Общая активность (титр) комплемента определяется в реакции гемолиза с использованием эритроцитов барана. Комплемент, содержащийся в исследуемой сыворотке, вызывает гемолиз сенсибилизированных бараньих эритроцитов в присутствии гемолитической сыворотки. За титр комплемента принимают его наименьшее содержание в сыворотке крови, которое вызывает 50% лизис стандартной взвеси эритроцитов, и выражают в гемолитических единицах (HE) СH50. Для исследования используется свежая сыворотка крови больного в разведении 1:10, из которой готовят последующие разведения по схеме:
| Номера пробирок | ||||||||||
| веронал-мединаловый буфер | 0,95 | 0,9 | 0,85 | 0,8 | 0,75 | 0,7 | 0,65 | 0,6 | 0,55 | 1,0 |
| Сыворотка крови 1:10 | 0,05 | 0,1 | 0,15 | 0,2 | 0,25 | 0,3 | 0,35 | 0,4 | 0,45 | - |
Эритроциты барана трижды отмывают в веронал-мединаловом буфере при центрифугировании при 1500 об/мин 5 мин и готовят стандартную 5% взвесь. Для приготовления гемолитической системы смешивают равные объемы приготовленной взвеси бараньих эритроцитов и гемолитической сыворотки в тройном титре. Смесь инкубируют в термостате при 370 30 мин, после чего гемолитическую систему разливают по 1,0 мл в каждую пробирку с разведениями исследуемой сыворотки. Пробирки инкубируются при 370 в течение часа, после чего центрифугируют для осаждения эритроцитов. Надосадочную жидкость колориметрируют при длине волны 400-480 нм на ФЭК. Процент гемолиза устанавливают по калибровочной кривой.
Для построения калибровочной кривой из стандартной 5% взвеси эритроцитов готовят раствор гемоглобина, смешивая 1 часть взвеси с 3 частями воды. Из раствора готовят разведения гемоглобина по схеме:
| Ингредиенты, мл | Гемолиз, % | |||||||||
| Раствор гемоглобина при гемолизе 5%-ной взвеси ЭБ | 0,1 | 0,2 | 0,3 | 0,4 | 0,5 | 0,6 | 0,7 | 0,8 | 0,9 | 1,0 |
| Веронал-мединаловый буфер | 0,9 | 0,8 | 0,7 | 0,6 | 0,5 | 0,4 | 0,3 | 0,2 | 0,1 | - |
Измеряют оптическую плотность (ОП) каждого разведения на ФЭК и построить график зависимости ОП от степени гемолиза.
Перерасчет результатов реакции для определения титра комплемента в 50% HE проводят, пользуясь поправочными коэффициентами (К) Крога (табл. 7).
Таблица 7