Необходимые реактивы и материалы: КН 42 ОРО 44 0, Na 42 ОРО 44 0, NaCI, глюкоза, нитросиний тетразолий, гепарин, метиловый спирт, 1% водный раствор метиленового зеленого (в случае загрязнения синей краски необходимо промывание хлороформом через делительную воронку), микропипетки, предметные стекла, микроскоп с иммерсией.
Приготовление раствора:
А. 1 % 15 М фосфатного буфера с рН 7,2 с добавлением 0,2% раствора глюкозы и 0,6% раствора натрия хлорида (к 25 мл 1/15 М КН 42 ОРО 44 0 добавляют 36 мл 1 /15 М раствора Na 42 ОНРО 44 0; на 61 4 0 мл буфера нужно 120 мг глюкозы и 370 4 Омг NaCI).
Б. 0,1% нитросиний тетразолий в изотоническом растворе натрия хлорида. Для получения красителя необходимы длительное перемешивание и подогревание в горячей воде.
Растворы А и Б фильтруют через бумажные фильтры и хранят в холодильнике при температуре 10°С в течение 2-4 недель. Непосредственно перед постановкой теста смешивают равные количества растворов А и Б, смесь нагревают до 30 - 37°С. Кровь из пальца больного берут пипеткой, промытой гепарином. В центрифужной или пластиковой пробирке смешивают по 0,1 мл гепаринизированной крови и подогретой смеси. Инкубация 25 мин в термостате при 37°С, затем 10 мин при комнатной температуре. Из верхнего слоя клеточного осадка готовят мазки, высушивают их на воздухе 3-5 мин, фиксируют метиловым спиртом, затем окрашивают метиленовым зеленым в течение 10 мин. Препараты просматривают под микроскопом с иммерсией.
Постановка стимулированного НСТ-теста. Гепаринизированную кровь предварительно инкубируют 25 мин при 37°С со стимулятором (например, 2-миллиардной взвесью стафилококка - штамм 209, надосадочной жидкостью, содержащей лимфокины и др.) в равных объемах. Затем проводят вышеописанный тест.
Учет результатов: в клинико-лабораторной практике при постановке теста восстановления нитросинего тетразолия наиболее широкое распространение получил цитохимический учет результатов, основанный на микроскопическом определении процентного содержания нейтрофилов с гранулами темно-синего цвета формазана в цитоплазме. Обычно анализу подвергают 100 - 200 сегментоядерных нейтрофилов. Показатель индуцированного варианта реакции вычисляют как разницу процентного содержания поглотивших и восстановивших тетразолий клеток после воздействия фактора стимуляции по сравнению с данными, полученными до стимуляции.
Для количественной оценки активности теста по степени активности реакции все клетки делят на 4 группы. К нулевой группе относят нейтрофилы без гранул, в первую группу включают клетки с единичными гранулами или те клетки, в которых площадь окраски формазаном занимает до 25 - 30% цитоплазмы (1 степень активности), во вторую группу нейтрофилы, цитоплазма которых на 30 - 70% занята гранулами формазана (II степень активности); в третью - нейтрофилы, до 100% заполненные гранулами независимо от того, контролировались ядра или нет (Ш степень активности). Определяют число клеток, принадлежащих в зависимости от активности фермента к каждому из типов. Это число умножают на номер (фактор) типа. Сумма полученных произведений представляет показатель реакции. Таким образом, показатель реакции восстановления нитросинего тетразолия можно рассчитать по формуле:
Показатель НСТ-теста = 1 а + 26 + Зс,
где а, б, с - количество клеток соответственно нулевого, 1, 2, 3 типов.