Низкомолекулярные азотсодержащие соединения
Влияющие факторы
· in vivo: увеличение — нефротоксичные препараты, кортикостероиды, избыток тироксина; снижение — увеличение концентрации соматотропного гормона,
· in vitro: снижение (метод с уреазой) — цитрат натрия.
Клинико‑диагностическое значение
Моча
Повышение количества мочевины в моче связано с гипертиреозом, злокачественной анемией, лихорадкой, при отравлении фосфором, отмечается при диете с высоким содержанием белка, в послеоперационном периоде.
Снижение наблюдается у больных с нефритом и другими заболеваниями почек, уремией, паренхиматозной желтухой, циррозом или дистрофией печени, также у здоровых растущих детей и при низкобелковой диете.
Унифицированным методом является фосфорновольфрамовый метод.
Определение содержания мочевой кислоты в сыворотке крови фосфорновольфрамовым методом
Принцип метода
Мочевая кислота восстанавливает фосфорновольфрамовый реактив с образованием комплекса голубого цвета. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию в пробе мочевой кислоты. При этом мочевая кислота окисляется до аллантоина (продукт окисления мочевой кислоты) и образуется вольфрамовая синь не установленного состава.
вольфрамовая синь
Реактивы.
Н серная кислота. 10,0 мл концентрированной кислоты вносят в мерную колбу на 500 мл, содержащую небольшое количество дистиллированной воды. После тщательного перемешивания объем доводят дистиллированной водой до метки.
2.Раствор вольфравомовокислого натрия. 50 г волфрамовокислого натрия (Na2WO4•2H2O) помещают в мерную колбу на 500 мл с небольшим объемом дистиллированной воды, после чего доводят ее до метки.
3.Раствор углекислого натрия. 51,5 г Na2CO3 растворяют в мерной колбе на 500 мл.
4.Фосфорновольфрамовый реактив. В круглодонную колбу (объем – 1500 мл) вносят 40 г Na2WO4•2H2O и 300 мл дистиллированной воды. Добавляют в смесь 32,0 мл ортофосфорной кислоты (85 г/100 мл) и несколько стеклянных бусинок. Вставляют в колбу обратный холодильник и осторожно кипятят ее содержимое в течение 2 ч на песчаной или глицериновой бане. Охлаждают раствор при комнатной температуре и доводят его объем дистиллированной водой до 1 л. Затем в колбе растворяют 32,0 г сернокислого лития (Li2SO4•H2O). Реактив хранят в темной посуде в холодильнике. Раствор стабилен длительное время.
5.Основной стандартный (калибровочный) раствор – 100 мг/100 мл. В мерной колбе на 100 мл растворяют 0,6 г углекислого лития (Li2СO3) в 50 мл дистиллированной воды при нагревании смеси до 600С. Добавляют 100 г мочевой кислоты и содержимое колбы тщательно перемешивают до полного растворения внесенных компонентов. Затем вливают в нее 2,0 мл формалина и 0,15 мл ледяной уксусной кислоты. Содержимое колбы перемешивают и доводят объем дистиллированной водой до метки. Реактив хранят в темной посуде в холодильнике в течение 2 лет. 1 мл раствора содержит 1,0 мг мочевой кислоты.
Рабочий стандартный раствор. 1,0 мл основного калибровочного раствора доводят до 200 мл дистиллированной водой. 1,0 мл раствора содержит 0,005 мг мочевой кислоты. Рабочий стандартный раствор при хранении в холодильнике годен в течение 2 недель.
Ход определения.
В пробирку вносят 8,0 мл воды, 1,0 мл сыворотки, 0,5 мл раствора серной кислоты и содержимое пробирки перемешивают, затем добавляют 0,5 мл раствора вольфрамово- кислого натрия и после тщательного перемешивания через 5-10 мин смесь фильтруют посредством бумажного фильтра. 3,0 мл полученного фильтрата используют для анализа.
2.В две пробирки отмеривают 3,0 мл дистиллированной воды (холостая проба) и 3,0 мл рабочего стандартного раствора. В каждую пробирку (с опытной, холостой и стандартной пробами) вносят 1,5 мл раствора Na2CO3 (3), содержимое пробирок перемешивают и вносят 1,0 мл фософорновольфрамового реактива. Растворы взбалтывают. Через 30 мин измеряют оптическую плотность в кювете с шириной слоя 10 мм при длине волны 590-700 нм (красный светофильтр ФЭКа). Показатели экстинкции опытной и стандартной проб сопоставляют с оптической плотностью холостой (контрольной) пробы. Расчет ведут по формулам:
МК (мг/100 мл) = Еоп.• Сст.• 10 / Ест. = Еоп.• 5/ Ест.
МК (ммоль/л) = Еоп. • Сст.• 10 • 0,059 / Ест. = Еоп. • 5 • 0,059/ Ест., где
Еоп – экстинкция опытной пробы; Ест. – экстинкция стандартной пробы (за вычетом оптической плотности контрольной пробы); Сст. – концентрация стандартного раствора 0,5 г/мл; 0,059 – коэффициент пересчета в единицы СИ; 10 – коэффициент пересчета на сыворотку.
Определение мочевой кислоты по методу Мюллера-Зейферта.
Принцип метода основан на колориметрировании окрашенных продуктов, образующихся при восстановлении фосфорновольфрамового реактива мочевой кислотой.
Реактивы.
Ход определения.
В центрифужную пробирку вносят 1,5 мл сыворотки, 1,5 мл дистиллированной воды и 1,5 мл ТХУ. Содержимое пробы тщательно перемешивают и через 30 мин центрифугируют. Дальнейший порядок работы показан в таблице.
| Реактивы | Опыт | Стандарт |
| Центрифугат, соответствующий 0,5 мл сыворотки | 1,5 мл | - |
| Стандартный рабочий раствор | - | 0,5 мл |
| ТХУ | - | 0,5 мл |
| Дист. вода | - | 0,5 мл |
| Насыщенный раствор Na2CO3 | 0,7 мл | 0,7 мл |
| Реактив Фолина | 1 капля | 1 капля |
Пробы перемешивают и через 10 мин колориметрируют на ФЭКе при зеленом светофильтре в кювете с шириной слоя 5 мм, используя для сравнения дистиллированную воду.
Расчет производят по формуле:
Сх= (Сст. • Еоп.)/Ест., где
Сх – концентрация мочевой кислоты в сыворотке (мг/100 мл); Сст. – концентрация мочевой кислоты в стандартной пробе; Еоп. – оптическая плотность опытной пробы; Ест. – оптическая плотность стандартной пробы. При умножении Сх на 0,059 получают содержание МК в ммоль/л.
Определение содержания мочевой кислоты методом ультрафиолетовой фотометрии по Маримонт и Лондону.
Принцип метода основан на прямом измерении поглощения мочевой кислоты в узкой зоне (282-295 нм) с оценкой результатов по калибровочной кривой или по формуле.
Влияющие факторы
Пища, богатая пуринами; диуретики, салицилаты, кортикостероиды, лекарственные вещества — производные пурина, фенола, гемолиз.
Клинико‑диагностическое значение
Определение концентрации мочевой кислоты имеет особое значение для диагностики начальных стадий поражения почек и подагры.
Моча
Увеличение содержания мочевой кислоты выявляется при подагре, лейкозах, вирусном гепатите, серповидноклеточной анемии, болезнь Вильсона‑Коновалова. Снижение — при ксантурии, дефиците фолиевой кислоты, свинцовой интоксикации.
Унифицированным методом определения в сыворотке крови и моче является метод Поппера с соавт., основанный на реакции Яффе.
Влияющие факторы
Повышение содержания отмечается при употреблении мясной пищи и при усиленной физической работе. Ложное увеличение показателя может вызвать липемия и гемолиз, ложное снижение — желтуха.
Клинико‑диагностическое значение.
Сыворотка, плазма
Увеличение содержания креатинина в плазме (сыворотке) крови обусловлено как его усиленным образованием, так и задержкой этого метаболита в организме. Различают продукционную и ретенционную гиперкреатининемию.
Продукционная гиперкреатининемия отмечается при кишечной непроходимости, острой атрофии печени, декомпенсации деятельности сердечно-сосудистой системы, пневмонии, лихорадочных состояниях, изменении эндокринного баланса (акромегалии, гипертиреозе), а также при голодании и усиленной мышечной работе.
Ретенционная гиперкреатининемия обусловлена нарушением функции почек любого происхождения и обычно наблюдается при уменьшении клубочковой фильтрации, поражении паренхимы почек и др.
Гиперкреатининемию рассматривают как ранний показатель развивающейся недостаточности почек. Устойчивое повышение уровня креатинина в крови, как и возрастание концентрации мочевины в ней, указывает на нарушение функции почечного фильтра.
Гипокреатининемия отмечается при уменьшении мышечной массы, во время беременности (особенно I и II триместры).
Моча
Увеличение концентрации креатинина может быть связано с повышенной физической активностью, с лихорадочными состояниями, отмечается при выраженной недостаточности функции печени, при сахарном диабете, инфекциях. Снижение обнаруживается при голодании, у больных с мышечной атрофией, с дегенерацией и амилоидозом почек, лейкемией.
Амниотическая жидкость
Накопление креатинина выявляется при беременности больных сахарным диабетом, преэклампсии.
Модифицированный способ определения веществ группы средних молекул в биологических жидкостях.
Принцип методаоснован на осаждении высокомолекулярных белков плазмы крови действием хлорной кислоты и этилового спирта с последующей спектрофотометрией при 210 нм, 254 нм и 280 нм.
Реактивы
1.1,2 моль/л раствора хлорной кислоты (13,8 мл хлорной кислоты х.ч. довести дистиллированной водой до 100 мл.
2.2 моль/л раствора калия углекислого (К2СО3).
3.Этиловый спирт, 96% раствор.
Определение свободного аминного азота в сыворотке крови (по методу Г.А.Узбекова в модификации З.С.Чулковой).
Принцип метода.Содержание аминоазота определяют колориметрически по интенсивности окрашивания комплекса, образующегося за счет взаимодействия аминогрупп с нингидриновым реактивом.
-Аминокислоты реагируют с нингидрином, образуя сине-фиолетовый комплекс (пурпур Руэманна), интенсивность окраски которого пропорциональна количеству аминокислоты. Реакция идет по схеме:
Реактивы.
1.0,04 Н раствор уксусной кислоты – 0,23 мл ледяной СН3СООН на 100 мл воды.
2.Водный раствор нингидрина – 1г/100 мл.