Методы определения цитокинов - раздел Медицина, Методы оценки иммунного статуса Учебное пособие для студентов лечебного, педиатрического и медико-профилактического факультетов Определение Содержания Цитокинов В Различных Биологических Жидкостях Имеет Бо...
Определение содержания цитокинов в различных биологических жидкостях имеет большое значение в оценке функциональной активности иммунокомпетентных клеток и регуляции иммунного ответа. В отдельных случаях (септический шок, бактериальный менингит), когда цитокины, в частности ФНОα, выступает в качестве ведущего фактора патогенеза, определение его содержания в крови или спинномозговой жидкости становится основным методом иммунологической диагностики. Иногда уровень цитокинов определяют с целью дифференциальной диагностики. Например, при бактериальном менингите в спинномозговой жидкости определяется ФНОα, а при вирусных менингитах в ней обнаруживается, как правило, только ИЛ‑1. Однако определение присутствия цитокинов в сыворотке крови и других биологических жидкостях может давать отрицательные результаты в связи с особенностями этих пептидов. Являясь в основном короткоживущими регуляторами, цитокины имеют небольшой полупериод жизни (до 10 мин). Некоторые цитокины содержатся в крови в крайне низких концентрациях, накапливаясь в основном в очаге воспаления, кроме того, биологическая активность цитокинов может маскироваться при связывании их с молекулами ингибиторов, циркулирующих в крови.
Существующие два методических подхода к выявлению и количественному определению цитокинов в биологических жидкостях - биологический и иммунохимический (ИФА) - имеют каждый свои недостатки.
Тестирование по биологическим эффектам, как правило, недостаточно чувствительно и иногда недостаточно информативно. Присутствие в той же биологической жидкости молекул ингибиторов или антагонистов может маскировать биологическую активность цитокинов. При этом нередко разные цитокины проявляют одинаковую биологическую активность. Кроме того, постановка биологических тестов требует специального дополнительного оснащения, проводится в нестандартных условиях и используется преимущественно в научно-исследовательских целях.
Биологические методы разработаны для определения активности ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИФНγ, ФНОα. Биологическое тестирование ИЛ-1 основано на его способности стимулировать пролиферацию мышиных тимоцитов линии C3H/He, стимулированных к пролиферации митогенами, интенсивность которой оценивают по реакции бласттрансформации по включению меченного изотопом тимидина. Добавление соответствующих МКАТ к цитокинам в культуре блокирует их биологическую активность, что является доказательством того, что сигналом к пролиферации клеточной линии служит определяемый цитокин.
Активность ФНОα оценивают по цитотоксическому действию на линию трансформированных фибробластов мышей L-929 с определением интенсивности разрушения клеток в культуре. За условную единицу ФНОα принимают разведение исследуемого образца, необходимое для получения 50% клеточной цитотоксичности.
Для определения биологической активности интерферона (ИФН) в исследуемых жидкостях проводят их титрование на диплоидной культуре фибробластов человека М19 в присутствии вируса везикулярного стоматита. В отсутствии ИФН вирусы вызывают деструкцию монослоя. За единицу активности ИФН принимают величину, подавляющую деструкцию монослоя на 50%. Для определения типа ИФН в систему добавляют специфическую антисыворотку против ИФНα, ИФНβ или ИФНγ. Антисыворотка отменяет действие соответствующего ИФН, что позволяет идентифицировать его тип.
Биоанализ для определения ИЛ-2 основан на способности цитокинов поддерживать рост Т - лимфоцитов, стимулированных митогеном, и поддерживать длительный рост ИЛ-2 зависимой линии Т-клеток в культуре CTLL (линия цитотоксических Т-лимфоцитов). При оценке активности ИЛ-4 учитывают его стимулирующее влияние на синтез ДНК в В-клетках, стимулированных к пролиферации антителами к Ig M.
Более широкое распространение получило определение цитокина в сыворотке крови и других биологических материалах с помощью твердофазного ИФА. Исследование проводится в соответствии с протоколом, прилагаемом к диагностической тест-системе. Чаще всего применяют вариант сендвич-ELISA, заключающийся в следующем: один тип МКАТ к определенному цитокину иммобилизируется на внутренней поверхности ячеек планшетов для исследования. В лунки планшета вносят исследуемый материал и соответствующие стандарты и контроли. После инкубации и промывки в лунки вносят вторые МКАТ к другому эпитопу данного цитокина, конъюгированные с индикаторным ферментом (пероксидазой хрена). После инкубации и промывки в ячейки вносят субстрат-перекись водорода с хромогеном. В процессе ферментативной реакции изменяется интенсивность окраски лунок, которую измеряют на автоматическом фотометре для планшетов.
ИФА с применением МКАТ против отдельных эпитопов в молекуле цитокинов отличается высокой чувствительностью и специфичностью, кроме того, преимуществом метода является объективный автоматизированный учет результатов. Однако этот метод также не лишен недостатков, так как обнаружение присутствия молекул цитокинов еще не является показателем их биологической активности, возможность ложноположительных результатов из-за перекрестно реагирующих антигенных эпитопов, использование ИФА не дает возможности определения цитокинов в составе иммунных комплексов.
Все темы данного раздела:
Иммунный статус и методы его оценки
Иммунный статус (ИС)– совокупность лабораторных показателей, характеризующих количественную и функциональную активность клеток иммунной системы. Показатели ИС отличаются большим ра
Объекты и методы иммунологических исследований
Объекты изучения
Методы изучения
Фенотипическая характеристика иммунокомпетентных клеток
Проточная цитофлуорометрия
Имм
Лимфоциты
В составе клеток иммунной системы истинными иммуноцитами являются все варианты лимфоцитов. Другие типы лейкоцитов (нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, моноциты), макрофаги, тромбоциты, тучные клетки
Клетки МФС
Моноциты периферической крови и тканевые макрофаги происходят из полипотентной стволовой клетки. Попав в кровяное русло, моноциты в течение 2-3 суток расселяются в ткани, где они превращаются в тка
Антимикробная кислородзависимая система
кислородзависимые механизмы бактерицидности
глюкоза + НАДФ+ →
Пентозофосфат + НАДФН
Цитохром b245
НАДФ + О2 ͛
Медиаторные клетки
Гранулоциты - это полиморфноядерные лейкоциты, циркулирующие в крови и возникающие, как и моноцитарно-макрофагальные клетки, из миелоидной стволовой клетки в костном мозге. Различают три типа грану
Методы иммунофенотипирования лимфоцитов
При изучении лимфоцитов оценивают их количество в периферической крови и функциональную активность. Определение количества клеток проводят с учетом дифференцировочных антигенов на и
Выделение фракции мононуклеаров
Метод выделения мононуклеаров основан на разной плавучести различных форменных элементов крови. Применение градиента определенной плотности позволяет отделить мононуклеары (лимфоциты, моноциты, бла
Проточная цитофлуорометрия
В основе метода проточной цитометрии лежит измерение оптических свойств клеток. Клетки по одиночке вводятся в ламинарный поток в проточной кварцевой кювете, где они пересекают сфокусированный свето
Метод непрямой иммунофлуоресценции
Непрямая иммунофлуоресценции – метод, основанный на использовании моноклональных антител, меченных флюорохромом, с оценкой результатов по учету специфического свечения клеток при люминесцентной мик
Иммуноцитохимический метод
Иммуноцитохимические методы основаны на использовании таких ферментов, как пероксидаза и щелочная фосфатаза. В настоящее время наиболее часто используются метод ПА (пероксидаза-антипероксидаза), ст
Методы исследования функциональной активности лимфоцитов
Функциональную активность лимфоцитов оценивают по следующим эффектам: способность к распознаванию антигенов, активации, пролиферации и дифференцировке клеток.
Способность лимфоцитов распоз
Реакция бласттрансформации лимфоцитов
Контакт лимфоцита с чужеродным антигеном или неспецифическим митогеном сопровождается активацией и реакцией бласттрансформации (РБТЛ), т.е. пролиферацией клетки с переходом малых лимфоцитов в бласт
Смешанная культура лимфоцитов
Совместное культивирование лимфоцитов, имеющих молекулы МНС-II разного гаплотипа, вызывает их бласттрансформацию и пролиферацию. Реагирующие клетки относятся к Т-лимфоцитам и стимулируются чужеродн
Методы оценки апоптоза
Апоптоз– это программируемая, генетически опосредованная форма клеточной гибели, при которой внешние или внутренние сигналы дают импульс клетке к образованию или активации ферменто
Белки плазмы крови
В плазме человека присутствует более двухсот белков, большая часть из которых выделена и описана структурно и функционально. Белки плазмы преимущественно представлены гликопротеинами. При электрофо
Глобулины.
α1-антитрипсин - это α1-глобулин, на долю которого приходится более 80% антипротеазной активности сыворотки, является основным компонентом α-полосы. В сыворотке соде
Глобулины
Гаптоглобин - период полужизни 2-4 дня. Содержание в сыворотке гаптоглобина в норме 0,3 - 2,0 г/л. Его основное функциональное значение - связывать свободный гемоглобин в сыворотке
Методы электрофореза белков
Электрофорезшироко используется для полуколичественного определения белков сыворотки крови и для выявления парапротеинов. Электрофорез проводится с сывороткой, а не с плазмой, так
Иммуноглобулины
Иммуноглобулины (Ig) – это специфические белки, которые вырабатываются иммунной системой в результате реакции на чужеродные антигены и накапливаются в сыворотке крови и других биологических жидкост
Иммуноглобулинов человека
Свойство
IgM
IgG
IgA
IgD
IgE
Молекулярная форма
Пентамер
Методы определения иммуноглобулинов
Для количественного определения содержания Ig различных классов в сыворотке крови и других биологических жидкостях широкое применение нашли различные варианты постановки реакции преципитации в геле
Парапротеины
Парапротеины - это иммуноглобулины или их фрагменты, вырабатываемые плазматическими клетками, образующимися из одной специфической клеточной линии В-лимфоцитов (моноклон). Парапротеины часто не спо
Криоглобулины
Криоглобулины - патологические белки плазмы (10-80 мг/мл), обладающие свойством превращения в желеобразное состояние при температуре ниже 37°С. Большинство криоглобулинов - это комплексы поликлонал
Методы определения иммунных комплексов
Связывание Ig с антигеном представляет собой физиологический процесс, приводящий к образованию иммунных комплексов (ИК), направленный на элиминацию антигена из организма. Однако при определенных ус
Определение аутоантител при диагностике системных заболеваний соединительной ткани
По современным представлениям аутоиммунитетом называют такие состояния, при которых в организме появляются антитела или сенсибилизированные лимфоциты против нормальных антигенов собственных тканей.
Основные серологические маркеры аутоиммунных заболеваний
Антиген
Оригинальное название
Молекулярная структура
Функция
Диагностическое значение
Определение ANA в реакции непрямой иммунофлуоресценции
При осуществлении типичного теста сыворотку пациента инкубируют с антигенными субстратами (ткань печени или почек животных, культура клеток Нер-2) для осуществления специфического связывания имеющи
Непрямой иммунофлуоресценции
Характер свечения
Антигенная
специфичность
Клиническое значение
Периферическое или краевое
dsDNA,
l
Определение ANA и ENA методом твердофазного ИФА
Тест-система для ИФА ANA (UBI MAGIWELL) - для скринингового анализа на антиядерные антитела обеспечивает полуколичественное определение широкого спектра антител к сорбированному в лунках комплексу
Аутоиммунных заболеваний
Тип патологии
Результаты иммунологического исследования. Тип антител и частота их встречаемости (%)
Система цитокинов
Цитокины - это класс растворимых пептидных медиаторов иммунной системы, необходимых для ее развития, функционирования и взаимодействия с другими системами организма. Они определяют
Интерлейкины
ИЛ-1- иммунорегуляторный медиатор, выделяемый при воспалительных реакциях, тканевых поражениях и инфекциях (провоспалительный цитокин). ИЛ-1 стимулирует пролиферацию и дифференциро
Интерфероны
Интерферон (ИФН) был обнаружен как белок, обладающий противовирусной активностью. Противовирусное действие ИФН обусловлено его способностью препятствовать внутриклеточной репликации вируса на этапе
Факторы некроза опухоли
Фактор некроза опухоли (ФНО) - основной медиатор, вырабатываемый организмом в ответ на грамотрицательные бактерии. Активным веществом грамотрицательных бактерий является ЛПС компонент клеточной сте
Колониестимулирующие факторы
Ряд цитокинов, образующихся в ходе развития иммунной реакции, обладают стимулирующим действием на дифференцировку костномозговых предшественников. Такие цитокины получили название колониестимулирую
Факторы роста
Трансформирующий фактор роста(ТФРβ) - это семейство родственных пептидов с множественными эффектами на общие процессы регуляции роста и морфогенеза. ТФРβ - основной циток
Система комплемента
Система комплемента представляет собой комплекс белков сыворотки крови, способных к самоорганизации и опосредованию реакций гуморального иммунитета и фагоцитоза. В настоящее время известно, что сис
Методы определения активности комплемента
Общая активность (титр) комплемента определяется в реакции гемолиза с использованием эритроцитов барана. Комплемент, содержащийся в исследуемой сыворотке, вызывает гемолиз сенсибилизированных баран
Титра комплемента в 50% HE
Гемолиз,%
К
Гемолиз,%
К
Гемолиз,%
К
Гемолиз,%
К
Определение компонентов комплемента
Для определения компонентов комплемента используются ИФА и турбидиметрический метод, проведение которых описано в инструкциях, прилагаемых к диагностическим тест-системам. В клинической практике на
Компонентов комплемента
Компонент комплемента
Клинические проявления
Дефицит С1
Обычно не вызывает клинически выраженных расстройств, так как ест
Методы исследования фагоцитарной активности гранулоцитов
Важнейшей характеристикой функции гранулоцитов является оценка их фагоцитарной активности. Ее снижение может быть результатом как недостаточности опсонирующих факторов сыворотки (антител, комплемен
НСТ-тест
Тест с нитросиним тетразолием (НСТ-тест) используется для выявления так называемых активированных гранулоцитов и моноцитов. В основе активации фагоцитов лежит резкое усиление окислительных реакций
Методика исследования
Необходимые реактивы и материалы: КН 42 ОРО 44 0, Na 42 ОРО 44 0, NaCI, глюкоза, нитросиний тетразолий, гепарин, метиловый спирт, 1% водный раствор метиленового зеленого (в случае
Определение миелопероксидазы
Миелопероксидаза окисляет ряд субстратов (бензидин, ортофенилепдиамин) в присутствии перекиси водорода, что сопровождается цветной реакцией. Миелопероксидаза - фермент, содержащийся в гранулах фаг
Хемилюминесценция
Спонтанное свечение, возникающее при химических реакциях за счет энергии реагирующих веществ, называется хемилюминесценцией (ХЛ). Она присуща всем тканям и клеткам живого организма, пока в них прои
Определение содержания IgE
Среди иммунологических методов оценки неспецифических параметров иммунного статуса при большинстве атопических заболеваний наибольшее значение имеет определение количества общего IgE. Однако соглас
Тест дегрануляции базофилов
У больных аллергией значительная часть IgE связывается различными лейкоцитами через их Fc-рецепторы. Наличие клеток, несущих антитела, указывает на сенсибилизацию их к соответствующему аллергену. Б
Тест клеточной антигенной стимуляции базофилов - CAST
В случае IgE-опосредованных аллергических реакций пусковой механизм начинается со связывания аллергена со специфическими молекулами IgE на поверхности базофилов или тучных клеток. Э
Реакция торможения миграции лейкоцитов
Реакция ставится с целью выявления лимфоцитов, сенсибилизированных к предполагаемому аллергену. Сенсибилизированные лимфоциты при взаимодействии со специфическим аллергеном выделяют медиаторы (ФПМЛ
Задача № 1
Больной, 23 лет, предъявляет жалобы на рецидивирующие фурункулы, локализующиеся на лице, ногах. Отмечает частые простудные заболевания (до 7-8 раз в год), герпетические высыпания на губах.
Задача № 2
Больная Н., 22 лет, обратилась к иммунологу с жалобами на рецидивирующие ОРВИ (до 7 раз в год), часто сопровождающиеся обострением хронического обструктивного бронхита. Проводимая антибактериальная
Задача № 3
Больной Т., 27 лет, неоднократно обращался к врачу по поводу рецидивирующих ОРВИ, трахеобронхита, слабости, недомогания. Из анамнеза установлено, что в течение года шесть раз переболел ОРВИ, дважды
Задача № 4
Больной К, 45 лет. Дагноз: системная красная волчанка.
При иммунологическом исследовании выявлено:
Лейкоциты - 5,5 х 109/л
Лимфоциты –37%, абс. 2,03 х 109
Задача № 5
Ребенок, 5 лет, относится к группе часто и длительно болеющих детей, рецидивы ОРВИ 1 раз в месяц, очаги хронической инфекции (хронический гайморит, аденоидит), увеличение шейных лимфатических узлов
При иммунологическом обследовании
Тесты первого уровня
Общее количество лейкоцитов. Лейкоформула
Т-лимфоциты
В-лимфоциты
Общий анализ крови
Норма
Единицы СИ
Гемоглобин М
Ж
130,0-160,0
120,0-140,0
г/л
Основные CD маркеры клеток иммунной системы
СD-маркер
Популяция клеток
% клеток
CD2
Т- и NK-клетки
Субпопуляция лимфоцитов у детей
лимфоциты
4-5 дн.-
3 месяца
4-8
месяцев
1-2
года
2-5
лет
старше
5 лет
вс
Уровень иммуноглобулинов в сыворотке крови взрослых
IgМ
IgG
IgА
IgЕ
1,3 – 1,7 г/л
12 – 14 г/л
2,1 – 2,9 г/л
Аллергологическая MAST-панель (множественный аллергосорбентный тест) для выявления специфических иммуноглобулинов к аллергенам различных групп
Пищевая панель Ig E
Российская расширенная панель Ig E
Пищевая панель Ig G
Российская универсальная панель Ig E
Словарь терминов
Авидность - прочность связывания антигена с антителом, которая определяется аффинностью и валентностью антител.
Агглютинация - агрегация к
Список сокращений и условных обозначений
АГ – антиген
АОК – антителообразующая клетка
АПК – антигенпрезентирующая клетка
АТ – антитело
ВЛС – выносящий лимфатический сосуд
ЗВК – зараженная вирус
Новости и инфо для студентов