Иммуноцитохимические методы основаны на использовании таких ферментов, как пероксидаза и щелочная фосфатаза. В настоящее время наиболее часто используются метод ПА (пероксидаза-антипероксидаза), стрептавидиновый, метод многократного усиления сигнала (Catalyzed signal amplification system), метод с участием декстрановых молекул (Envision +) и др. Одним из наиболее стабильных методов является стрептавидин-биотиновый метод с пероксидазной меткой. Метод основан на использовании МКАТ и высокой аффинности авидина по отношению к биотину. Исследуемые лимфоциты последовательно инкубируют с МКАТ определенной специфичности к CD-маркерам (мышиными или кроличьими), затем с биотилированными вторыми антителами к мышиным или кроличьим иммуноглобулинам и далее со стрептавидином, конъюгированным с пероксидазой. Визуализация результатов реакции проводится с использованием диаминобензидина (ДАБ) или аминоэтилкорбазола (АЭК) в качестве хромогена с учетом результатов при световой микроскопии.
Первым этапом исследования является нанесение выделенных из крови клеток на предметные стекла с лунками. Для этого в каждую лунку наносят по 20 мкл клеточной взвеси в концентрации 5х106/мл. Стекла помещают в термостат (37оС) для высыхания (45-90 мин). Фиксируют клетки в холодном ацетоне (4оС) в течение 10 мин. Далее на приготовленные капли наносят соответствующие специфические МКАТ к CD-маркерам клеток по 20 мкл на 10-30 мин. Стекла трижды отмываются в ФСБ, после чего на лунки наносят вторые связывающие антитела (кроличий иммуноглобулин против мыши, связанный с биотином) по 20 мкл с инкубацией 10 мин. Далее следует трехкратная промывка стекол ФСБ. Затем на лунки наносят стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой, по 20 мкл с инкубацией 10 мин. Далее следует трехкратная промывка стекол ФСБ. Приготовленный ex tempore хромоген наносят по 30 мкл на лунку на 10 мин. Хромоген смывают дистиллированной водой, и клетки докрашивают метиленовым зеленым.
Учет результатов проводят при световой микроскопии с использованием масляной иммерсии (окуляры 15, объектив 90). Подсчет проводят на 200 лимфоцитов, определяя процент положительно окрашенных клеток. Положительно окрашенной считается клетка, по окружности которой окрашенный венчик занимает не менее трети.