Петлевые домены ДНК – третий уровень структурной организации хроматина

Расшифровка принципа строения элементарных хромосомных компонентов – нуклеосом и 30 нм фибрилл – еще мало что дает для понимания основ трехмерной организации хромосом, как в интерфазе, так и в митозе. Сорокакратное уплотнение ДНК, которое достигается при сверхспиральном характере ее компактизации, совершенно еще недостаточно для получения реального (1 х 10⁴) уровня уплотнения ДНК. Следовательно должны существовать более высокие уровни компактизации ДНК, которые в конечном счете должны определять размеры и общие характеристики хромосом. Такие высшие уровни организации хроматина были обнаружены при искусственной его деконденсации, когда было найдено, что поддержание их связано с негистоновыми белками. В этом случае специфические белки связываются с особыми участками ДНК, которые в местах связывания образуют большие петли или домены. Таким образом следующие более высокие уровни компактизации ДНК связаны не с ее дополнительной спирализацией, а с образованием поперечной петлистой структуры, идущей вдоль интерфазной или митотической хромосомы.

Как уже указывалось, сложная структура ядра или нуклеоида прокариот организована в виде иерархии петлевых доменов ДНК, связанных с небольшим количеством специальных белков.

Петлевой принцип упаковки ДНК обнаруживается также и у эукариотических клеток. Так если выделенные ядра обработать 2 М NaCI, т.е. удалить все гистоны, то целостность ядра сохраняется, за исключением того, что вокруг ядра возникнет т.н. «гало», состоящее из огромного числа петель ДНК. Такая структура ядер получила название «нуклеоида» (это только терминологическое сходство с ядерным аппаратом прокариот). Гало (или периферия такого нуклеоида) состоит из огромного (до 50000) количества замкнутых на периферии петель ДНК, со средним размером петель около 60 т.п.н., основание которых закреплено где-то внутри ядра, на участках негистоновых белков. Тем самым считается, что после удаления гистонов основания петлевых доменов ДНК, связаны с т.н. «матриксом» или «скэффолдом» - негистоновым белковым остовом интерфазного ядра. Оказалось, что участки ДНК, связанные с этим остовом, имеют особое сродство к негистоновым белкам, их состав изучен, они получили название MAR (matrix attachment region) или SAR (scaffold attachment region) участков.

Оказалось, что петлевые домены ДНК интерфазных ядер можно выделить. В выделенных ядрах в присутствии двухвалентных катионов (2 мМ Ca⁺⁺ ) в хроматине ядра выявляются небольшие сгустки величиной около 100 нм, т.н. хромомеры. Если такие хромомеры препаративно выделить, а затем экстрагировать из них гистоны, то под электронным микроскопом можно видеть розетковидные петлистые структуры, где отдельные петли отходят от центрального плотного участка. Количество петель в такой розетке может составлять 15-80, а общая величина ДНК может достигать 200 т.п.н., с суммарной длиной ДНК до 50 мкм. Обработка таких розеток протеиназами приводит к исчезновению плотной центральной области розетки и к разворачиванию петель ДНК.

Признаки петлевой доменной организации хроматина можно наблюдать с помощью электронного микроскопа после помещения ядер или хромосом в солевые растворы низкой ионной силы (0,01 М NaCI) в присутствии низких концентраций двухвалентных катионов ( 1 мМ). В этих условиях не происходит депротеинизации хроматина, он сохраняет свою нормальную химическую композицию, но значительно разрыхляется и представлен стандартными фибриллами толщиной 30 нм. При этом в некоторых местах можно видеть, что отдельные сгустки конденсированного хроматина выявляют особую структуру. Это – розетковидные образования, состоящие из многих петель30 нм фибрилл, соединяющихся в общем плотном центре. Средний размер таких петлистых розеток достигает 100-150 нм. Подобные розетки фибрилл хроматина – хромомеры – можно видеть в ядрах самых разнообразных объектов, животных, растений, простейших (рис. 63).

Особенно демонстративно такие хромомеры выявляются на тотальных препаратах хроматина из макронуклеусов инфузории Bursaria. В этом случае можно видеть, что каждый хромомер состоит из нескольких содержащих нуклеосомы петель, которые связаны в одном центре. Хромомеры связаны друг с другом участками нуклеосомного хроматина, так что в целом видна цепочка розетковилных структур (рис. 64).

Сходные картины можно наблюдать при разрыхлении политенных хромосом. Здесь хромомеры в виде розеток хроматина выявляются в зонах хроматиновых дисков, в то время как междисковые участки их не содержат (рис. 65). При деконденсации хроматина ядер некоторых растений (Allium, Haemantnus, Vicia), для которых характерна особая структура интерфазных ядер, хромомеры видны в составе хромонемных нитей.

Подобные розетковидные петлистые структуры, хромомеры, можно видеть также при разрыхлении и митотических хромосом как животных, так и растений. Следовательно, хромосомные 30 нм фибриллы, состоящие из ДНК и гистонов, упаковываются в виде петлистых розетковидных структур, претерпевая еще дополнительную компактизацию. Это третий уровень структурной организации хроматина, как считается, может приводить уже к 600-кратной компактизации ДНК (рис. 66).

Важно отметить, что размер отдельных петлевых доменов совпадает с размером средних репликонов и может соответствовать одному или нескольким генам. В своих основаниях петли ДНК связаны негистоновыми белками ядерного матрикса, в состав которых могут входить как ферменты репликации ДНК, так и транскрипции. Такая петельно-доменная структура хроматина обеспечивает не только структурную компактизацию хроматина, но и организует функциональные единицы хромосом – репликоны и транскрибируемые гены. Комплекс белков, участвующих в такой структурно-функциональной организации хроматина, относится к белкам ядерного матрикса.

Глава 6. Ядерный белковый матрикс

Общий состав ядерного матрикса

Мы уже познакомились с тем, что в интерфазном ядре развернутые хромосомы располагаются не хаотично, а строго упорядоченно. Такая организация хромосомы в трехмерном пространстве ядра необходима не только для того, чтобы при митозе происходила сегрегация хромосом, их обособление от соседей, но и кроме того необходима для упорядочения процессов репликации и транскрипции хроматина. Можно предполагать, что для осуществления этих задач должна существовать какая-то каркасная внутриядерная система, которая может служить объединяющей основой для всех ядерных компонентов – хроматина, ядрышка, ядерной оболочки. Такой структурой является белковый ядерный остов или матрикс. Необходимо сразу же оговориться, что ядерный матрикс не представляет собой четкой морфологической структуры: он выявляется как отдельный морфологический гетерогенный компонент при экстракции из ядер практически всех участков хроматина, основной массы РНК и липопротеидов ядерной оболочки. От ядра, которое не теряет при этом своей общей морфологии, оставаясь сферической структурой, остается как бы каркас, остов, который иногда называют еще «ядерным скелетом».

Впервые компоненты ядерного матрикса (остаточные ядерные белки) были выделены и охарактеризованы в начале 60-х годов. Было обнаружено, что при последовательной обработке изолированных ядер печени крыс 2 М раствором NaCI, а затем ДНКазой, происходит полное растворение хроматина, а основными структурными элементами ядра остаются: ядерная оболочка, связанные с ней компоненты – нуклеонемы (ядерные нити), содержащие белок и РНК, и ядрышки. Была высказана гипотеза, что фибриллы хроматина в нативных ядрах прикреплены к этим осевым белковым нитям наподобие «ершика для чистки бутылок» (см. рис. 67).

Значительно позднее (середина 70-х годов) эти работы получили развитие и привели к появлению массы новых сведений о нехроматиновых белках ядерного остова и о его роли в физиологии клеточного ядра. В это же время был предложен термин «ядерный матрикс» для обозначения остаточных структур ядра, которые могут быть получены в результате последовательных экстракций ядер различными растворами. Новым в этих приемах было использование неионных детергентов, таких как Тритон Х-100, растворяющих ядерные липопротеидные мембраны.

Последовательность обработки выделенных ядер, приводящая к получению препаратов ядерного матрикса, обогащенного белком, следующая (см. табл. 6).

Таблица 6. Экстракция (в %) ядерных компонентов в процессе получения ядерного белкового матрикса

Обработка	Фракция	Белок	ДНК	РНК	Фосфолипиды
1.Изолированные ядра 2. 0,2 мМ MgCl2 3. 2 M NaCl 4. 1% Тритон Х- 5.ДНКаза+РНКаза	N LS HS   NM NPM				2,5 6,4   97,8

 

Изолированные ядра, полученные в растворах 0,25 М сахарозы, 0,05 М Трис-HCI буфера и 5 мМ MgCI₂помещались в раствор низкой ионной силы (LS), где деградировала основная масса ДНК за счет эндонуклеазного расщепления. В 2 М NaCI (HS) в дальнейшем происходила диссоциация хроматина на гистоны и ДНК, шла дальнейшая экстракция фрагментов ДНК и различных белков. Последующая обработка ядер в 1% растворе Тритона Х-100 приводила почти к полной потере фосфолипидов ядерной оболочки и получению ядерного матрикса (NM), содержащего остатки ДНК и РНК, которые дополнительно растворялись при обработке нуклеазами, в результате чего получали конечную фракцию ядерного белкового матрикса (NPM). Он состоит на 98% из негистоновых белков, в него, кроме того, входит 0,1% ДНК, 1,2% РНК, 1,1% фосфолипидов.

Химический состав ядерного матрикса, полученный таким способом сходен у различных объектов (см. табл. 7).

Таблица 7.Состав ядерного белкового матрикса

Объект	Белок	ДНК	РНК	Фосфолипиды
Крыса, печень 97 0,1 1,2 1,1 Клетки HeLa 92,3 1,2 0,05 6,9 Тетрахимена 97 0,1 1,2 0,5

 

По своей морфологической композиции ядерный матрикс состоит,по крайней мере, из трех компонентов: периферический белковый сетчатый (фиброзный) слой – ламина (nuclear lamina, fibrous lamina), внутренняя или интерхроматиновая сеть (остов) и «остаточное» ядрышко (рис. 68).

Ламина представляет собой тонкий фиброзный слой, подстилающий внутреннюю мембрану ядерной оболочки. В ее состав входят так же комплексы ядерных пор, которые как бы вмурованы в фиброзный слой. Часто эту часть ядерного матрикса называют фракцией «поровый комплекс – ламина» (PCL – “pore complex – lamina”). В интактных клетках и ядрах ламина большей частью морфологически не выявляется, т.к. к ней тесно прилегает слой периферического хроматина. Лишь иногда ее удается наблюдать в виде относительного тонкого (10-20 нм) фиброзного слоя, располагающегося между внутренней мембраной ядерной оболочки и периферическим слоем хроматина.

Структурная роль ламины очень велика: она образует сплошной фиброзный белковый слой по периферии ядра, достаточный для того, чтобы поддерживать морфологическую целостность ядра. Так удаление обеих мембран ядерной оболочки с помощью Тритона Х-100 не вызывает распада, растворения ядер. Они сохраняют свою округлую форму и не расплываются даже в случае перевода их в низкую ионную силу, когда происходит набухание хроматина.

Внутриядерный остов или сеть морфологически выявляется только после экстракции хроматина. Он представлен рыхлой фиброзной сетью, располагающейся между участками хроматина, часто в состав этой губчатой сети входят различные гранулы РНП-природы.

Наконец, третий компонент ядерного матрикса – остаточное ядрышко – плотная структура, повторяющая по своей форме ядрышко, также состоит из плотно уложенных фибрилл.

Морфологическая выраженность этих трех компонентов ядерного матрикса, так же как и количество во фракциях, зависит от целого ряда условий обработки ядер. Лучше всего элементы матрикса выявляются после выделения ядер в относительно высоких (5 мМ) концентрациях двухвалентный катионов.

Обнаружено, что для выявления белкового компонента ядерного матрикса большое значение имеет образование дисульфидных связей. Так если ядра предварительно инкубировать с иодацетамидом, препятствующим образованию S-S связей, а затем вести ступенчатую экстракцию, то ядерный матрикс представлен только комплексом PCL. Если же использовать тетратионат натрия, вызывающий замыкание S-S связей, то ядерный матрикс представлен всеми тремя компонентами. В ядрах, предварительно обработанных гипотоническими растворами, выявляются только ламина и остаточные ядрышки.

Все эти наблюдения привели к выводу, что компоненты ядерного матрикса представляют собой не застывшие жесткие структуры, а компоненты, обладающие динамической подвижностью, которые могут меняться не только в зависимости от условий их выделения, но и от функциональных особенностей нативных ядер. Так, например, в зрелых эритроцитах кур весь геном репрессирован и хроматин локализован преимущественно на периферии ядра, в этом случае внутренний матрикс не выявляется, а только ламина с порами. В эритроцитах 5-дневных куриных эмбрионов, ядра которых сохраняют транскрипционную активность, элементы внутреннего матрикса выражены отчетливо.

Как было видно из табл. 7, основной компонент остаточных структур ядра – белок, содержание которого может колебаться от 98 до 88%. Белковый состав ядерного матрикса из разных клеток довольно близок. Характерными для него являются три белка фиброзного слоя, и носящих название ламинов. Кроме этих основных полипептидов в матриксе присутствует большое количество минорных компонентов с молекулярными массами от 11-13 до 200 кД.

Ламины представлены тремя белками (ламины A, B, C). Два из них, ламины A и C, близки друг к другу иммунологически и по пептидному составу. Ламин B от них отличается тем, что он представляет собой липопротеид и поэтому он более прочно связывается с ядерной мембраной. Ламин B остается в связи с мембранами даже во время митоза, тогда как ламины А и С освобождаются при разрушении фиброзного слоя и диффузно распределяются по клетке.

Как оказалось, ламины близки по своему аминокислотному составу промежуточным микрофиламентам (виментиновым и цитокератиновым), входящим в состав цитоскелета. Часто фракция выделенных ядер, а также препараты ядерного матрикса содержат значительные количества промежуточных филаментов, которые остаются связанными с периферией ядра даже после удаления ядерных мембран.

В отличие от промежуточных филаментов ламины при полимеризации не образуют нитчатых структур, а организуются в сети с ортогональным типом укладки молекул. Такие сплошные решетчатые участки, подстилают внутреннюю мембрану ядерной оболочки, могут разбираться при фосфорилировании ламинов, и вновь полимеризоваться при их дефосфорилированиии, что обеспечивает динамичность как этого слоя, так и всей ядерной оболочки.

Молекулярная характеристика белков внутриядерного остова детально еще не разработана. Показано, что в его состав входят ряд белков, принимающих участие в доменной организации ДНК в интерфазном ядре в создании розетковидной, хромомерной формы упаковки хроматина. Предположение о том, что элементы внутреннего матрикса представляют собой сердцевины розеточных структур хромомеров находит подтверждение в том, что полипептидный состав матрикса интерфазных ядер (за исключением белков ламины) и остаточных структур метафазных хромосом (осевые структуры или «скэффолд») практически одинаковы. В обоих случаях эти белки отвечают за поддержание петлевой организации ДНК.

ДНК ядерного белкового матрикса

Рассматривая особенности ДНК, входящей в состав ядерного матрикса, необходимо еще раз подчеркнуть, что эта остаточная ДНК представлена в минимальном количестве (0,1-1% от сухого веса фракции) составляет лишь менее 1% от всей ДНК ядра. Эта ДНК оказалась устойчивой к действию нуклеаз, вероятно за счет ее существования в виде прочных ДНК-белковых комплексов.

Большой интерес представляет изучение фрагментов ДНК, входящих в состав ядерного матрикса. Расчеты показали, что в ядрах существует от 60000 до 125000 участков ДНК, защищенных от действия нуклеаз и эти участки могут быть расположены на всех трех компонентах ядерного матркса.

Подробно изучена ДНК ядерного матрикса клеток асцитной карциномы Эрлиха мышей. Так были обнаружены две размерные группы фрагментов ДНК в составе ядерного матрикса. В первую группу входили высокомолекулярные фрагменты размером около 10 т.п.н., они составляли всего 0,02% от исходного количества ДНК. Их число составляло примерно 100 на гаплоидный набор хромосом, т.е. всего2-3 участка прикрепления ДНК к ядерному матриксу на хромосому. Эти фрагменты были обогащены сателлитной ДНК и были связаны с ламиной. Функциональное значение этих участков может состоять в обеспечении фиксированного положения хромосом в ядре с помощью закрепления их определенных участков (центромер, теломер) на ламине.

Вторая группа фрагментов, связанных с матриксом, состояла из небольших участков ДНК (120-140 п.н.), гетерогенных по последовательности. Они встречаются между участками ДНК длиной около 50 т.п.н., представляющих собой, вероятно петли основной массы хроматина (рис. 69). Функциональное значение второй группы этих коротких участков ДНК может заключаться в том, что они ассоциированы с белками, лежащими в сердцевинах розеткоподобных структур хроматина или в основании развернутых петель ДНК хроматина при его активации.

Сходные результаты были получены на многих объектах. Было обнаружено, что зоны (районы) связывания ДНК с матриксом (MAR – matrix attachment regions или SAR – scaffold attachment regions) содержат приблизительно 200 п.н. и располагаются друг от друга на расстоянии 5-112 т.п.н. У дрозофилы на ядро приходится по крайней мере 10 000 таких MAR (или SAR) областей.

Места расположения последовательностей SAR (MAR) очень сходны или даже идентичны с местами связывания ДНК с топоизомеразой II, которая играет основную структурную и ферментативную роль в образовании петель хроматина. Более того один из белков матрикса («скэффолда») митотических хромосом, белок Scl оказался просто топоизомеразой II. С помощью иммунофлуоресценции было показано, что на интерфазных хромосомах Scl локализуется в основании петель ДНК.

При изучении кинетики гидролиза вновь синтезированной ДНК нуклеазами было обнаружено, что ядерный матрикс связан с репликацией ДНК. Было обнаружено, что большая часть ДНК, содержащая радиоактивную метку, связана с матриксом: свыше 70% новосинтезированной ДНК было локализовано в зоне внутреннего ядерного матрикса. Это наблюдение давало основание считать, что на ядерном матриксе происходит инициация и собственно репликация ДНК. Фракция ДНК, ассоциированная с ядерным матриксом, оказалась обогащенной репликативными вилками. В составе ядерного матрикса обнаружена ДНК-полимераза a, основной фермент репликации ДНК. Кроме него с ядерным матриксом связаны и другие ферменты репликативного комплекса (реплисомы): ДНК-праймаза, ДНК-лигаза, ДНК-топоизомераза II. Высказана гипотеза о том, что репликация ДНК осуществляется таким образом, что петли ДНК как бы протягиваются через закрепленные в матриксе репликационные комплексы (рис. 70). Было обнаружено, что участки начала репликации ДНК располагаются вблизи (или совпадают с ними) участков постоянного прикрепления ДНК к ядерному матриксу.

В состав ядерного матрикса входит около 1% РНК, включающей в себя как гетерогенную высокомолекулярную РНК, так и рибосомную РНК, и РНК ядерных малых РНП. На возможность связи элементов матрикса с процессами транскрипции указывали данные о том, что при коротком мечении матрикс обогащался быстро меченной гетерогенной РНК. Было обнаружено, что в состав белков внутреннего ядерного матрикса входит РНК-полимераза II, ответственная за синтез информационных РНК. С ядерным матриксом клеток яйцеводов кур оказалась связанной большая часть (95%) новосинтезированных пре-мРНК овальбумина и пре-рРНК. Эти наблюдения привели к заключению, что ядерный матрикс может выполнять структурную роль в синтезе, процессинге и транспорте РНК в ядре.

С ядерным матриксом связаны собственно транскрибирующиеся гены. Транскрипционные комплексы закреплены на ядерном матриксе, а сама транскрипция осуществляется одновременно с перемещением матричной ДНК относительно закрепленных транскрипционных комплексов, содержащих РНК-полимеразу II. Кроме тРНК и ее предшественников в составе ядерного белкового матрикса обнаруживаются малые ядерные рибонуклеопротеиды (мя РНП), которые участвуют в созревании информационных РНК, в процессе сплайсинга (см. ниже). Эти РНК-содержащие частицы, иногда называемые сплайсосомами, собраны в группы или кластеры, связанные с белками ядерного матрикса.

Элементы ядерного матрикса могут прямо участвовать в регуляции транскрипции. Так участки MAR обычно связаны с такими регуляторными последовательностями на ДНК как энхансеры и сайленсеры, определяющими интенсивность транскрипционных процессов. На ядерном матриксе локализованы белки-рецепторы для ряда стероидных гормонов.

Относительно связи ДНК с элементами ядерного матикса на сегодня сложились представления о том, что эта связь может отражать различные функциональные особенности. Так связь ДНК с ламиной может отражать структурную, постоянную ассоциацию ДНК, а связь с внутренними элементами – функциональную, связанную как с синтезом ДНК, так и РНК,

Поведение белков ядерного матрикса во время митоза изучено еще далеко недостаточно. О судьбе ламины при митозе уже было сказано: ее компоненты разбираются, частично переходя в цитоплазму, частично (ламин В) оставаясь в связи с мембранами. Относительно компонентов внутриядерного матрикса сведений меньше: известно, что часть этих белков входит в состав матрикса («скэффолда») митотических хромосом.

Четвертый – хромонемный уровень упаковки хроматина

Исследуя структурную организацию хроматина и хромосом можно определенно говорить о нескольких уровнях компактизации ДНК. Первый – нуклеосомный, дающий 7-кратное уплотнение ДНК в составе фибрилл ДНП, второй – 30 н.м. фибрилла или нуклеомерный уровень с40--70-кратной степенью упаковки, третий – доменно-петлевой или хромомерный приводящий к 600-700-кратному уплотнению ДНК в составе этих структур. Для поддержания первых двух уровней компактизации было достаточно участие только гистоновых белков, тогда как петлевые и розетко-подобные доменные структуры уже требовали участия негистоновых белков, и перехода от спирального или соленоидного типа укладки ДНК к образованию компактных глобулярных структур, состоящих из петель хроматиновых 30-нм фибрилл, к структурам типа хромомеров, имеющих уже размеры 0,1-0,2 мкм.

Однако еще в классических работах цитологов начала ХХ века как в интерфазных ядрах, так и, особенно, в митотических хромосомах описывались нитчатые структуры – хромонемы, имеющие толщину 0,1-0,2 мкм. Их удавалось наблюдать как на фиксированных объектах, так и в живых клетках. Подробные исследования ультраструктуры митотических хромосом на разных этапах митоза с помощью электронной микроскопии полностью подтвердило наличие этого четвертого уровня компактизации хроматина (рис. 71).

При изучении ультраструктурных основ строения митотических хромсом необходимо учитывать хромонемный уровень компактизации хроматина. Хромонему – нитчатую хроматиновую структуру со средней толщиной 0,1-0,2 мкм удается проследить в естественных условиях на разных стадиях начальной конденсации хромосом в профазе митоза и при деконденсации хромосом в телофазе. Причем такие хромонемы выявляются как в клетках растений, так и животных (рис. 72, 73).

Изучение профазных хромосом как животных, так и растений показывает, что процесс конденсации хромосомного материала включает в себя промежуточный этап – образование из фибрилл ДНП нитчатых хромонемных структур, являющихся единицей последующей хромосомной структуризации.

В естественных условиях в составе метафазных хромосом хромонемные элементы на ультратонких срезах не выявляются. Но по мере деконденсации митотических хромосом в поздней анафазе и ранней телофазе снова можно видеть признаки хромонемной организации хромосом. В поздней анафазе, когда хромосомы достигают противоположных полюсов клетки, в их структуре снова выявляются хроматиновые нитчатые образования с толщиной 0,2 мкм. При этом вся структура хромосом разрыхляется, что отражает начало общей деконденсации митотических хромосом. Эта начальная стадия деконденсации связана не с разрыхлением фибрилл ДНП внутри хромонем, а с расхождением, обособлением участков хромонемы друг от друга. Особенно заметным и выраженным этот процесс становится в телофазе. В это время хромосомы начинают увеличиваться в объеме, при этом расстояние между отдельными участками хромонемы также возрастает. В расположении отдельных нитей хромонемы, так же как и в профазных хромосомах, улавливаются признаки спиральности в их укладке: часто видны кольчатые или петлистые незамкнутые участки, иногда располагающиеся параллельно друг другу. Спиральность хромонемы в составе митотических хромосом удается наблюдать в ряде случаев при частичной искусственной деконденсации выделенных митотических хромосом (рис. 74). В поздней телофазе хромосомы уже полностью окружены ядерной оболочкой. Хромонемные элементы расходятся на значительные расстояния, но все же зоны отдельных хромосом еще выявляются. В это время некоторые участки хромонем начинают разрыхляться, их толщина взрастает. Таким образом, наблюдая за состоянием структуры и расположением хромонемных участков в ядрах и хромосомах в телофазе, можно видеть картину, обратную той, что наблюдалась в профазе: разрыхление хромосом за счет первоначального расхождения участков хромонемы и последующего их разрыхления, деконденсации самих хромонем.

Ультраструктурная организация хромонемного уровня упаковки ДНП хорошо выявляется при постепенном экспериментальном разрыхлении хромосом при понижении концентрации двухвалентных катионов. Оказалось, что плотное тело митотических хромосом сначала разрыхляется так, что выявляется его хромонемная организация: на срезах видно, что хромосомы представлены сечениями толстых (0,1-0,2 мкм) хромосомных нитей, хромонем (рис. 73). Затем, при последующем снижении концентрации двухвалентных катионов, происходит как бы распад хромонемных элементов на множество линейно расположенных глобулярных блоков хроматина с диаметром около 0,1-0,2 мкм. В дальнейшем эти блоки (хромомеры) начинают деконденсироваться: на их периферии видны петли фибрилл ДНП, а в центре остается тело хромомера. Возникает розеткоподобная структура. Важно отметить, что расположение зон с розеткоподобными хромомерами совпадает с рисунком G-бэндирования хромосом. По мере дальнейшей деконденсации петли увеличиваются в длину, а центральные участки хромомеров прогрессивно уменьшаются. При полной деконденсации все тело хромосомы представлено на срезах равномерно расположенным фибриллами ДНП.

Надо отметить, что в современных молекулярно биологических исследованиях строения хромосом хромонемный уровень, как один из высших уровней упаковки ДНП, совершенно выпадает из поля зрения исследователей. Лишь в последнее время некоторые исследователи на основании косвенных данных приходят к выводам о наличии в интерфазных ядрах хромонемо-подобных структур.

Глава 7. Общая организация митотических хромосом

Интенсивное изучение ультраструктуры хромосом началось в середине 50-х гг., что было связано с внедрением в цитологию метода электронной микроскопии. Однако вклад электронной микрскопии в изучение структуры интерфазных и митотических хромосом оказался неизмеримо ниже того, что дал этот метод для изучения структуры цитоплазмы. Наши представления о структурной организации даже элементарных компонентов ядра и о структуре хромосом очень скудны и противоречивы. Разрыв между успехами в биохимическом изучении процессов биосинтеза ДНК и РНК, с одной стороны, и чрезвычайно медленным прогрессом в исследовании тонкой организации клеточного ядра – с другой, объясняется многими причинами. Одна из основных причин та, что современные методы не позволяют изучать ядро и хромосомы в целостной совокупности составляющих их элементов. Хромосома оказалась слишком мала для детального анализа с помощью светового микроскопа и слишком велика и плотна для изучения в электронном микроскопе. На выделенных хромосомах в электронном микроскопе не удается выявить все детали из-за наложений проекций разных уровней и можно наблюдать лишь характер формы или же тонкую структуру в ограниченных участках. Исследование ультратонких срезов хромосом ограничивается характеристикой отдельны элементов без возможности получить объемное представление о всей структуре. Это происходит из-за того, чтобы в данном случае мы можем исследовать лишь плоские сечения, составляющие только 0,05-0,025 часть общего объема ядра. Так как для ядра и хромосом характерно преобладание тонких и длинных спутанных фибриллярных структур, которые на ультратонких срезах будут иметь вид беспорядочно разбросанных коротких отрезков, то по таким сечениям воссоздать трехмерную картину взаимосвязи этих элементов друг с другом практически невозможно.

При изучении ультраструктуры хромосом исследователи сталкиваются с парадоксальной ситуацией: чем ближе подходим к высшим структурным уровням организации хромосом, тем меньшей по объему и более низкой по надежности становится информация об этой важнейшей клеточной структуре (рис. 75).

Действительно, получена полная информация о генетическом коде человека, хорошо изучен нуклеосомный уровень компактизации ДНК, определен общий петлевой доменный характер дальнейшей укладки ДНК, подтверждаются представления о хромонемном уровне, но все же, на сегодня мы до конца не знаем как построена митотическая хромосома (рис. 76).

Трудности изучения хромосом связаны кроме всего прочего, что это очень лабильная структура, легко меняющая свою морфологию в зависимости от условий эксперимента.

Так обращает на себя внимание свойство митотических хромосом обратимо изменять свой объем при изменении ионного окружения. Как уже указывалось, применение гипотонических растворов приводит к набуханию хромосом, но при возвращении их в изотонические условия, они вновь приобретают исходную морфологию. Из этого следует, что существует какой-то механизм, стабилизирующий общую организацию хромосомы. В хромосоме существует какой-то структурный порядок, алгоритм взаимодействия компонентов, который инвариантно приводит интерфазную развернутую, деконденсированную хромосому в состояние плотного тела (митотическая хромосома), не меняющего ни своей толщины, ни длины, ни особенностей структуры в бесчисленном ряду клеточных поколений.

Как уже говорилось, для изучения ультраструктуры хромосом широко применяется метод получения целых выделенных митотических хромосом. На таких препаратах видно, что в состав хромосом входят 25-30 нм элементарные фибриллы. Однако уловить характер их укладки, какой-либо порядок в их расположении не удается. Хромосомы в этом случае имеют вид тел, состоящих как бы из перепутанных изгибающихся фибрилл, или, по образному выражению одного из цитологов, напоминают результат аварии на макаронной фабрике.

На препаратах таких выделенных и распластанных хромосом нет реальной возможности выяснить, из какого числа нитей состоит хромосома, тем более проследить путь и порядок укладки одной нити от начала до конца, если бы она была основой хромосомы. Более того, процесс выделения хромосом приводит к изменению их структуры. Легко видеть в световом микроскопе, что перенос живых делящихся клеток в гипотонические растворы приводит к резкому набуханию их хромосом. Хромосомы при этом плохо различимы, они увеличиваются в объеме, становятся менее оптически плотными. В целом митотические хромосомы в этих условиях ведут себя так же, как препараты выделенного хроматина, - набухают, переходят в менее конденсированное состояние. Такое воздействие на них гипотонической среды приводит к потере субструктуризации хромосомы.

Однако на то, что такая субструктуризация существует, говорит масса фактов не только электронномикроскопических, но и полученных с помощью светового микроскопа. Вся совокупность морфологических и биохимических данных должна быть учтена при воссоздании трехмерной организации митотических хромосом.

В 70-х годах удалось уловить общий принцип структурной организации митотической хромосомы.

Было обнаружено, что хромосомы не теряют своей морфологической целостности, не распадаются даже при резком набухании, вызванном удалением всех гистонов. Это достигается обработкой выделенных хромосом растворами полианионов, декстрансульфата и гепарина. В этом случае хромосомы настолько деконденсируются, что перестают быть видны в фазово-контрастном микроскопе. При добавлении же флуорохрома, связывающегося с ДНК (этидиум бромид), было видно, что сильно набухшие хромосомы не разваливались, а значительно (до 4 раз) увеличивались в длину и ширину. Такие сильно набухшие, лишенные гистонов хромосомы помещали на подложку и рассматривали в электронный микроскоп.

Оказалось, что набухшие хромосомы состоят из двух компонентов: из рыхлой сети плотных фибрилл в центральных участках (хромосомный остов – скэффолд), повторяющих контуры метафазных хромосом (осевые компоненты), и из многочисленных длинных тонких петель, отходящих от них в поперечном направлении (рис. 77). Была показана белковая природа осевых компонентов и ДНК в составе петель. Средний размер боковых петель составлял около 30 мкм. Если такие препараты обработать ДНКазой, то можно получить белковые остовы и анализировать их состав. Оказалось, что в них присутствует около 20 белков негистоновой природы, сходных с белками ядерного матрикса. Исходя из этого, была предложена модель структурной организации митотических хромосом. В ее основе лежит принцип поперечного расположения петель ДНК вдоль белковой осевой структуры. В принцип этот тип организации митотической хромосомы очень напоминает хромосомы типа «ламповых щеток», встречающихся в процессе мейоза.

Петлевое расположение ДНК вдоль хромосомы получило в дальнейшем целый ряд подтверждений. Однако при разных способах депротеинизации кроме петель в периферии набухших хромосом можно было выявить и розеткоподобные структуры, состоящие из ДНК.

В последнее время получены данные, говорящие о том, что осевые структуры могут представлять собой артефакт, получившийся в результате монтажа и высушивания дегистонизированных хромосом на подложке. На самом же деле в теле хромосомы существуют негистоновые белковые связки (скрепки), сшивающие основания боковых петель ДНК, но эти связки разбросанные рыхло по объему хромосомы (рис. 78). Как бы то ни было, принцип петлевой поперечной укладки ДНК в теле хромосомы очень важен для понимания ее общей ультраструктурной организации.

Необходимо подчеркнуть, что на поперечных и продольных сечениях митотических хромосом, фиксированных в нативном состоянии внутри клеток никаких центральных или осевых элементов не обнаружено. Они выявляются только после удаления из выделенных хромосом всего набора гистонов, чему предшествует изоляция хромосом в гипотонической среде.

На основании этих наблюдений широкое распространение нашла христоматийная схема, объясняющая общую структуру митотической хромосомы (рис. 79). По этой схеме первым уровнем компактизации ДНК является нуклеосомная фибрилла, толщиной 10 нм, где вокруг одной нуклеосомы, оборачивается 146 п.н. ДНК с коэффициентом компактности равным 6-7 (к.к. 6-7); второй уровень – 30 нм фибрилла-соленоид (к.к. 40); третий уровень – петлевой домен, 60 т.п.н. на петле в 0,2-0,3 мкм (к.к. 680). Далее отрезок примерно с 18-20 петлевыми доменами образуют вокруг осевого элемента хромосомы один виток диаметром 0,7-0,8 мкм (толщина хроматиды) с коэффициентом компактизации 12 х 10⁴. Такой виток из петлевых доменов может представлять собой минимального размера бэнд, а набор из нескольких витков – средний бэнд.

По другим представлениям можно предположить, что петле ДНК, выявляемой на хромосомах, лишенных гистонов, соответствует хромомер, промежуточным этапом деконденсации которого является розеткоподобная структура ДНП.

Важно отметить, что хромомерные участки ДНП встречаются и в интерфазных ядрах (там они называются хромоцентрами). Оказалось, что порядок их деконденсации такой же, что и в митотической хромосоме: из хромоцентров возникают розеткоподобные структуры с петлями ДНП по их периферии.

Итак, можно несколько иначе оценить некоторые этапы компактизации ДНК, которые приводят в конце концов к построению плотного тела митотической хромосомы (рис. 80).

Первый уровень – нуклеосомный – образует сверхскручивание ДНК по поверхности гистоновой сердцевины. Второй – нуклеомерный (сверхбусина), где идет объединение 8-10 нуклеосом в виде глобулы. Так как все эти уровни компактизации происходят на огромных линейных молекулах ДНК, то ряд сближенных нуклеомеров и образует 20-30-нанометровую фибриллу ДНП. Третий уровень – хромомерный:: петли фибрилл ДНП, объединенные скрепками из негистоновых белков, образуют компактные тела, которые при искусственной деконденсации дадут розетковидные структуры. Расположение петлевых доменов, хромомеров, может быть неравномерным; участки тела митотической хромосомы, обогащенные ими, могут соответствовать «бэндам» или сегментам при дифференциальной окраске хромосом. Четвертый уровень – хромонемный: сближенные в линейном порядке хромомеры образуют толстые (0,1-0,2 мкм) хромосомные нитчатые структуры, которые можно уже наблюдать и в световом микроскопе. Характер упаковки этой нити в теле хроматиды еще недостаточно выяснен; возможна спиральная укладка хромонемы, но не исключено образование ею и еще одного уровня петлистых структур.

Конечно, такая общая схема организации митотических хромосом очень неполно отражает особенности строения их специализированных участков таких как ядрышковый организатор, теломеры и центромеры.