прямих методів діагностики - майже 100 % ефективність.

 

Непряме виявлення мутацій застосовується в тих випадках, коли нуклеотидна послідовність гена ще не відома, але мається представлення про положення гена на генетичній карті. Непряма ДНК-діагностика зводиться до аналізу поліморфних генетичних маркерів у хворих і здорових членів родини.

Маркери повинні бути розташовані у тому хромосомному регіоні, де і ген хвороби. Такими маркерами можуть бути ділянки ДНК, що існують у популяції в декількох алельних варіантах. Відмінності можуть бути по складу нуклеотидів, по числу дінуклеотидніх повторів. На основі варіабельністі маркерних ділянок ДНК можна диференціювати материнське чи батьківське походження конкретного варіанта маркера, якій зчеплен з геном хвороби.

Завдяки аналізу поліморфних генетичних маркерів можна визначити і простежити в поколіннях хромосому, що несе патологічний ген. Технічні прийоми до непрямій діагностиці ті ж, що й у прямій діагностиці (одержання ДНК, єлектрофорез і інші). Головний недолік непрямих методів діагностики - обов'язкове попереднє вивчення генотипу як мінімум одного ураженого родича.

 

На теперішній час активно розробляються діагностичні методики та окремі компоненти тест-систем для ДНК- аналізу мутантних генів, що спричинюють розвиток найбільш поширених в Україні моногенних спадкових захворювань (муковісцидоз, фенілкетонурія, спінальна м'язова атрофія, м'язова дистрофія Дюшена, синдром ламкої Х-хромосоми, гемофілія А, хорея Гентінгтона, спадковий гемохроматоз, мотосенсорна нейропатія Шарко-Марі-Тута, макулодістрофія Штаргардта), спадкову схильність до масових патологій (онкологічних, сердцево-судинних, ендокринних) та генетично обумовлені форми чоловічого (азооспермія, олігоспермія) і жіночого (передчасне виснаження яєчників) безпліддя.

Молекулярна діагностика можлива для наступних хвороб:

· Атаксія Фрідрейха

· Адреногенітальний синдром

· Хвороба Вердніга-Гофмана

· ß-таласемія

· Хвороба Леш-Ніхана

· Хвороба Віллебранда

· Хвороба Хантера

· Гемофілія А

· Гемофілія В

· Дефіцит СоА дегідрогенази

· Дефіцит α-1 антитрипсину

· Муковісцидоз

· Міодистрофія Дюшена-Беккера

· Міотонічна дистрофія

· Гепато-лентикулярна дегенерація

· Синдром ламкої Х-хромосоми

· Спінально-бульбарна м’язева атрофія

· Сімейна гіперхолестеринемія

· Схильність до інсулінозалежного діабету

· Фенілкетонурія

· Хорея Гентінгтона

· Прогресуюча м’язова дистрофія Ландузі-Дежерина

· Мукополісахаридози

· Гангліозидози

· Лейкодистрофії

Тест-системи можуть бути використані для генетичного тестування, яке проводиться під час пренатальної діагностики, пресимптоматичної діагностики, для уточнення діагнозу та селективного і масового скринінгу гетерозиготних носіїв в групах високого ризику та в загальній популяції. Результати генетичного тестування є необхідною передумовою профілактики та прецизійного лікування, з метою покращення стану генофонду України та поліпшення демографічної ситуації

Граф логічної структури теми

„Цитогенетичні, біохімічні та молекулярно-генетичні методи діагностики спадкової патології”

 

 

 

ЗМІСТОВИЙ МОДУЛЬ 3.