ПМ для поверхневого культивування є спороносна культура продуцента, що містить не менше 0,7 млрд. спор/г; без сторонньої мікрофлори. Частка пророслих спор від їх загальної кількості повинна становити не менше 86-90%.
Посівну культуру на твердому ЖС одержують вирощуванням мікроорганізмів у 3 чи 4 етапи при оптимальній температурі до інтенсивного спороутворення. Вирощування культури на перших трьох етапах здійснюється у термостаті.
На першому етапі музейну культуру продуцента на твердому агаризованому матеріалі пересівають для оновлення в пробірку на зволожених стерильних висівок. На другому етапіпродуцент культивують на цьому ж середовищі в аналогічних умовах, але в колбах об’ємом 0,75-1,0 л, де знаходиться 40-100 г вологого сипкого ЖС. Вологість ЖС після стерилізації повинна становити 45-56%. ЖС попередньо стерилізують в автоклаві протягом 1 год при 0,15 МПа, а посівнікювети – в спеціальних стерилізаційних шафах протягом 2-2,5 год при 120-130оС.
Однієї пробірки з культурою продуцента одержаної на першому етапі вистачає для засіву 3-4 колб на другому етапі. Якщо спороутворення продуцента на перших двох етапах недостатнє, то застосовують додатковий, третій етап – культивування в банках Протодьяконова – алюмінієвих круглих колбах з двома горловинами. Культуру висівають у кожну банку на 300 г вологих висівок.
На четвертому етапі ПМ висівають на ЖС у посівні кювети прямокутної форми, виготовлені з суцільного листового оцинкованого заліза й оснащені кришками з одним або двома отворами, які закривають ватяно-марлевими серветками. Одна кювета містить 0,4-0,5 кг ЖС у перерахунку на повітряно-сухі висівки. Вмісту однієї банки Протодьяконова або трьох колб достатньо для засіву 20-25 посівних кювет.
Закриті кювети з засіяним живильним середовищем розміщують на стаціонарних стелажах у вирощувальній камері. Подачею кондиційованого повітря у камері підтримують вологість і температуру, необхідні для інтенсивного спороутворення продуцента. Зокрема, для пліснявих грибів температура становить 24-32оС, вологість – 55-97%.
У камерах у кюветах повинно знаходитися не більше 1-2 кг засіяного середовища (у перерахунку на сухі речовини) на 1 м3 об’єму камери. Цей показник (кг середовища/м3 камери) називаютьпитомим навантаженням камери за культурою. Його визначають з метою встановлення кратності обміну повітря у вирощувальній камері. При питомому навантаженні 1-2 кг/м3 кратність обміну повітря у камері повинна становити 2-3 м3/(м3·год).
Готовий ПМ знімають з кювет за допомогою ручного маніпулятора і вологим вкладають у стерильні пакети, які передають на зберігання в камеру з температурою не вище 4оС до завершення мікробіологічної та біохімічної перевірки. Тривалість зберігання ПМ не повинна перевищувати 5-6 днів, оскільки волога культура поступово стає малопридатною для одержання з неї активної виробничої культури. Для тривалішого зберігання ПМ підсушують повітрям при температурі 28-30оС до вологості 10-12% у вирощувальній камері при знятих з кювет кришках.
Якщо ПМ відповідає всім вимогам мікробіологічного та біохімічного контролю, його передають з холодного приміщення у відділення приготування посівної суспензії.
Використання посівної культури у вигляді міцелярної маси дозволяє в 2,5-3 рази скоротити тривалість приготування ПМ і у 4-5 рази зменшити площу цеху ЧК, покращити умови праці, і найважливіше – зменшити спороутворення у готовій виробничій культурі.
На першому етапі вихідну культуру продуцента з пробірки пересівають на агаризоване середовище, нанесене тонким рівномірним шаром на внутрішню поверхню колби об’ємом 0,5-0,75 л. На другому етапі з колби спори (конідії) продуцента разом з міцелієм без порушення цілісності агаризованого живильного середовища змивають 100-150 мл стерильної води й одержаною суспензією засівають стерильні зволожені висівки у колбах такого ж об’єму. Змиву з однієї колби достатньо для засіву 15-20 колб з висівками. На першому і другому етапах мікроорганізми культивують при оптимальній температурі до інтенсивного спороутворення.
На третьому етапі вирощеною на висівках культурою засівають рідке живильне середовище в ємностях об’ємом 8-10 л. Однієї колби вистачає на приготування посівної суспензії для двох ємностей (ступінь заповнення 30-40%). Використовують сусло-росткове живильне середовище. Під час культивування ємності з рідким живильним середовищем струшують на гойдалці з частотою 200-220 об/хв. Оптимальні для кожного продуцента температура і тривалість культивування різні. Міцелярну масу після культивування охолоджують до 4-6оС і піддають контролю.
Цей спосіб застосовують при невеликій продуктивності заводу або цеху (до 3-6 т готової культури на добу).
При більшій продуктивності підприємства посівний матеріал одержують у вигляді міцелярної маси додатковим культивуванням продуцента в невеликих ферментаторах.
Посівний матеріал для глибинного культивування готують у декілька стадій:
o оновлення вихідної культури продуцента на агаризованому середовищі;
o вирощування маточної культури у колбах на рідкому живильному середовищі на гойдалці;
o культивування продуцента в інокуляторі малого об’єму;
o вирощування посівної культури у інокуляторі великого об’єму.
Необхідність стадійного приготування посівного матеріалу зумовлена тим, що його витрата коливається у широких межах – від 1 до 15 об.% і більше. Кількість стадій визначається лише об’ємом виробництва та оптимальною нормою витрати посівного матеріалу для даного продуцента. Витрата посівного матеріалу залежить від фізіологічних особливостей продуцента. Для більшості актиноміцетів, зокрема, витрата посівного матеріалу становить 5-20%, а для спороносних бактерій – приблизно 1%.
ПМ готують у такій послідовності:
o перша стадія – вихідну культуру з пробірки пересівають на матраци з великою кількістю твердого агаризованого середовища. Культивування ведуть при оптимальній температурі; тривалість: для пліснявих грибів – до початку інтенсивного спороутворення, для інших мікроорганізмів – до досягнення найсприятливішого віку культури;
o друга стадія – вирощену на агаризованому середовищі культуру пересівають у вигляді водної суспензії (з розрахунку 1-5 об.%) на рідке живильне середовище у колби об’ємом 0,75 л. Колби закріплюють на гойдалці для струшування рідини, що сприяє розчиненню кисню в середовищі та забезпечує нормальні умови життєдіяльності мікроорганізмів. Ця стадія, як правило, менш тривала, ніж попередня. Її контролюють за морфологічними ознаками мікроорганізмів. Найкращі результати дає культура, яка знаходиться на стадії фізіологічної зрілості наприкінці логарифмічної стадії росту.
Культуру, одержану на другій стадії вирощування, часто називають маточною культурою. Її можна використовувати як посівну, якщо у виробництві використовують ферментатор малого об’єму.
o третя стадія – культуру з колб пересівають у розрахунку 2-3 об.% на стерильне живильне середовище в інокулятор малого об’єму. На цій стадії одержують у 35-50 разів більше ПМ, ніж у колбах. Культивування на третій стадії ведуть в умовах, аналогічних до другої стадії. ЖС готують, стерилізують і охолоджують у інокуляторі. Піногасник стерилізують і охолоджують у спеціальній ємності і подають в інокулятор при необхідності.
o четверта стадія – готову культуру з інокулятора малого об’єму перетискають стерильним повітрям у інокулятор великого об’єму і культивують в умовах, аналогічних до виробничих. Об’єм інокулятора складає 3-5 об.% від об’єму виробничого ферментатора. Живильне середовище для інокулятора готують в окремих апаратах і передають у стерильний охолоджений до 60-70оС інокулятор, обладнаний мішалкою та барботером.
Культивування на всіх стадіях ведуть при оптимальній температурі й керуванні середовища. Як правило, готовий ПМ негайно передають у виробництво.
При непередбачуваних затримках його охолоджують безпосередньо в інокуляторі до 8-10оС, але без погіршення якості зберігають не більше, ніж 3-4 год.