Отбор случайных мутаций

Метод применяется в тех случаях, когда нет сведений о пути синтеза желаемого продукта и его регуляции. Метод состоит из нескольких этапов (ступенчатый отбор с применением мутагенов).

Каждый этап состоит в следующем исходная культура обрабатывается одним мутагеном или разными, взятым в нескольких дозах, обеспечивающих разную выживаемость. Из каждого опыта отсеивают не менее 100 колоний без выбора. Значения уровней продукции вариантов после обработки мутагеном выражают в процентах к уровню продукции исходной культуры и распределяют в вариационном ряду.

Полученные вариационные ряды сравнивают с контрольным рядом исходной культуры.

В результате сравнения выявляют положительные и отрицательные варианты, которыми считают все клоны, уровень продукции из которых выходит за пределы ±2σ контрольного ряда. Положительные варианты – материал для дальнейшей работы. Дозы мутагена, давшего положительные варианты, целесообразно использовать ещё раз. После нескольких этапов все лучшие варианты суммируют, результаты статически обрабатывают и выбирают оптимальный вариант. Наиболее эффективны первые этапы отбора, затем темп падает, для устранения этого меняют мутагенный фактор, переходят на другую селекционную линию и т. д.

Отбор по количественному признаку среди мутантов с определённым фенотипом

Метод применяют, используя сведения о пути, регуляции и взаимосвязях синтеза желаемого продукта у данного микроорганизма.

Ауксотрофные мутации

Ауксотрофы – микроорганизмы, утратившие способность синтезировать одно из веществ, необходимых для их роста.

Их использование позволяет блокировать образование ингибитора корепрессора синтеза желаемого продукта, перераспределить поток общих предшественников, уменьшить или остановить превращение нужного продукта. Ауксотрофные мутации получают с помощью мутагенов, применяя известные методы, облегчающие отбор таких мутантов: метод обогащения, основанный на действии антибиотиков на растущие в минимальной среде (то есть прототрофные) клетки, а также метод реплик.

У полученных ауксотрофных мутантов определяют питательные потребности, отбирают мутанты с той потребностью, которую хотели получить, и у последних оценивают способность продуцировать желаемое вещество.

Если потребность в метаболите может быть обусловлена блокированием разных этапов его синтеза, то не на каждом этапе мутация даст эффект. Кроме того, ауксотрофность не всегда вызывается блоком в пути синтеза. Поэтому необходимо получить и оценить продуктивность несколько десятков мутантов с качественно одинаковой потребностью для того, чтобы выбрать наиболее продуктивный, если расчёт на ауксотрофность оказался верным, и составить обоснованное представление о влиянии данной мутации на продукцию желаемого вещества.

Отбор среди ревертрантов ауксотрофных мутантов, у которых ауксотрофность вызвана дефектом определённого фермента в пути синтеза метаболита, позволяет получить мутанты с восстановленной каталитической, но утраченной регуляторной функцией фермента, катализирующего синтез данного продукта. Получить ревертранты к прототрофности несложно. Для этого после обработки мутагеном клетки ауксотрофа в большой концентрации высеваю - на чашки с агаризированной минимальной средой.

Выросшие колонии отсеивают на минимальную среду с рассевом до отдельных колоний, чтобы освободить от ауксотрофных клеток, составлявших «фон» на чашках при появлении колоний ревертрантов. Выросшие на минимальной среде колонии пересеивают на полноценную среду, и полученные клоны затем оценивают на способность продуцировать желаемое вещество.

Отбор среди мутантов, резистентных к структурным аналогам аминокислот или азотистых оснований

Наиболее пригодны для селекционной работы те вещества, которые действуют на регуляторные системы синтеза подобно природному метаболиту, но не могут выполнять основную функциональную роль этого метаболита в клетке. Способность аналога подавлять рост клеток и очевидное устранение этой способности в присутствии добавленного природного метаболита является основными причинами пригодности аналога для селекционной работы.

Для получения аналогорезистентных мутантов суспензию клеток исходной культуры после обработки мутагеном высеивают в большой концентрации на чашки с агаризированной минимальной средой, содержащей аналог, ингибирующий рост исходной культуры. На таких чашках через несколько суток инкубации появляются колонии мутантов, преодолевающих действие аналога. Часть таких мутантов имеет мутации, нарушающие регуляцию синтеза желаемого метаболита и вызывающие его сверхсинтез, другая часть - мутации, нарушающие транспорт аналогов в клетку.

После отсева колоний, выросших на среде с аналогом, и выделения у них отдельных клонов из каждой первичной колонии проверяют по 1 - 2 клона на способность продуцировать нужное вещество, отбирают те, у которых средний уровень продукции больше, чем средний уровень продукции родительского штамма. Затем проводят ещё несколько этапов на постепенно повышающихся концентрациях аналога или с другим аналогом того же метаболита.

У отобранных аналогорезистентных штаммов очень важно исследовать природу того регуляторного нарушения, которое привело к сверхсинтезу или повысило его уровень.

Типичным мутационным нарушением, приводящим к сверхсинтезу, считается утрата чувствительности регуляторного фермента (десенсибилизация) к ингибированию конечным продуктом (метаболитом), а также нарушение механизма репрессии синтеза фермента, что обеспечивает их неконтролируемый синтез.