Символы, используемые для составления родословной схемы

Близнецовый метод

Это метод изучения генетических закономерностей на близнецах. Впервые он был предложен Ф. Гальтоном в 1875 г. Близнецовый метод дает возможность опре­делить вклад генетических (наследственных) и средовых факторов в развитии кон­кретных признаков или заболеваний у человека. При использовании близнецового метода проводится сравнение: монозиготных (однояйцевых) близнецов с дизигот-ными: партнеров в монозиготных парах между собой, данных анализа близнецо­вой выборки с общей популяцией.

Монозиготные близнецы (МБ) образуются из одной зиготы, разделившейся на стадии дробления на две (или более) часта. С генетической точки зрения они иден­тичны, т.е. обладают одинаковыми генотипами Монозиготные близнецы всегда одного пола. Дизиготные близнецы (ДБ) развиваются в случае, если образуются одновременно две яйцеклетки, оплодотворенные двумя сперматозоидами. Они сход­ны между собой не более, чем родные сибсы. т.е имеют около 50 % идентичных генов. Общая частота рождения близнецов составляет примерно 1 %. Факторы, влияющие на частот} рождения близнецов, в настоящее время мало измены. Есть данные, показывающие, что вероятность рождения дизиготных близнецов повы­шается с увеличением возраста матери, а также порядкового номера рождения.

Близнецовый метод включает в себя диагностику зиготности близнецов, сопо­ставление групп монозиготных и дизиготных близнецов по изучаемому признаку. Если какой-либо признак встречается у обоих близнецов одной пары, то она назы­вается конкордантной. если же у одного из них. то пара близнецов называется дис-кордантной (конкордантность - степень сходства, дискордантность - степень раз­личия). Сравнение парной конкордантности у моно- и дизиготных близнецов дает ответ о соотносительной роли наследственности и среды в развитии того или ино­го признака или болезни. При этом исходят из предположения, что степень конкор­дантности достоверно выше у монозиготны.х. чем у дизиготных близнецов, если наследственные факторы имеют доминирующую роль в развитии признака. Если значение коэффициента конкордантности примерно близко у монозиготных и ди­зиготных близнецов, то считают, что развитие признака определяется, главным образом, негенетическими факторами, т.е. условиями среды.

Для количественной оценки роли наследственности и среды в развитии того или иного признака используют различные формулы. Чаще всего пользуются коэф­фициентом наследуемости, который вычисляется по формулам:

Н = КМБ - КДВ': 100 - КДБ (в процентах):

Н = КМБ - КДБ : 1 - КДБ (в долях единицы),

где Н - коэффициент наследуемости. К - коэффициент парной конкордантнос­ти в группе монозиготных или дизиготных близнецов.

В зависимости от значения Н судят о влиянии генетических и средовых факто­ров на развитие признака. Например, если значение Н близко к нулю, считают, что развитие признака обусловлено только факторами внешней среды. При значении Н от 1 до 0.7 - наследственные факторы имеют доминирующее значение в разви­тии признака или болезни; среднее значение Н от 0.4 до 0.7 свидетельствует о том.

что признак развивается под действием факторов внешней среды при наличии гене­тической предрасположенности. С помощью близнецового метода выявлено значе­ние генотипа и среды в патогенезе многих инфекционных болезней. Исследования, проводимые на близнецах, помогают ответить на такие вопросы, как влияние наследственных и средовых факторов на продолжительность жизни, развитие ода­ренности, чувствительность к лекарственным препаратам и др. Популяционно-статистнческий метод

Популяционно-статистический метод применяется для определения частоты генотипов или отдельных генов в популяции, т. е. для изучения генетической струк­туры популяции. Знание структуры той или иной популяции важно с различных точек зрения: с точки зрения различных разделов генетики, для социальной гигие­ны, для планирования профилактических мероприятий и т. п. В основе популяци-онной генетики лежит концепция частоты гена. т. е. частоты, с которой в популя­ции в конкретном локусе встречается данный аллель На основании популяцион-но- статистического метода можно рассчитать соотношение ра зличных генотипов в популяции, распространение наследственных болезней, соотношение гомозигот и гетерозигот по тому или иному патологическому гену и др.

Под термином «популяции» подразумевается совокупность особей одного вида, длительно занимающих определенное пространство и воспроизводящих себя в тече­ние большого числа поколений. В человеческой популяции это может быть населе­ние всей страны, отдельной области, района, села. Поэтому популяции могут быть большие и малые.

Обычно популяции формируются путем свободного скрещивания, но может быть искусственный отбор по тем или иным соображениям

Изучение генетического состава популяции производится путем определения частоты тех или иных генотипов, а также частоты отдельных аллелей Под часто­той данного гена в популяции понимается соотношение числа определенных алле­лей ко всем генам, выступающим в данном локусе. Например, исследовалась по­пуляция в 200 человек. Среди них выявлено 2 больных рецессивным заболеванием и 36 гетерозиготных носителей. Надо определить частот} патологического гена. Расчет производится так. В двух хромосомах находится 2 локуса (сайта) для опре­деленного гена, тогда двое больных рецессивным заболеванием несут 2x2=4 пато­логических гена. 36 гетерозиготных носителей несут по одному патологическому гену 1x36=36. Итого 4+36=40 патологических генов. Всего же в популяции из 200 человек, имеющих по две гомологичных хромосомы, находится 2x200=400 сай­тов. Отсюда частота гена, определяющего болезнь в указанной популяции. 40/400 = 0.1. Частоту отдельного генотипа можно выразить в процентах от общего коли­чества особей популяции, которое принимается за 100 %. В популяционной гене­тике обычно общее число особей принимается за единицу: а частота того или ино­го генотипа выражается в долях единицы.

В основе метода лежит закономерность, установленная 1908 г. английским математиком Дж. Харди и немецким врачом В. Вайнбергом для идеальной популя­ции. Обнаруженная ими закономерность получила название чакона Харди-Вайи- берга. Для идеальной популяции характерны следующие особенности: большая численность популяции, свободное скрещивание (панмиксия) организмов, отсут­ствие отбора и мутационного процесса, отсутствие миграций в популяцию и из нее. В идеальной популяции соотношение частоты доминантных гомозигот (АА). гетерезигот (Аа) и рецессивных гомозигот (аа) сохраняется постоянным из поколе­ния в поколение, если никакие эволюционные факторы не нарушают это равнове­сие, этом основной смысл закона Харди-Вайнберга.

Соотношение численности разных генотипов и фенотипов в панмикгической популяции определяется по формуле бинома Ньютона:

. где р - частота доминантного аллеляа; ^^{^}-частота рецессивного аллеля а: р² - частота генотипа АА (гомозигот по доминантному ал-лелю): я^: - частота генотипа аа (гомозиготы по рецессивному аллелю).

Цитогенетимескийметод

Основа метода - микроскопическое изучение хромосом человека. Цитогенети-ческие исследования стали широко использоваться с начала 20-х годов XX в. для изучения морфологии и подсчета хромосом человека, культивирования лейкоци­тов для получения метафазных пластинок. Первое главное условие цитогенети-ческой диагностики - наличие делящихся клеток в цитологическом препарате. В зависимости от степени пролиферативной активности клеток разных тканей т '{-о и т упго различают прямые и непрямые методы получения препаратов хромосом.

1. Прямые методы используются при исследовании тканей, обладающих высокой митотической активностью (костный мозг, хорион и плацента, клетки лимфатических узлов, ткани эмбриона на ранней стадии развития). Препараты хромосом готовятся непосредственно из свежеполученного материала после спе­циальной обработки

2. Непрямые методы включают получение препаратов хромосом из любой ткани после ее предварительного культивирования в течение различного периода времени.

Существуют множество модификаций прямого и непрямого методов приготов­ления хромосомных препаратов, однако основные этапы получения метафазных пластинок остаются неизменными:

применение в качестве митогена (стимулятора клеточного деления) выде­ленного из семян фасоли мукополисахарида фитогемагглютинина (ФГА):

- использование колхицина (колцемида) - ингибитора образования митоти-ческого веретена, который останавливает деление клеток на стадии метафазы:

гипотонический шок. с использованием растворов солей калия или натрия, которые вследствие разницы осмотического давления внутри и снаружи клеток вызывают их набухание и разрыв межхромосомных связей: такая процедура при­водит к отделению хромосом друг от друга, способствуя более сильному их раз­бросу в метафазных пластинках:

- фиксация клеток с использованием ледяной уксусной кислоты и этанола (метанола) в соотношении 3:1 (фиксатор Карнуа). что способствует сохранению структуры хромосом; раскапывание суспензии клеток на предметные стекла:

- окрашивание хромосомных препаратов.

В зависимости от стадии клеточного цикла, в которой находится исследуемая клеточная популяция возможно проведение следующих цитогенетических иссле­дований:

- анализ отдельных хромосом и их участков и интерфазных ядрах (половой хроматин в ядрах буккального эпителия, оценка анеуплоидии. а также наличия или отсутствия относительно протяженных участков ДНК в интерфазных ядрах любой ткани методом Р15Н - анализа).

- прометафазных хромосом (высокий уровень разрешения);

- стадий анафазы-телофазы (для регистрации специфического воздействия различных мутагешшх воздействий).

Молекулярно-цитогенетические методы

Благодяря успехам в молекулярной генетике человека разработан принципи­ально новый метод изучения хромосом -метод флюоресцентной гибридизации т хИи - Р18Н- анализ, проводится на цитологических препаратах с метафазными хро­мосомами или интерфазными ядрами (« интерфазная цитогенетика»). Для этого пригодны любые клетки организма, но наиболее часто используются лимфоциты периферической крови, клетки буккального эпителия, фибробласты кожи, клетки ворсин хориона и амниотической жидкости. Принцип этого метода состоит в сле­дующем.

1. Для изучаемой хромосомы или конкретного ее участка, исходя из специ­фичности последовательности оснований ДНК. готовят однонитевой участок ДНК. к которому' присоединяется биотин или дигогксигенин. Такой «помеченный» уча­сток ДНК называется зондом.

2. На микроскопическом препарате т «пи при щелочной обработке хромо­сомное ДНК денатурируется, т.е. разрываются связи между двумя нитями ДНК.

3. Зондом обрабатывают препарат. Поскольку⁷ последовательность основа­ний ДНК - зонда и соответствующий участок хромосомы взаимно комплементар­ны, то зонд присоединяется к хромосоме. В этом участке происходит ренатурация ДНК (гибридизация с ДНК-зондом).

4. После этого препарат обрабатывают веществом, которое благодаря своей структуре способно избирательно присоединится к биотину или к дигоксигенину. Для биотина таким веществом является стрептовидин. для дигоксигенина - анти-дигоксигениновое антитело. К этим веществам могут быть присоединены в один или два этапа флюоресцентные красители.

5. С помощью люминесцентного микроскопа окрашенные хромосомы визу-ализируются на фоне неокрашенных. Области применения Р18Н - метода:

- анализ числовых аномалий хромосом;

- исследование структурных хромосомных нарушений разных типов - транс -локаций. инсерций. микроделеций и микродупликаций. идентефикация дополни­тельных маркерных хромосом.

- уточнение происхождения сложных комплексных структурных перестроек хромосом;

- физическое картирование генов.